葫蘆科蔬菜花藥培養(yǎng)研究進展

周　林　韓金星　黃金艷　覃斯華　李文信　洪日新　何　毅　李天艷　樊學軍

摘要：概述了當前國內(nèi)外葫蘆科蔬菜花藥培養(yǎng)過程中的主要影響因素，總結(jié)了單倍體植株的倍性鑒定方法與染色體加倍技術(shù)，探討了目前存在的問題以及今后的發(fā)展方向。

關(guān)鍵詞：葫蘆科蔬菜；花藥培養(yǎng)；單倍體；倍性鑒定；加倍

葫蘆科(Cucurbitaccac)蔬菜在我國常見的主要包括西瓜、甜瓜、苦瓜、黃瓜、西葫蘆等，栽培面積大，且具有較高的經(jīng)濟效益，在百姓日常生活中具有重要作用。但由于我國地域遼闊，氣候因素和地理環(huán)境因素等生態(tài)因子限制了優(yōu)良品種優(yōu)良特性的發(fā)揮，通過簡單的引種已經(jīng)不能適應各地生產(chǎn)的需要。而通過常規(guī)育種手段進行品種改良又存在周期比較長、難度大、遺傳性狀不穩(wěn)定等諸多問題，因此利用生物技術(shù)手段育種則是另一條重要途徑。葫蘆科蔬菜的花藥培養(yǎng)技術(shù)不僅能夠縮短育種過程中選擇及純化的時間，而且對遺傳育種具有重要的理論和實際意義。

利用葫蘆科蔬菜花藥培養(yǎng)的歷史可追溯到1971年西貞夫等對黃瓜花藥培養(yǎng)進行的研究，他們獲得了不定芽。在隨后的幾十年里，研究者們在葫蘆科蔬菜9個屬中的南瓜屬、葫蘆屬、西瓜屬、甜瓜屬和苦瓜屬等5個屬獲得了單倍體。

1影響葫蘆科蔬菜花藥培養(yǎng)的主要因素

影響花藥培養(yǎng)的因素很多，涉及到供體植株的基因型、小孢子發(fā)育時期等內(nèi)部因素和培養(yǎng)基成分、激素、碳源以及培養(yǎng)條件等外部因素，并且這些因素之間還存在著一定的互作效應。

1.1材料

1.1.1基因型材料基因型對花藥培養(yǎng)的影響主要表現(xiàn)在對胚狀體誘導率的不同上，即使在同一種內(nèi)，同一方法、不同材料間有顯著的差別。在葫蘆科蔬菜中，研究者就此對西瓜、甜瓜、黃瓜等進行了不同程度的研究，其中以西瓜花藥培養(yǎng)技術(shù)較為成功，前人研究較多，認為不同品種基因型之間愈傷組織誘導率相差很大，選擇適合誘導品種是培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。在李娟等的試驗中發(fā)現(xiàn)，野生品種和栽培品種的愈傷組織誘導率有顯著差別，前者要高于后者。另有研究表明，F(xiàn)1代在花藥培養(yǎng)中的愈傷組織產(chǎn)量高于或至少等于其高產(chǎn)量親本，有個別組合的F1代愈傷組織產(chǎn)量甚至成倍地高于其高產(chǎn)量親本，表現(xiàn)雜種優(yōu)勢。在緱艷霞的西瓜花藥培養(yǎng)試驗和董艷榮的甜瓜花藥培養(yǎng)試驗中對此也進行了證明，

1.1.2小孢子發(fā)育時期小孢子細胞發(fā)育時期一般分為四分體時期、小孢子時期(單核早期、單核中期、單核靠邊期、雙核期)和成熟花粉粒時期。不同植物花藥培養(yǎng)最適宜的小孢子發(fā)育時期不同，而最適發(fā)育時期是影響誘導效果的關(guān)鍵。有研究表明，南瓜小孢子單核中期和單核晚期效果較好，接種在MS+15％蔗糖+5mg/L 2，4-D的培養(yǎng)基上能夠誘導出具分化能力的愈傷組織。另有文獻指出，甜瓜花藥培養(yǎng)最佳時期是單核靠邊期到雙核期，黃瓜以單核中后期的小孢子為佳，總體來說，大部分集中在小孢子時期，即單核早期到雙核期，通常以外部形態(tài)指標如花辦長/花藥長或花蕾長度作為此期的標準。

1.2培養(yǎng)基成分

1.2.1基本培養(yǎng)基花藥培養(yǎng)常用培養(yǎng)基有MS、Nitsch、White和N₆等，培養(yǎng)基的成分、種類、濃度不同，都會影響花藥培養(yǎng)的效果，以MS培養(yǎng)基的使用最為普遍。薛光榮袁萬良、魏瑛等在西瓜花藥培養(yǎng)中都用MS作為基本培養(yǎng)基，且效果較好。陳佳在苦瓜花藥培養(yǎng)中比較了MS、N₆3N種基本培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)L培養(yǎng)基不適合苦瓜花藥愈傷組織的誘導。

1.2.2碳源糖是培養(yǎng)基內(nèi)的碳源，起到為細胞的呼吸代謝提供底物與能源和調(diào)節(jié)滲透壓的作用，糖的類型和濃度影響著胚胎形成，蔗糖作為眾多碳源類型中在葫蘆科花藥培養(yǎng)使用較多且效果較好的碳源，適宜濃度為3％～6％。蔗糖經(jīng)高壓滅菌后分解為果糖和葡萄糖，因此也常作為碳源另外添加，麥芽糖等其他碳源已用于小麥作物的花藥培養(yǎng)中，但在葫蘆科蔬菜花藥培養(yǎng)上應用還不多，陳佳在苦瓜花藥培養(yǎng)中對培養(yǎng)基添加麥芽糖進行了試驗，認為其所誘導出的愈傷組織胚性高低需進一步研究。

1.2.3激素激素對花藥培養(yǎng)中誘導花藥胚狀體的發(fā)生起到了關(guān)鍵作用，主要包括了生長素和細胞分裂素，前者常用的包括2.4-D，IAA，NAA等，后者常用的包括KT和6-BA等。一般來說，低質(zhì)量濃度的生長素可以提高胚狀體的誘導率，其中2，4-D在西瓜愈傷組織誘導過程中不宜超過0.5mg/L，否則易產(chǎn)生沒有分化能力的疏松愈傷組織；而低質(zhì)量濃度2.4-D(0.4 mg/L)可以使甜瓜花藥愈傷組織內(nèi)部產(chǎn)生細胞核較大的胚性細胞、二細胞團和多細胞結(jié)構(gòu)。同時，6-BA與生長素的配合使用也起到了關(guān)鍵作用。對愈傷組織和胚狀體的分化，6-BA也起到了重要的作用，配合適當質(zhì)量濃度的IAA可分化出小植株。

1.2.4其他添加成分活性炭(AC)常被作為防止褐化的抗氧化劑物質(zhì)添加到花藥培養(yǎng)基中，在有關(guān)辣椒花藥培養(yǎng)中，有試驗表明添加0.5％的活性炭是有益的。而在葫蘆科蔬菜上，喻財鈴和緱艷霞分別在絲瓜和西瓜的試驗中發(fā)現(xiàn)加入活性炭的效果差，有抑制作用。

大多數(shù)研究認為，硝酸銀作為乙烯抑制劑，在組織及細胞培養(yǎng)中能夠促進胚性愈傷組織的形成；也有人認為它能促進多胺的合成以提高胚性愈傷組織的形成，進而提高愈傷組織分化頻率。在小麥花藥愈傷組織分化培養(yǎng)基中加入硝酸銀有利于提高愈傷組織分化率和綠苗率，可提高小麥花藥培養(yǎng)效率。在葫蘆科蔬菜的花藥培養(yǎng)中應用硝酸銀少見報道，曹利仙等發(fā)現(xiàn)黃瓜離體子葉培養(yǎng)中添加2～6 mg/L硝酸銀能顯著提高子葉芽的再生頻率，韓麗華將硝酸銀應用于厚皮甜瓜未受精胚珠的離體培養(yǎng)上，發(fā)現(xiàn)對誘導單倍體再生植株有一定的作用。

三十烷醇作為外源添加劑最先在袁萬良等報道的西瓜花藥培養(yǎng)中使用，發(fā)現(xiàn)可以提高綠色愈傷組織的誘導率，并形成深綠色點狀組織，提高了再生植株的誘導率。隨后在李娟等的西瓜花藥培養(yǎng)試驗研究中也發(fā)現(xiàn)三十烷醇有此作用，但在緱艷霞和王開凍等的西瓜花藥培養(yǎng)試驗研究中發(fā)現(xiàn)三十烷醇只對誘導和保持綠色愈傷組織有利，對促進不定芽形成作用不明顯，而三十烷醇在其他葫蘆科蔬菜上的應用尚未見報道。

1.3培養(yǎng)方法

1.3.1預處理花藥或花粉經(jīng)過預處理后再進行培養(yǎng)是花藥培養(yǎng)中比較常見的培養(yǎng)方法，其中包括低溫、高溫、熱激以及離心。大部分葫蘆科蔬菜花藥培養(yǎng)采用低溫對花藥進行預處理，其作用是：第1，引起花藥內(nèi)源激素發(fā)生變化，進而影響愈傷組織的形成；第2，引起小孢子的孤立化，使花藥壁細胞和絨氈層在低溫預處理過程中退化解體：第3，減緩小孢子退化，保持生活力，使更多的小孢子有機會參與雄核發(fā)育。魏瑛的研究表明西瓜花藥在4℃下低溫處理72 h效果較佳：Ashok Kumar等將黃瓜花蕾在4、32℃下分別處理1～10d、1d，結(jié)果表明在4℃下處理2d的效果最佳。

1.3.2培養(yǎng)溫度及光照花藥培養(yǎng)中，培養(yǎng)溫度和光照

對愈傷組織或胚狀體的形成以及促進其生長都有重要作用。大部分葫蘆科蔬菜花藥培養(yǎng)的溫度為25～28℃，在西瓜花藥培養(yǎng)中，緱艷霞嘗試了將花藥在30℃下高溫預處理72 h后置于25℃低溫下，發(fā)現(xiàn)也能提高愈傷組織的誘導率。先黑暗培養(yǎng)后光照培養(yǎng)，也能促進優(yōu)良愈傷組織的誘導。這在甜瓜、絲瓜上都得到了驗證。

2葫蘆科蔬菜單倍體倍性鑒定及加倍技術(shù)

通過花藥培養(yǎng)途徑再生的植株，往往會受到花藥壁、絨氈層組織等的影響產(chǎn)生單倍體、二倍體及其他倍性植株的混合群體。因此，有效的倍性鑒定是了解其遺傳背景和進一步應用的基礎(chǔ)。目前的倍性鑒定方法主要有直接鑒定法和間接鑒定法。

2.1直接鑒定法

直接鑒定法即染色體計數(shù)方法，這是確定倍性最基本和最精確的方法，傳統(tǒng)采用根尖、卷須、葉片愈傷組織為材料，常采用壓片法和去壁低滲法進行染色體標本制備。其中壓片法先在對二氯甲苯或8－羥基喹啉水溶液預處理，使中期染色體縮短。再用卡諾固定液固定1～2h，最后以醋酸洋紅或鐵礬蘇木精作為染色劑，觀察細胞中期染色體并計數(shù)。在鑒定單倍體根尖細胞染色體數(shù)目時，由于單倍體植株根尖具有二倍化的傾向，也就是細胞中染色體組可能自然加倍，因此僅進行根尖分析，還不能為植物的染色體提供可靠的證據(jù)，應輔助根尖以外的細胞如嫩葉細胞、花粉母細胞等的染色體觀察也是必要的，這樣可以排除嵌合體的干擾。去壁低滲法是陳瑞陽在國內(nèi)首創(chuàng)的染色體標本制備方法，該方法既可用于染色體計數(shù)，還可用于染色體組型分析Gimsa分帶等研究，并可借助掃描電鏡對植物染色體進行觀察。

2.2間接鑒定法

間接鑒定法主要包括外部形態(tài)指標鑒定、葉片氣孔保衛(wèi)細胞數(shù)目鑒定以及流式細胞儀鑒定法。杜勝利等通過研究比較黃瓜輻射花粉授粉產(chǎn)生的再生植株中的二倍體和單倍體，發(fā)現(xiàn)單倍體植株較之二倍體植株具有葉片小、花辦裂片深、長勢弱等特點。且不能正常結(jié)籽，雄花敗育，雌雄花花冠明顯深裂，可以作為區(qū)分黃瓜單倍體和二倍體植株的形態(tài)指標。在顯微鏡下觀察葉片氣孔保衛(wèi)細胞的長度，是近年來采用較多的倍性鑒定方法，通過卡方適應性測定表明，氣孔保衛(wèi)細胞長度在單倍體與二倍體之間存在著真實差異。Sail等在西瓜、Norio和馬國斌等在甜瓜上均發(fā)現(xiàn)葉片氣孔保衛(wèi)細胞葉綠體個數(shù)與植物倍性呈正相關(guān)，可以作為鑒定西瓜、甜瓜倍性的間接方法。流式細胞儀通過測定處于分裂間期細胞DNA含量，從而確定細胞的倍性，是一種快速的鑒定方法。且不受取樣部位和時間限制，對樣品的需要量少，適合大量樣本檢測使用，但檢測成本較高，應用范圍有限。

2.3染色體加倍技術(shù)

利用離體培養(yǎng)過程中染色體自然加倍現(xiàn)象得到二倍體純合植株是目前花藥培養(yǎng)育種最為常見的加倍方法，但受到多種因素影響。其中物種的影響最大，如自然加倍率水稻花藥培養(yǎng)為70％，煙草花藥培養(yǎng)幾乎為0，小麥花藥培養(yǎng)在20％～30％。而葫蘆科蔬菜花藥培養(yǎng)再生植株自然加倍率也很低，僅在西瓜上有過報道。有研究表明花藥培養(yǎng)再生植株自然加倍主要是通過核內(nèi)有絲分裂進行，這和接種花藥的發(fā)育時期，培養(yǎng)基中激素的種類和水平，花粉植株的發(fā)生方式以及愈傷組織繼代培養(yǎng)時間的長短有關(guān)系。

染色體人工加倍最有效的方法是采用藥劑處理，常用藥劑除了秋水仙素，還有一些有機殺菌藥劑。通常使用秋水仙素0.1％～0.5％溶液處理離體培養(yǎng)的單倍體植株腋芽、頂芽或整個植株。Sail等用0.5％秋水仙堿浸泡單倍體幼苗生長點也成功地使西瓜單倍體加倍得到雙單倍體植株。

3問題與展望

就目前而言，大部分葫蘆科蔬菜花藥培養(yǎng)的研究主要集中在西瓜、甜瓜、黃瓜3個種類上，而對南瓜、苦瓜等其他物種研究較少。在多數(shù)葫蘆科蔬菜花藥培養(yǎng)獲得的再生植株是通過愈傷組織途徑得到的，而細胞愈傷化后極不穩(wěn)定，容易產(chǎn)生多倍體和非整倍體。并且花藥愈傷組織可能來自小孢子，也有可能來自花藥壁等體細胞，在愈傷組織階段很難鑒別其倍性。另外在花藥培養(yǎng)離體再生的過程中，由于受到各種內(nèi)、外部因素的影響，愈傷組織容易褐化、分化難、芽伸長緩慢、再生頻率低，并且再生體系重復性差。而通過胚狀體途徑得到的再生植株可以減少來自花藥壁等體細胞的再生植株，同時胚狀體的成苗率和再生植株的成活率都比較高，并且能自然加倍成為二倍體純合植株。因此，深入研究小孢子脫分化啟動與胚狀體的發(fā)生機理和誘導條件是從胚狀體途徑提高葫蘆科蔬菜花藥培養(yǎng)誘導率的關(guān)鍵。葫蘆科蔬菜的自然加倍率較低，而通過秋水仙素處理的人工加倍，整體加倍效率不高，且易產(chǎn)生多倍體，人為控制的因素和方法需要進一步的探討。雖然對葫蘆科蔬菜花藥培養(yǎng)的研究已取得了一定的進展，但存在的問題還很多。在今后的研究中，高頻再生體系的建立和成熟的加倍技術(shù)仍是我們研究的重點，從而在此基礎(chǔ)上達到創(chuàng)制新的種質(zhì)資源，提高葫蘆科蔬菜育種水平的目的。