ＵＶＡ損傷人表皮細(xì)胞模型中載物界面的選擇

馬林琳　張　玲　羅　敏　鄧楊林　李瑪琳

【摘要】 目的 選擇一種建立長波紫外線(ultrayiolet，UVA)照射人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞損傷模型的理想載物界面。方法 選取原代培養(yǎng)的處于指數(shù)生長期的角質(zhì)形成細(xì)胞，分別采用泡沫板、錫紙板、冰面作為載物界面，進(jìn)行相同劑量的UVA照射，同時設(shè)未照射組為對照組，通過改良MTT法檢測細(xì)胞損傷程度。結(jié)果 冰面作為載物界面時，細(xì)胞損傷相對較弱，損傷率僅為19.88%；錫紙面作為載物界面時，細(xì)胞照射損傷最重，損傷率高達(dá)82.76%；泡沫板作為載物界面時的細(xì)胞照射損傷率為55.58%，介于上述兩種載物界面之間，各組與對照組比較均有顯著性差異(P<0.05)。結(jié)論 泡沫板是UVA照射人表皮細(xì)胞損傷模型的理想載物界面。

【關(guān)鍵詞】 UVA；人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞；模型；載物界面

Select a matter interface for the models of UVA induced human epiderm keratinocytes irradiation damage MA Lin-lin，ZHANG Ling，LUO Ming，et al.Kunming Medical College in Yunnan Province Key Laboratory of Pharmacology of Natural Medicines，Kunming，Yunnan 650031，China

【Abstract】 Objective To choose a better matter interface for the models of UVA induced human epiderm keratinocytes irradiation damage.Methods To irradiate the human epiderm keratinocytes with an identical dose of UVA，which is primary cultured and is occupying exponential growth phase.The matter interface is cystosepiment，tin foil and ice.The non- irradiation group is the control group.To detect the cells degree of injury through the improved methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assay.Results The frequency of injury is 19.88% with the matter interface of ice，and cells injury is feeble.The injury rate is 82.76% with the matter interface of tin foil，and cells injury is heaviest.But the injury rate is 55.58% with the matter interface of cystosepiment，the cells injury is between the ice and the tin foil.To compared with the control group，each group have a significant difference (P<0.05).Conculusion To decided that the matter interface is the cystosepiment when the period of irradiation.

【Key words】 UVA；Human Epiderm Keratinocytes；model；matter interface

日光中的紫外線與皮膚曬傷、皮膚老化、皮膚炎癥以及皮膚癌的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。近年來環(huán)境隨著污染日益嚴(yán)重和臭氧層破壞的加劇，紫外線輻射日益增強(qiáng)。研究紫外線對人體皮膚的損傷及尋找抗紫外線損傷的保護(hù)產(chǎn)品，受到人們越來越多的關(guān)注。人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞(human epiderm keratinocytes，HEKC)UVA損傷模型的建立是研究紫外線損傷及開發(fā)防紫外線產(chǎn)品的基礎(chǔ)和前提。

一個良好的細(xì)胞損傷模型應(yīng)該具備細(xì)胞損傷程度適中、損傷可控以及用于實驗研究具有良好的可重復(fù)性等特點。HEKC的UVA損傷模型是通過UVA輻照裝置對HEKC進(jìn)行照射而建立的。在建立該模型過程中受很多因素的影響，其中在采用UVA輻照裝置對細(xì)胞進(jìn)行損傷性照射時，必須使用一種承載細(xì)胞培養(yǎng)皿/板的裝置(載物界面)。在已報道的多種光損傷模型中，使用的載物界面亦不同，如倪建華^[1]等采用干冰作為載物界面，王紅偉^[2]等則以冰面為載物界面，還有人直接以超凈工作臺的金屬臺面為載物界面。不同的載物界面對光的吸收和反射作用不同，在UVA照射過程中會對其照射效果產(chǎn)生很大的影響。為使實驗結(jié)果具有穩(wěn)定性及可重復(fù)性，加之實驗的經(jīng)濟(jì)性原則，本研究對幾種載物界面對模型建立的影響進(jìn)行比較，旨在為建立UVA照射HEKC損傷模型確定一種理想的載物界面，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 載物界面 泡沫板、錫紙板、冰面。

1.1.2 主要儀器及試劑 UVA光源以及紫外輻照度計(北京師范大學(xué)光學(xué)儀器廠)、眼科剪眼科鑷等手術(shù)器械、溫度計、DispaseⅡ(Sigma公司)、0.05% Trypsin-EDTA(GIBCO公司)、Keratinocyte-SFM(GIBCO公司)、PBS(國產(chǎn)分析純試劑配制)、MTT(Sigma公司)、十二烷基硫酸鈉(廣州南方化玻公司分裝)、異丁醇(上海試劑一廠)、鹽酸(汕頭市西隴化工廠)。

1.1.3 人角質(zhì)形成細(xì)胞 健康男性環(huán)切術(shù)切除的包皮組織(昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院)原代培養(yǎng)獲得HEKC。

1.2 方法

1.2.1 人角質(zhì)形成細(xì)胞的原代培養(yǎng) 將取得的皮膚標(biāo)本，PBS液反復(fù)沖洗后，采用陳勇等^[3-5]報道的培養(yǎng)方法，原代培養(yǎng)獲得HEKC。

1.2.2 實驗分組 實驗分為未照射組、分別以泡沫板、錫紙板及冰面作為載物界面的照射組。

1.2.3 細(xì)胞接種及處理 第3代HEKC，以細(xì)胞密度2×10⁴個/cm²接種到12個35 mm培養(yǎng)皿中(每組設(shè)3個培養(yǎng)皿)，于37℃、5%CO₂、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，HEKC生長至指數(shù)生長期時進(jìn)行實驗。棄去Keratinocyte-SFM，PBS液洗滌2次后，每孔加入適量PBS液，用于實驗操作。

1.2.4 UVA照射 照射裝置由六根平行的UVA燈管組成，通過紫外輻照度計確定照射強(qiáng)度為6.4 W/cm²，根據(jù)照射劑量8.09 J/cm²，確定照射時間為21 min。

將照射裝置置于超凈工作臺內(nèi)，分別采用泡沫板、錫紙板及冰面為載物界面對照射組HEKC進(jìn)行照射(HEKC距燈管垂直距離為1 cm)，未照射組HEKC于超凈臺內(nèi)放置相同時間后，同照射組HEKC一起，更換上新鮮Keratinocyte-SFM后，于37℃、5%CO₂、飽和濕度的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。照射同時，溫度計檢測三種載物界面局部空間(HEKC與燈管之間的空間)溫度變化。

1.2.5 改良MTT法測定細(xì)胞損傷程度 酶標(biāo)儀上采用570 nm和630 nm雙波長測定吸光度(OD)值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 11.5軟件，進(jìn)行方差分析及q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

將HEKC培養(yǎng)至指數(shù)生長期，分別以泡沫板、錫紙板及冰面為載物界面，進(jìn)行UVA照射，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后檢測OD值，結(jié)果見表1；同時監(jiān)測照射期間載物界面局部空間溫度變化，結(jié)果見圖1。

3 討論

由表1可以看出，采用不同的載物界面對HEKC進(jìn)行UVA照射，細(xì)胞的損傷程度明顯不同，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01 )。當(dāng)以冰面作為照射期間的載物界面時，HEKC的損傷程度相對較弱，損傷率僅為19.88%，而以錫紙板為載物界面時，HEKC照射損傷最重，損傷率高達(dá)82.76%，細(xì)胞損傷程度出現(xiàn)很大的差異。

圖1 UVA照射期間不同載物界面局部空間溫度變化

分析出現(xiàn)這一差異的原因可能與照射過程中載物界面局部空間溫度有關(guān)，因此筆者對照射期間載物界面局部空間的環(huán)境溫度進(jìn)行了檢測。從圖1可以看出，錫紙板局部空間的溫度隨著照射時間的延長升高很快且幅度很大，照射15 min就超過了人體正常體溫范圍，高達(dá)39℃以上；冰面局部的空間溫度在照射期間幾乎沒有變化，遠(yuǎn)低于人體正常體溫范圍，維持在一個恒定的低溫。分析其原因是，隨著照射時間的延長，由于燈管的產(chǎn)熱作用照射裝置周圍的溫度會逐漸增加，尤其是載物界面局部空間溫度增加更為明顯。錫紙板當(dāng)接受光源照射時具有聚熱的作用，短時間內(nèi)就可使其局部空間溫度升到很高，擴(kuò)大了溫度效應(yīng)對細(xì)胞損傷的影響，相同時間UVA照射將會出現(xiàn)細(xì)胞損傷過重致大多數(shù)細(xì)胞都出現(xiàn)了不可逆的損傷，對于研究藥物作用效果的現(xiàn)實臨床意義不大。然而，以冰面為載物界面時，局部空間維持在恒定的低溫，要使該損傷模型達(dá)到同等損傷程度就需無限期的延長照射時間，從而增加了細(xì)胞在室溫環(huán)境的暴露時間，不利于細(xì)胞生存。同時考慮實際情況下經(jīng)日光照射皮膚表面溫度也會隨之升高，溫度不可能過低，因此不能完全排除溫度效應(yīng)在照射中的影響。

同時參照本實驗室前期研究結(jié)果：建立人皮膚細(xì)胞紫外線損傷模型的細(xì)胞損傷率維持在50%左右時，細(xì)胞損傷程度可控、模型穩(wěn)定及實驗的可重復(fù)性等均較好。綜合分析認(rèn)為，在建立UVA照射損傷HEKC模型中，充分考慮細(xì)胞損傷程度的同時應(yīng)選擇與體內(nèi)情況較為一致的載物界面。對3種載物界面進(jìn)行綜合比較的結(jié)果為：泡沫板作為照射期間的載物界面具有一定的優(yōu)勢，照射后細(xì)胞損傷程度適中(損傷率為55.58%)，照射過程中局部空間溫度維持在37℃左右，與體內(nèi)環(huán)境相似，利于藥物療效的研究，其現(xiàn)實意義不容忽視。因此，選其作為UVA損傷HEKC模型建立過程中的載物界面較為理想。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] 倪建華.長波紫外線對人皮膚成纖維細(xì)胞生長的影響.上海預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2004，16(8)：365-367.

[2] 王紅偉，尚蘭琴，郝衛(wèi)東.長波紫外線致人皮膚成纖維細(xì)胞凋亡和活性氧生成的作用.北京大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2003，35(1)：69-73.

[3] 陳勇，戴和平，龍志高，等.人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的分離與原代無血清培養(yǎng).湖南醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2003，28 (5)：481-484.

[4] 孫曙光，程大勝，王良喜，等.表皮細(xì)胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化.山東醫(yī)藥，2006，46(5)：13-14.

[5] QIN Fen-Ju，ZAN Lin-Sen.Culture conditions for the isolation and growth of scalper epidermal cells in Vitro.Chinese Journal of Zoology，2003，38(6)：76-79.