黃鱔I型hepcidin抗菌肽基因的誘導(dǎo)表達(dá)分析

李 偉，孫文秀 (長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,湖北 荊州 434025)

黃鱔I型hepcidin抗菌肽基因的誘導(dǎo)表達(dá)分析

李 偉，孫文秀 (長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,湖北 荊州 434025)

采用RT-PCR的方法對健康黃鱔(Monopterusalbus)不同組織 I 型抗菌肽hepcidin基因的表達(dá)情況及受脂多糖(LPS)注射、嗜水氣單胞菌感染后該基因的表達(dá)情況進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：在正常黃鱔各組織中，該基因在肝臟中表達(dá)量最高，其次是腎臟，在心臟、皮膚、腦、血液、小腸、脾臟和胃中的表達(dá)量較低，而在肌肉中沒有檢測到該基因的轉(zhuǎn)錄本；LPS注射24 h后，各組織里的hepcidin基因表達(dá)量都有明顯升高；當(dāng)受到病原菌感染后，在所檢測的肝臟、腎臟、皮膚、腦、心臟和脾臟等6個(gè)組織中該基因的轉(zhuǎn)錄本都在感染后24 h后急劇上升。這些結(jié)果表明黃鱔的I型抗菌肽hepcidin基因可能在黃鱔抵抗外界病原物侵染過程中起著重要作用。

黃鱔(Monopterusalbus); 抗菌肽hepcidin基因; RT-PCR; 誘導(dǎo)表達(dá)分析

抗菌肽(antimicrobial peptides,AMPs)分布十分廣泛，是生物體天然免疫系統(tǒng)的重要成員，對真菌、大多數(shù)革蘭氏陰性或陽性菌、原生動(dòng)物均有抑制作用，有些抗菌肽還具有抗寄生蟲、病毒和腫瘤的作用[1]。富含半胱氨酸的抗菌肽是抗菌肽大家族中重要的成員，最早發(fā)現(xiàn)于昆蟲脂肪體和甲殼動(dòng)物的血淋巴中?？咕氖歉缓腚装彼峥咕募易宓某蓡T，是由hepcidin基因編碼產(chǎn)生的，機(jī)體在細(xì)菌、真菌、病原體等致炎物質(zhì)作用下以及在貧血、缺氧、鐵代謝紊亂等狀態(tài)下均能影響其表達(dá)水平，是機(jī)體天然免疫的重要效應(yīng)因子[2]。近年來的研究還表明hepcidin基因在鐵轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控方面有十分重要的作用，當(dāng)機(jī)體缺鐵時(shí)，hepcidin基因表達(dá)水平下降，鐵負(fù)荷過重時(shí)hepcidin基因表達(dá)水平升高，對腸道鐵吸收起負(fù)調(diào)控作用[3]。迄今為止，越來越多的hepcidin基因被從人、鼠及其他高等脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)。hepcidin基因主要表達(dá)于肝臟組織，后來的研究發(fā)現(xiàn)hepcidin在腎臟等多個(gè)免疫相關(guān)組織中也有表達(dá)的報(bào)道，可能與小鼠[4]、 大西洋鮭[5]、 金眼石鮨[6]、 牙鲆[7]的天然免疫系統(tǒng)有重要關(guān)系。序列分析結(jié)果表明，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的hepcidin基因主要有I、II、III型，每種hepcidin分子都有不同的表達(dá)動(dòng)態(tài)[5]。當(dāng)受到外界病原物感染或注射脂多糖(LPS)后，抗菌肽基因的表達(dá)量成倍增加[6,8]。同時(shí)，采用化學(xué)合成的方法對hepcidin小肽的活性進(jìn)行的鑒定發(fā)現(xiàn)，它具有非常廣的抗菌活性，能夠在一定程度上抑制細(xì)菌和酵母的生長[8]，這些結(jié)果表明hepcidin可能在魚體抵抗外源病原物侵染過程中起著重要作用。目前，尚無黃鱔hepcidin基因研究的報(bào)道。筆者報(bào)道了黃鱔I型抗菌肽hepcidin在健康組織和注射LPS后、及病原菌感染后的表達(dá)情況，以期為黃鱔養(yǎng)殖和了解其機(jī)體的免疫機(jī)制積累一些資料。

1 材料與方法

1.1 材料

Taq DNA polymerase、DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶購買于大連寶生物技術(shù)有限公司。脂多糖為Sigma公司產(chǎn)品。病原菌菌株(Aeromonashydrophila)由作者保存。其他生化試劑為分析純，國內(nèi)試劑公司生產(chǎn)。受試黃鱔購于湖北省荊州市老南門水產(chǎn)品市場，健康無病，體質(zhì)量75～110 g。

1.2 方法

(1)受試黃鱔的處理與分組 隨機(jī)將黃鱔分組(每組至少3條)，采用腹腔注射的方法，一組注射100 μL LPS(10 μg/mL)，對照組注射100 μL NaCl (0.9%)。注射24 h后，取各組織凍存于-80 ℃用于總RNA的提取。病原菌感染采用腹腔注射的方法，一組注射100 μL 病原細(xì)菌(Aeromonashydrophila)，病原菌濃度為2.6×106cfu/mL。對照組則注射100 μL NaCl (0.9%)。分別在注射后0、24、48、72 h取各組織凍存于-80 ℃用于總RNA的提取。

(2)總RNA的提取 將黃鱔各組織取出后迅速凍存于液氮中，各組織總RNA的提取采用Trizol (Invitrogen)一步法提取，方法按照說明書進(jìn)行。分別取2 μg的肝臟、腎臟、小腸、心臟、皮膚、腦、血液、脾臟、胃和肌肉的總RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。cDNA 合成采用 M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶 (TaKaRa )進(jìn)行。合成的 cDNA 凍存于-20 ℃ 下備用。

(3)引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增 利用 M-MLV Reverse Transcriptas(TaKaRa)按照文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行cDNA 合成。根據(jù)作者自行克隆的黃鱔抗菌肽hepcidin基因序列(GenBank序列號FJ594996)設(shè)計(jì)了1對特異性引物 hepN1(5’-ctcgcctttatctgcattctgg-3’) 和 hepC1(5’-cgcagcccttgtagttct-3’) 來擴(kuò)增健康黃鱔各組織中和LPS注射及病原菌感染后各組織中的hepcidin基因。PCR反應(yīng) 25 μL 體系為:2 μL 的模板，1 μL的10 μmol/L 的引物，0.2 μL 的 25 mmol/L 的 dNTP 混合物，1 U的 Taq DNA 聚合酶。PCR反應(yīng)條件如下:94 ℃預(yù)變性4 min,94 ℃30 s,53 ℃30 s,72 ℃ 30 s,共進(jìn)行 35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸 10 min。 β-actin 作為 PCR的內(nèi)參。設(shè)計(jì)的1對β-actin 的特異性引物為 actinN1(5’-ggctactcct tcaccaccacag -3’ )和 actinC1 ( 5’-gtctcatggattccgcaggtca-3’ )。取等體積的hepcidin和actin擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 1.5%的瓊脂糖電泳檢測。利用Gel-Pro Analyzer進(jìn)行圖象分析，用SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃鱔I型抗菌肽hepcidin基因在不同健康組織內(nèi)的表達(dá)分析

B：腦；M：肌肉；H：心臟；S：皮膚；BC：血細(xì)胞；K：腎臟；L：肝臟；SP：脾臟；ST：胃；I：腸圖1 黃鱔hepcidin基因表達(dá)的組織特異性分析Figure 1 Tissue-specific expression analysis of rice field eel hepcidin

用RT-PCR的方法對健康黃鱔10個(gè)組織I型hepcidin基因表達(dá)的情況進(jìn)行了分析，結(jié)果表明：在所檢測的10個(gè)組織中，都有hepcidin基因轉(zhuǎn)錄本的存在，該基因在肝臟中表達(dá)量最高，其次是腎臟，在心臟、皮膚、腦、血液、小腸、脾臟和胃中的表達(dá)量較低，而在肌肉中沒有檢測到該基因的轉(zhuǎn)錄本(圖1)。

2.2 注射脂多糖LPS對各組織I型抗菌肽hepcidin基因表達(dá)的影響

H/A表示hepcidin表達(dá)量相對于actin基因的表達(dá)量B：腦；M：肌肉；H：心臟；S：皮膚；BC：血細(xì)胞；K：腎臟；L：肝臟；SP：脾臟；ST：胃；I：腸圖2 LPS注射對hepcidin基因表達(dá)的影響Figure 2 Expression analysis of hepcidin after LPS injection

如圖2所示，當(dāng)注射了100 μL的脂多糖24 h以后，黃鱔各組織里I型抗菌肽hepcidin基因的表達(dá)都有了比較明顯的升高，尤其是肌肉、腦和血液中增加幅度較高；而肝臟、腎臟和腸的表達(dá)量雖有增加但幅度卻不大。

2.3 病原菌感染對各組織組織I型抗菌肽hepcidin基因表達(dá)的影響

圖3 RT-PCR 分析病原菌感染對抗菌肽hepcidin的誘導(dǎo)表達(dá)Figure 3 Expression analysis of hepcidin from various tissues infected by A.hydrophila

當(dāng)黃鱔注射了病原細(xì)菌以后，通過RT-PCR的方法對感染后0、24、48、72 h的腦、肝臟、心臟、皮膚、腎臟和脾臟里I型抗菌肽hepcidin的表達(dá)進(jìn)行了分析，結(jié)果表明：病原菌的感染使得各組織里hepcidin轉(zhuǎn)錄本大量增加。從感染后24 h，檢測到的6個(gè)組織該基因的轉(zhuǎn)錄本既有明顯增加；腦、心臟和皮膚的表達(dá)量在感染后48 h增加劇烈，而肝臟和腎臟的變化則沒有腦和皮膚中明顯(圖3)。

3 討論

Douglas 等[5]報(bào)道了hepcidin-like (TypeⅠ,TypeⅡ,TypeⅢ)在美洲擬鰈(Limandnamericanus)不同組織中的表達(dá)情況，證明TypeⅠ在肝臟中有大量表達(dá)，在胃中表達(dá)量則很少，且任何組織中都檢測不到TypeⅡ的表達(dá)；TypeⅢ在食道、胃、肝臟中都有一定的表達(dá)。Krause 等[10]也報(bào)道hepcidin基因在人的肝臟、心臟與腦中有大量表達(dá)。Pigeon 等[4]報(bào)道hepcidin基因在老鼠肝臟中被檢測到大量表達(dá)，而在胃、小腸、肺、心臟、胸腺中只有微弱的表達(dá)；用人的hepcidincDNA作為引物分析人的組織和細(xì)胞系中hepcidin的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在成人和嬰兒的肝臟中hepcidin基因有大量表達(dá)，而在成人心臟、嬰兒心臟以及脊髓中表達(dá)量很少。Chen 等[11]報(bào)道hepcidin在真鯛(Chrysophrysmajor)頭腎、腎臟、小腸、肝臟、鰓和胃中有很高的表達(dá)量，在性腺、心臟、脾臟中也有大量的表達(dá)，在腦、肌肉、皮膚中表達(dá)量較少，在血細(xì)胞中檢測不到它的表達(dá)。本研究通過RT-PCR檢測了健康黃鱔10個(gè)組織hepcidin基因的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，黃鱔I型抗菌肽hepcidin基因在肝臟中表達(dá)量最高，在心臟、皮膚、腦、血液、小腸、脾臟和胃中的表達(dá)量較低，而在肌肉中沒有檢測到該基因的轉(zhuǎn)錄本，這個(gè)結(jié)果同大菱鲆(Scophthalmusmaximus)[9]、許氏平鮋(Sebastesschlegelii)[12]等的報(bào)道相似。同多數(shù)已知的I型抗菌肽hepcidin一樣，黃鱔的抗菌肽hepcidin在血液中也只是微量的表達(dá)。

Chen等[11]用大腸桿菌(E.coliDH5α)感染真鯛24 h后，脾臟、鰓、肝臟、和小腸中hepcidin的表達(dá)量都顯著增高。Shike等[6]的研究發(fā)現(xiàn)病原菌Steptococcusniae感染金眼石鮨，肝臟中的表達(dá)量升高了數(shù)千倍，而在其他組織中則有一定程度的誘導(dǎo)作用。也有研究發(fā)現(xiàn)，病原菌Aeromonassalmonnicida感染也可以引起金眼石鮨肝臟內(nèi)hepcidin基因劇烈增加[8]。大菱鲆在受到病原細(xì)菌鰻弧菌Listonellaanguillarum感染后，肝臟和脾臟里hepcidin基因表達(dá)量顯著升高；而感染的大菱鲆胚胎細(xì)胞系的結(jié)果也表明細(xì)菌的感染具有明顯的誘導(dǎo)作用[9]。對豬注射LPS以后，肝臟中的hepcidin基因在注射后6 h就可以顯著地增加[13]。羅非魚(Oreochromismossambicus)當(dāng)注射入10 μg/μL脂多糖LPS后，I 型抗菌肽hepcidin的表達(dá)量要遠(yuǎn)比其他2種類型升高得多[14]。對斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)的研究發(fā)現(xiàn)，人工感染病原細(xì)菌Edwardsiellaictaluri可以顯著地影響hepcidin基因在肝臟里的表達(dá)量，感染4 h后肝臟中hepcidin基因的表達(dá)量上升4倍，而當(dāng)感染后48 h后，表達(dá)量則增加到22倍[15]。本研究也發(fā)現(xiàn)，用LPS感染黃鱔24 h后，各組織里hepcidin基因的表達(dá)量都有不同程度的變化。尤其是肌肉、腦和血液中增加幅度較高；而在肝臟、腎臟和腸中的表達(dá)量雖有增加但幅度卻不大。同樣的，給黃鱔注射重要的嗜水汽單胞菌也表現(xiàn)出對hepcidin基因明顯的誘導(dǎo)作用。病原菌的感染使得各組織里hepcidin轉(zhuǎn)錄本大量增加。從感染后24 h，檢測到的6個(gè)組織該基因的轉(zhuǎn)錄本即明顯增加；腦、心臟和皮膚的表達(dá)量在感染后48 h增加劇烈。這些結(jié)果表明，黃鱔的hepcidin基因可能在其抵抗外界病原物感染過程中起著重要的作用。當(dāng)然對于黃鱔抗菌肽hepcidin基因在離子代謝過程中的作用需要進(jìn)一步深入研究，對其采用脂多糖和病原菌誘導(dǎo)表達(dá)為進(jìn)一步了解其功能積累了基礎(chǔ)資料。

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Q786

A

1673-1409(2009)02-S052-04

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2009.02.015

2009-03-02

李 偉(1976-)，男，山東鄒城人，理學(xué)博士，講師，研究方向?yàn)轸~類分子育種.