化妝品中糞大腸菌群檢驗(yàn)技術(shù)原理及要點(diǎn)分析

何慧貞

摘要：糞大腸菌群這一組群細(xì)菌中大腸，埃希氏菌(Ecoli)數(shù)量最多，是較理想的指示菌，但欲正確鑒定此細(xì)菌，手續(xù)較繁復(fù)，因此在化妝品檢驗(yàn)中采用糞大腸菌群列為重要的衛(wèi)生指標(biāo)菌1。檢驗(yàn)人員對這項(xiàng)目的檢驗(yàn)技術(shù)要求細(xì)節(jié)存在著的這樣那樣的問題，直接影響了檢驗(yàn)結(jié)果報告，本人就一些技術(shù)上的問題進(jìn)行了初步的分析。

關(guān)鍵詞：化妝品；糞大腸菌群；檢驗(yàn)原理；要點(diǎn)分析

中華人民共和國衛(wèi)生部在1987—7—1就頒布實(shí)施了在化妝品中必須要檢測糞大腸菌群，但許多檢驗(yàn)人員對這項(xiàng)目的檢驗(yàn)技術(shù)要求細(xì)節(jié)存在著的這樣那樣的問題，直接影響了檢驗(yàn)結(jié)果報告，所以本人結(jié)合在培訓(xùn)過程中學(xué)員遇到的一些技術(shù)細(xì)節(jié)問題進(jìn)行了初步的分析，提出了一些建議望各位老師指教。

糞大腸菌群為總大腸菌群的一個亞種；糞大腸菌群細(xì)菌來源于人和溫血動物的糞便。檢出糞大腸菌群表明該化妝品已被糞便污染，有可能存在其他腸道致病菌或寄生蟲等病原體的危險?？紤]到總大腸菌群中的細(xì)菌除生活在腸道中外，在自然環(huán)境(水與土壤)中亦經(jīng)常存在。在糞大腸菌群這一組群細(xì)菌中大腸埃希氏菌(E.coli)數(shù)量最多，是較理想的指示菌，但欲正確鑒定此細(xì)菌，手續(xù)較繁復(fù)，因此在化妝品檢驗(yàn)中采用糞大腸菌群列為重要的衛(wèi)生指標(biāo)菌。

大家先來看看簡單的操作步驟：

檢驗(yàn)原理及要點(diǎn)分析：

(1)將接種好的樣品放人恒溫水浴箱或隔水式恒溫培養(yǎng)箱時，箱內(nèi)溫度一定要求達(dá)到所要求的溫度(44±1℃)時，方可放入。因自然環(huán)境中生活的大腸菌群培養(yǎng)的最合適溫度為25℃左右，如在37℃培養(yǎng)則仍可生長，但如將培養(yǎng)溫度再升高至44.5℃，則不再生長，而直接來自糞便的大腸菌群細(xì)菌也就是糞大腸菌群，習(xí)慣于37'C左右生長，如將培養(yǎng)溫度升高至44.5℃仍可繼續(xù)生長。因此，可用提高培養(yǎng)溫度方法將自然環(huán)境中的大腸菌群與糞便中的大腸菌群區(qū)分。如用恒溫水浴箱其水面要高于接種物面，放濾膜的培養(yǎng)皿要沉到水浴箱底部。

(2)本方法采用乳糖膽鹽培養(yǎng)液，是具有選擇性作用的培養(yǎng)基。其中膽鹽具有抑制革蘭氏陽性菌的作用。膽鹽的品種來源及用量不同，其抑菌效果也不同。經(jīng)實(shí)驗(yàn)觀察，豬、牛、羊三種膽鹽對大腸菌群的檢驗(yàn)效果無明顯、差異，可互相替代；而其他膽鹽的檢驗(yàn)效果則不一致。不宜相互代替2。

取loreL 1:10稀釋的檢液，加到10mL雙倍濃度的乳糖膽鹽培養(yǎng)液中(提高靈敏度和增菌的作用)，置44℃±0.5℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h～48h，如不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣，則報告為糞大腸菌群陰性。

(3)乳糖能起選擇作用，因?yàn)楹芏嗉?xì)菌不能發(fā)酵乳糖，而大腸菌群能發(fā)酵乳糖并產(chǎn)酸產(chǎn)氣。大腸桿菌能分解乳糖而產(chǎn)生酸，使培養(yǎng)基的pH降低(指示劑變色)。這一現(xiàn)象可作為觀察結(jié)果的指標(biāo)。大腸桿菌細(xì)胞在酸性環(huán)境中，由于甲酸脫氫酶的作用，可使甲酸分解成C02和H2，在培養(yǎng)基中產(chǎn)生大量氣體而進(jìn)入倒管中，以觀察產(chǎn)氣2。

實(shí)驗(yàn)表明，大腸菌群的產(chǎn)氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿氣體，少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡。如果對產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的乳糖發(fā)酵如有疑問時，可以用手輕輕打動試管，如有氣泡沿管壁上浮，即應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生，而應(yīng)作進(jìn)一步試驗(yàn)。培養(yǎng)液中加入溴甲酚紫作為酸度指示劑，細(xì)菌產(chǎn)酸后，培養(yǎng)液即由原來的紫色變成黃色。

(4)雙倍濃度的乳糖膽鹽

培養(yǎng)液應(yīng)盡快放于高壓蒸汽滅菌器中，在68.95KPaIl5℃滅菌20min(注意：這個溫度也應(yīng)控制好，既達(dá)到滅菌的作用，還要防止培養(yǎng)物質(zhì)分解流失)，然后貯存于水箱或暗處備用。

(5)如產(chǎn)酸產(chǎn)氣，劃線接種到伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置3TC培養(yǎng)L8h～24 h。糞大腸菌群在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上的典型菌落呈深紫黑色，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤，常具有金屬光澤。也有的呈紫黑色，不帶或略帶金屬光澤，或粉紫色，中心較深的菌落，亦常為糞大腸菌群，應(yīng)注意挑選。不發(fā)酵乳糖的細(xì)菌(如沙門氏菌、志賀氏菌)則為無色菌落。影響糞大腸菌群檢出率的因素很多。如化妝品種類，菌落色澤和形態(tài)，細(xì)菌種類等，如只挑一個菌落，由于機(jī)率問題，很難避免假陰性出現(xiàn)，所以當(dāng)菌落呈不典型時，要多挑幾個菌落以免出現(xiàn)假陰性2。

表1糞大腸菌群在幾種常用分離培養(yǎng)上的菌落特征3

培養(yǎng)基

菌落特征伊紅美國微軟紫黑色、有金屬光澤，紫黑色、公司蘭培養(yǎng)基不帶或略帶光澤，淡紫紅色、中

(EMB)

心紫黑色、黑紅或深紫紅色中國蘭平板深藍(lán)色，淺藍(lán)色、中心深藍(lán)色桃紅色，粉紅色、中心桃紅色

挑取上述可疑菌落，涂片作革蘭氏染色鏡檢。革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。如用1:10稀釋石碳酸復(fù)紅染色液作復(fù)染，復(fù)染時間僅需10s4。

(6)雙倍濃度的乳糖膽鹽培養(yǎng)液1～2滴接種到蛋白胨水中，置44℃±0.5℃培養(yǎng)24h。經(jīng)培養(yǎng)后，在蛋白胨水培養(yǎng)液中，加入靛基質(zhì)試劑約0.5mL，觀察靛基質(zhì)反應(yīng)。陽性者液面呈-玫瑰紅色；陰性反應(yīng)液面呈試劑本色。

(7)根據(jù)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，平板上有典型菌落，并經(jīng)證實(shí)為革蘭氏陰性短桿菌，靛基質(zhì)試驗(yàn)陽性，則可報告被檢樣品中檢出糞大腸菌群5。

(8)在化妝品中糞大腸菌群的存活期只有4天，污染指標(biāo)菌糞大腸菌群的檢出率很低，其重要原因之一可能是化妝品防腐劑抑菌作用的影響。使用中和劑卵磷脂和吐溫80后，含中和劑的乳糖膽鹽培養(yǎng)基中能夠檢出糞大腸菌群的最低細(xì)菌濃度，比標(biāo)準(zhǔn)乳糖膽鹽培養(yǎng)基下降了1個級數(shù)。因此在檢驗(yàn)中一定要注意中和劑的選擇6。

參考文獻(xiàn)

[1]中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)。

[2]化妝品微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法糞大腸菌群及注解

[3]中國疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所信息室

[4]化妝品的衛(wèi)生規(guī)范第四部分

[5]化妝品微生物檢驗(yàn)糞大腸菌群

[6]郭潤霞等中華現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)雜志《提高化妝品細(xì)菌檢出靈敏度的試驗(yàn)探討》2005 12(3)