反膠團萃取分離純化色氨酸的研究

司晶星

摘要:色氨酸是人體內(nèi)的必需氨基酸之一。針對色氨酸的分離純化,提出一種基于反膠團法的分離純化方法。結(jié)果表明,采用AOT/異辛烷反膠團體系,在AOT濃度60mmol/L;;萃取pH為2.0;離子強度為0.1mol/L;反萃取PH為10;離子強度為1mol/L的條件下,經(jīng)過一次萃取,回收率可以達到70%左右。

關(guān)鍵詞:色氨酸 反膠團 AOT 萃取

0 引言

色氨酸是人體內(nèi)的必需氨基酸之一。色氨酸對人和動物的生長發(fā)育、新陳代謝起重要的作用,對預(yù)防糙皮病、抑郁癥,改善睡眠和增強自信心有著很重要的作用,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和飼料行業(yè)。反膠團是針對于生物活性的氨基酸或蛋白質(zhì)提出的一種液液萃取體系。同傳統(tǒng)氨基酸分離純化手段相比,它具有分離步驟少、易于放大、高選擇性、低成本的特點。從20世紀(jì)70年代末反膠團概念的提出到現(xiàn)在,它一直是生化工程研究領(lǐng)域的熱點。在研究利用反膠團從實際復(fù)雜體系(如發(fā)酵液中)分離純化目標(biāo)蛋白時,如果直接從復(fù)雜體系入手,盲目性很強,很難對萃取過程或出現(xiàn)的問題進行準(zhǔn)確的分析和判斷。而從模擬體系入手,在研究清楚萃取過程的主要規(guī)律后,再進行復(fù)雜體系的研究,是一種事半功倍的研究思路。作者通過正交實驗分析方法,研究了反膠團體系中AOT濃度、萃取PH、萃取離子強度、反萃PH和反萃離子強度五個因素對色氨酸萃取的影響,從而推斷出最優(yōu)方案。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 AOT(丁二酸-2-乙基己基磺酸鈉)購自嘉善巨楓化工廠,異辛烷購自天津市福晨化學(xué)試劑廠,其他試劑購自上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司,均為分析純。水溶液均用去離子水配制,實驗在室溫下進行。

1.2 萃取與反萃實驗 將適量的AOT加入到異辛烷溶液中搖勻,使其均勻分布于有機相,得到澄清透明穩(wěn)定的反膠團系統(tǒng)。準(zhǔn)確量取1mL色氨酸儲備液于不同緩沖液中,稀釋,由不同濃度的離子構(gòu)成酸緩沖液,PHPI)的離子強度的緩沖液作為反萃取水相,與前萃取所得的有機相混合,放在振蕩機上劇烈搖晃后20min,傾入離心管,進行離心。用滴管小心地將兩相分開,下層水相即為純化的色氨酸。

1.3 色氨酸含量分析 利用對二甲氨基苯甲醛法測量水相中色氨酸含量。在752紫外光柵分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司)上測定600nm處的吸光度,對照標(biāo)準(zhǔn)濃度-吸收度曲線,以計算色氨酸的濃度。色氨酸測量范圍為0-100μg/mL。

2 實驗結(jié)果與討論

反膠團體系影響因素很多,需要對各個條件進行優(yōu)化,選擇色氨酸萃取最佳條件,但是各個因素太復(fù)雜,如果每個因素都分開討論,工作量很大,而且需要很長時間,因此在實際實驗中采用正交實驗的方法。正交試驗設(shè)計是利用“正交表”進行科學(xué)地安排與分析多因素試驗的方法。其主要優(yōu)點是能在很多試驗方案中挑選出代表性強的少數(shù)幾個試驗方案,并且通過這少數(shù)試驗方案的試驗結(jié)果的分析,推斷出最優(yōu)方案,同時還可以作進一步的分析,得到比試驗結(jié)果本身給出的還要多的有關(guān)各因素的信息。

在本次實驗中,對AOT濃度、萃取pH、萃取離子強度、反萃pH、反萃離子強度這五個因素進行考慮。

固定以下幾個條件:

色氨酸儲備液單位為1mg/ml;有機溶劑為異辛烷;表面活性劑為AOT;無助表面活性劑;萃取和反萃相比為1:1;萃取和反萃離子都為KCL;萃取時間15min;離心(3500r/min,5min);反萃時間為20min;離心(3500r/min,5min),萃取溫度為室溫。實驗的各因素級水平如(表3-1):

取16個100mL的三角瓶,并依次編號,按照所述實驗步驟進行操作,固定條件不變,但是對涉及正交的幾個因素的種類和加入量按照表3-2進行試劑的正確加入,采用正交表進行實驗,結(jié)果如下:

2.1 PH對萃取過程的影響 水相的PH值決定了色氨酸表面電荷的狀態(tài),從而對萃取過程造成影響,由于AOT為陰離子表面活性劑,在進行萃取過程中應(yīng)該是PH

在進行反萃取過程中PH>PI,當(dāng)PH值小于10時,萃取率較低;在PH>10.0時,隨著PH的升高,萃取率明顯升高,以PH值11.0的萃取效果為最好,但是當(dāng)PH>12時,萃取效率降低。

2.2 離子強度對萃取過程的影響 離子強度對蛋白質(zhì)萃取有幾方面的影響:一是離子強度增大后,反膠束內(nèi)表面的雙電層變薄,減弱了蛋白質(zhì)與反膠束內(nèi)表面之間的靜電吸引,從而減少蛋白質(zhì)的溶解度;二是反膠束內(nèi)表面的雙電層變薄后,也減弱了表面活性劑極性頭之間的斥力,使反膠束變小,從而使蛋白質(zhì)不能進入其中;三是離子強度增強時,增大了離子向反膠束“水池”的遷移并取代其中蛋白質(zhì)的傾向,使蛋白質(zhì)從反膠束內(nèi)被鹽析出來;四是鹽與蛋白質(zhì)或表面活性劑的相互作用,可改變?nèi)芙庑阅?鹽的濃度越高,其影響就越大。顯示離子濃度在0.1mol/L左右時萃取率較高,隨著濃度進一步的提高,萃取率會發(fā)現(xiàn)明顯的降低。反萃離子強度在2mol/L左右回收率最高,高于或低于2mol/L回收率都會有明顯的降低。

2.3 AOT濃度對萃取過程的影響 根據(jù)一些文獻,AOT的最佳濃度適用范圍對于不同的目的產(chǎn)物不同,對于不同的萃取物質(zhì),AOT濃度差別較大,故在本實驗中AOT的濃度范圍作為一個重要因素進行考慮。AOT濃度太低達不到臨界膠束濃度,不會形成反膠團,對目的產(chǎn)物無萃取作用,但是AOT濃度太高,會造成其在有機相中不溶解,反膠團形成渾濁溶液,多余AOT進入水相,影響實驗結(jié)果,還會造成試劑浪費。而對于我們本次用的實驗藥品,AOT濃度在80mmol/L以上會有一部分不溶于異辛烷中,因此對于后面的正交試驗,選擇AOT濃度分別為50、60、70、80mmol/L。AOT濃度對萃取效率也有較大的影響。從實驗數(shù)據(jù)分析得,AOT濃度在60mmol/L左右最佳。

3 結(jié)論

AOT濃度60mmol/L;以異辛烷作為有機溶劑;萃取pH為2.0;離子強度為0.1mol/L;反萃取PH為10;離子強度為1mol/L;萃取離子和反萃離子都為氯化鉀;萃取時間為15min;水浴振蕩250r/min;反萃時間為20min;水浴振蕩250r/min;有機相:水相=1:4(V:V);有機溶劑可以循環(huán)利用;萃取溫度為室溫;色氨酸回收率最高可以達到70%左右。

隨著人們生活水平的進一步提高,色氨酸的需求量將會逐步增大。目前,在工業(yè)生產(chǎn)中大多采用的還是離子交換分離技術(shù)。但是,從相關(guān)報道的數(shù)量上來看,膜分離、液膜和反膠團萃取研究較為熱門?？梢?新方法在操作、分離效率和能力等方面已經(jīng)顯現(xiàn)出相當(dāng)?shù)膬?yōu)勢,相信一定會有良好的應(yīng)用前景。

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