• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    外泌體在骨性關(guān)節(jié)炎治療中的研究進(jìn)展*

    2019-02-11 22:31:10王繼鋒段莉李耀璽王大平
    生物骨科材料與臨床研究 2019年5期
    關(guān)鍵詞:外泌體滑膜骨性

    王繼鋒 段莉 李耀璽 王大平

    [關(guān)鍵字]外泌體;骨性關(guān)節(jié)炎;間充質(zhì)干細(xì)胞

    隨著人口的老齡化,骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)已經(jīng)成為致殘的重要原因之一,且發(fā)病率逐年上升,被稱為不治之癥。OA 的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜,正常人的關(guān)節(jié)軟骨屬于透明軟骨,軟骨細(xì)胞占關(guān)節(jié)軟骨體積的1%~5%,其可分泌Ⅱ型膠原、透明質(zhì)酸等成分,維持細(xì)胞外基質(zhì)的代謝平衡。當(dāng)年齡增大時(shí),關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生退行性纖維病變,彈性降低,生理結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,軟骨細(xì)胞發(fā)生過(guò)度增殖及肥大化,最終導(dǎo)致不能正常合成聚氨基葡萄糖及透明質(zhì)酸,從而導(dǎo)致軟骨降解及基質(zhì)的丟失[1]。外泌體是一種由細(xì)胞分泌的微囊泡,其在人體中的細(xì)胞或系統(tǒng)之間的交流、調(diào)節(jié)人體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)及對(duì)一些疾病的影響起到重要作用。最新研究表明,不同細(xì)胞來(lái)源的的外泌體在骨性關(guān)節(jié)炎疾病的發(fā)生、發(fā)展中起到十分重要的作用。本文就外泌體在骨性關(guān)節(jié)炎治療的研究進(jìn)展做一綜述。

    1 外泌體概述

    1.1 外泌體的概念

    外泌體(exosome,EXOs)是一種由細(xì)胞分泌的,直徑為30~150 nm 的具有磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)的膜性扁平杯碟狀的微囊小泡,其包含核酸、蛋白質(zhì)等多種生物活性物質(zhì)。最初人們認(rèn)為這些囊泡狀物質(zhì)是細(xì)胞排泄的廢物,但隨著科學(xué)研究的不斷深入,人們發(fā)現(xiàn)這些微囊泡在生物體細(xì)胞及系統(tǒng)間的通迅交流中起到極其重要的作用[2]。與傳統(tǒng)信息信號(hào)途徑相比,EXOs 是一種細(xì)胞之間更高等級(jí)的交流方式,其作為載體可將miRNA、mRNA 及蛋白質(zhì)等多種大分子或小分子運(yùn)送到靶細(xì)胞中,從而參與人體細(xì)胞或系統(tǒng)間的調(diào)控作用[3]。

    1.2 外泌體的分離

    EXOs 是通過(guò)多泡體與質(zhì)膜或漿膜融合形成的,直徑為30~150 nm,而微囊泡的形成則是從質(zhì)膜上脫落,直徑為100~1 000nm。2009 年,布魯諾等將MSC 的分泌物對(duì)甘油所致的急性腎損傷的改善作用歸因于微囊泡(80 nm 到1 m之間)的作用。而相比較之下,Lai 等[4]認(rèn)為這是外泌體起到了保護(hù)的作用。這是一種內(nèi)源性的囊泡,并具有外源性的相關(guān)蛋白,如Alix、TGS101 及CD9、CD63 和CD81 等。由于研究EXOs的功能結(jié)構(gòu)需要排除病毒或其他雜質(zhì)蛋白的影響,故如何能最大化地除去雜質(zhì)來(lái)保證分離出外泌體的純度成為關(guān)鍵。而不同的EXOs 提取方法所獲得EXOs 無(wú)論從純度還是從粒子的完整性方面差異均較大。目前,EXOs 的提純分離方法主要分為以下幾種:蔗糖密度梯度離心法;差速超速離心法;化學(xué)沉淀法;凝膠過(guò)濾法;免疫親和法。Labb 等[5]認(rèn)為,使用化學(xué)沉淀法來(lái)提取EXOs 雖然可以獲得大量顆粒,但純度不夠,即所得產(chǎn)物中雖然有大量蛋白質(zhì),但都不屬于EXOs。而超速離心法可以很好地達(dá)到純度要求,但由于轉(zhuǎn)速過(guò)快導(dǎo)致易破壞EXOs 表面囊泡狀膜結(jié)構(gòu)。此外一些研究表明,可利用免疫親和法來(lái)獲取EXOs??贵w通過(guò)共價(jià)鍵或高親和力與磁珠相互作用,通過(guò)低速離心或磁性技術(shù)來(lái)進(jìn)行物理分離。Sharma 等[6]開(kāi)發(fā)出了一種新的基于免疫親和的方法來(lái)從患者血漿中的正常細(xì)胞分泌的EXOs 中分離黑色素瘤細(xì)胞分泌的EXOs(MTEX)。

    1.3 外泌體的鑒定

    2 外泌體在骨性關(guān)節(jié)炎中的應(yīng)用研究進(jìn)展

    2.1 外泌體在骨性關(guān)節(jié)炎診斷中的研究進(jìn)展

    炎癥是OA 滑膜炎導(dǎo)致骨和軟骨破壞的進(jìn)展過(guò)程的關(guān)鍵因素之一。炎癥過(guò)程所產(chǎn)生的一系列促炎細(xì)胞因子、趨化因子及一些基因的表達(dá)在OA 的發(fā)病機(jī)制中起到了特殊作用[8]。Domenis 等的研究表明,滑膜液(synovial fluid,SF)來(lái)源的外泌體可以刺激外周血單核細(xì)胞分化的炎性M1巨噬細(xì)胞分泌IL-1 和IL-16[9],而IL-1 在OA 發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵作用已被廣泛認(rèn)識(shí),IL-1 在OA 滑膜液中的水平顯著升高,這可使其在OA 診斷中起到生物標(biāo)記物的作用[10]。而且,IL-1 在參與OA 發(fā)病機(jī)制中的細(xì)胞級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的上游發(fā)揮作用,其可誘導(dǎo)其他幾種促炎反應(yīng)因子(如IL-6 和IL-8)的表達(dá)和釋放,以及基質(zhì)金屬蛋白酶的合成。在這項(xiàng)研究中,Domenis 等還發(fā)現(xiàn)SF 分泌的外泌體能刺激M1 型巨噬細(xì)胞產(chǎn)生CCL-20、CCL-15 和CXCL1 等趨化因子。CCL-20 能通過(guò)誘導(dǎo)相關(guān)分解基因的表達(dá)和改變軟骨細(xì)胞表型來(lái)發(fā)揮作用,其刺激MMP-13、ADAMTS-5 和COL-X 型mRNA 的表達(dá),同時(shí)抑制新鮮的體外培養(yǎng)的軟骨組織中COLⅡ型mRNA 的表達(dá)[11];而CXCL1 在OA 軟骨細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)[10],其可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞肥大和凋亡。SF 分泌的外泌體還能刺激M1 巨噬細(xì)胞釋放MMP7 和MMP12。這兩種蛋白酶據(jù)研究發(fā)現(xiàn)與OA 嚴(yán)重程度密切相關(guān)[12-13]。MMPs 是導(dǎo)致軟骨降解的主要酶,而軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解是OA 的最本質(zhì)的特征。以上研究說(shuō)明,外泌體作用于細(xì)胞后產(chǎn)生的相關(guān)細(xì)胞因子可以為診斷骨性關(guān)節(jié)炎提供一個(gè)新思路。

    2.2 外泌體在治療骨性關(guān)節(jié)炎中的研究

    目前,對(duì)于人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細(xì)胞(ESCMSCs)來(lái)源的EXOs 對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎的防治作用機(jī)制研究頗為深入。Wang 等[14]發(fā)現(xiàn),向C57 小鼠關(guān)節(jié)腔里注射ESCMSCs 可以減輕DMM 模型中的軟骨破壞和細(xì)胞外基質(zhì)的降解。這種作用最終被確定為是ESC-MSCs 分泌的EXOs 發(fā)揮的作用。在IL-1 的存在下,EXOs 通過(guò)增加Ⅱ型膠原的合成以及提高ADAMTS5 的表達(dá)來(lái)維持軟骨細(xì)胞的表型,即ESC-MSCs可以通過(guò)EXOs來(lái)平衡軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解,達(dá)到治療OA 的作用,這為OA 的防治以及藥物開(kāi)發(fā)提供了一個(gè)嶄新的思路。有體外實(shí)驗(yàn)證明,在具有免疫活性的大鼠軟骨缺損模型中,人間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的EXOs 可促進(jìn)其軟骨再生[15]。結(jié)果 顯示,MSCs-EXOs 可加速軟骨組織的填充以及增強(qiáng)了Ⅱ型膠原蛋白和硫酸糖胺聚糖等基質(zhì)的合成。EXOs 處理過(guò)的大鼠軟骨和軟骨下骨完全修復(fù),表面規(guī)則,具有透明軟骨的特征。這種透明軟骨可以與周圍的正常軟骨相緊密結(jié)合,渾然一體,并觀察到有大量的細(xì)胞外基質(zhì)沉積。

    2.3 外泌體與骨性關(guān)節(jié)炎的微環(huán)境

    有研究表明,低氧是骨性關(guān)節(jié)炎形成的一個(gè)重要因素。其中,低氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1 )通過(guò)激活低氧反應(yīng)元件被認(rèn)為是細(xì)胞適應(yīng)低氧和分解應(yīng)激的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[16]。通過(guò)誘導(dǎo)相關(guān)合成因子和抑制一些關(guān)鍵的分解因子來(lái)維持和調(diào)節(jié)軟骨紊態(tài)。例如,HIF-1 可促進(jìn)COX-2、CXCL-2 及IL-1、IL-6 的合成,從而引發(fā)骨性關(guān)節(jié)炎微環(huán)境中的炎癥反應(yīng),HIF-1 通過(guò)NF-/HIF-1 信號(hào)通路上調(diào)MMP2 和MMP9 的表達(dá)。這也說(shuō)明關(guān)節(jié)液和軟骨組織中的HIF-1 在OA 的發(fā)病機(jī)制中起到了重要作用。有研究表明,在TNF-誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡中,HIF-1 修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體(BMSC-EXOs)對(duì)關(guān)節(jié)軟骨損傷具有修復(fù)作用,其可抑制炎癥環(huán)境中軟骨細(xì)胞的凋亡[17]。

    上述骨性關(guān)節(jié)炎微環(huán)境的變化也與軟骨細(xì)胞分泌的EXOs 載有的一些蛋白質(zhì)和微小RNA 有關(guān)[18]。MiRNA 是一種單鏈的非編碼的小分子,長(zhǎng)度為20 個(gè)核苷酸左右,其可影響OA 的炎癥反應(yīng)過(guò)程,MSCs-EXOs 中含有大量的miRNA,這在MSCs-EXOs 治療外泌體中發(fā)揮著重要作用,如miR-92a 可通過(guò)增強(qiáng)軟骨細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)軟骨形成而達(dá)到治療OA 的目的[19]。MiR-320 則可以增加軟骨細(xì)胞ECM 合成并下調(diào)負(fù)性調(diào)節(jié)因子(如MMP-13 和ADAMTS-4)的表達(dá)來(lái)減輕OA 的發(fā)生[20]。

    最近有研究發(fā)現(xiàn),miR-146 加重了促炎癥細(xì)胞因子的表達(dá),同時(shí)抑制了軟骨基質(zhì)相關(guān)基因的表達(dá),其通過(guò)下調(diào)TNF-/ 途徑來(lái)參與OA 進(jìn)程。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明,用miR-146 抑制劑治療的經(jīng)手術(shù)誘導(dǎo)的OA小鼠,通過(guò)靶向Camk2d和Ppp3r2顯著減輕了關(guān)節(jié)軟骨的破壞。有研究表明,由軟骨細(xì)胞分泌的外泌體中所表達(dá)的Wnt5a 和Wnt5b 通過(guò)選擇性的Wnt 信號(hào)通路激活了Yes 相關(guān)蛋白(Yes-associated protein,YAP),增強(qiáng)了軟骨細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移,但卻降低了軟骨細(xì)胞ECM的分泌。實(shí)驗(yàn)證實(shí),SMSC-140-EXOs 增強(qiáng)了ACs 的增殖和遷移,卻沒(méi)有降低ECM 的體外分泌的缺點(diǎn)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí),SMSC-140-EXOs 可以成功阻止大鼠OA 模型疾病的發(fā)生[21]。這些miRNA 既存在于EXOs 中,同時(shí)也參與了MSCs 抑制OA 的炎癥反應(yīng)。這是促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)改善OA的潛在策略[22]。

    2.4 不同細(xì)胞來(lái)源的外泌體對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎的影響

    關(guān)節(jié)滑膜炎癥和血管生成是OA 發(fā)病的重要因素。有實(shí)驗(yàn)表明,用在IL-1 刺激下的人滑膜成纖維細(xì)胞(synovial fibroblasts,SFB)分泌的外泌體可以誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞OA 樣基因表達(dá)模式的改變和軟骨降解[23]。與沒(méi)有被IL-1 刺激的SFB 相比,使用IL-1 刺激SFB 后分泌出的外泌體可以使軟骨細(xì)胞中的MMP-13 和ADAMTS5 的表達(dá)顯著上調(diào),并且下調(diào)了COL2A1 和ACAN。Nanostring 分析表明,IL-1 刺激下的SFB 與未刺激的SFB 分泌的外泌體中有50 種miRNAs 的表達(dá)水平存在差異。這說(shuō)明SFB 可能通過(guò)刺激關(guān)節(jié)軟骨的基因表達(dá)來(lái)促進(jìn)血管生成,從而參與血管生成。

    Gasado 等研究發(fā)現(xiàn),利用來(lái)源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的外泌體(BMSC-EXOs)作用于豬的抗炎滑膜炎模型,發(fā)現(xiàn)其最終可以使動(dòng)物模型中滑膜淋巴細(xì)胞減少,抑制T 細(xì)胞分泌TNF-。動(dòng)物模型上的的動(dòng)力學(xué)步態(tài)分析,如擺動(dòng)時(shí)間、步長(zhǎng)時(shí)間和姿態(tài)持續(xù)時(shí)間等參數(shù)也較之前有所改變,說(shuō)明了BMSC-EXOs 在疾病中起到了免疫調(diào)節(jié)的作用[24]。

    另有研究比較了誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell-derived MSCs,iMSC)和SMMSCs 兩種細(xì)胞來(lái)源的EXOs 對(duì)OA 的治療作用效果,實(shí)驗(yàn)表明,注射iMSC-EXOs 和SMMSC-EXOs 都能減輕小鼠OA 模型的疾病發(fā)生,但iMSC-EXOs 的治療效果要優(yōu)于SMMSC-EXOs[25]。Gibson 等[26]證明了BMP-2 和Wnt-5a預(yù)處理的ESC 來(lái)源的EXOs 能促進(jìn)大鼠軟骨缺損的修復(fù)。Wang 等也進(jìn)行了類似的實(shí)驗(yàn),他們發(fā)現(xiàn)向關(guān)節(jié)內(nèi)注射ESCMSCs 可減輕DMM 模型軟骨破壞和基質(zhì)降解。進(jìn)一步的體外研究表明,這種作用是通過(guò)ESC-MSCs 分泌的EXOs 發(fā)揮作用的。EXOs 通過(guò)增加Ⅱ型膠原合成和降低ADAMTS5的表達(dá)來(lái)維持軟骨細(xì)胞表型[14]。

    SMMSCs 來(lái)源于滑膜,具有較高的自我更新能力,因?yàn)榛ず完P(guān)節(jié)軟骨在滑膜關(guān)節(jié)發(fā)育過(guò)程中由共同的細(xì)胞群發(fā)育而來(lái),因此SMMSCs 比其他MSCs 與軟骨細(xì)胞的關(guān)系更加密切。研究顯示,SMMSCs 比BMSCs 和AMSCs 更適合用于軟骨修復(fù),體外實(shí)驗(yàn)表明,SMMSC-EXOs 能顯著促進(jìn)軟骨細(xì)胞的遷移和增殖[25]。但其也有缺點(diǎn),在小鼠OA 模型中,SMMSC-EXOs 處理過(guò)后的軟骨表面不平整,蛋白多糖丟失,淺表區(qū)的軟骨消失,而用iMSC-EXOs 處理軟骨時(shí)未發(fā)現(xiàn)上述情況。更重要的一點(diǎn)是,iMSCs 的獲取途徑可由非侵入性方法獲取,而滑膜SMMSCs 的獲取過(guò)程需要進(jìn)行創(chuàng)傷性的手術(shù)。移植患者特定的iMSC-EXOs 可以避免一些倫理方面的問(wèn)題和免疫抑制相關(guān)的潛在問(wèn)題,并且來(lái)源廣泛,取之不盡,可以滿足臨床需要。

    3 小結(jié)與展望

    目前,對(duì)于治療OA 的EXOs 療法還處于臨床實(shí)驗(yàn)階段,MSC 還沒(méi)有被正式批準(zhǔn)用于OA。但有600 多項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)使用MSC 來(lái)治療OA 是安全的,而對(duì)MSCs-EXOs的深入研究勢(shì)必會(huì)改變現(xiàn)有的OA 的細(xì)胞療法,解決許多與使用活細(xì)胞作為治療藥物的有關(guān)難題,如免疫排斥反應(yīng),因?yàn)镋XOs 具有最小的免疫原性和毒性[27]。而且,使用EXOs藥物治療這種方式更易被人們所接受。因?yàn)檫@種細(xì)胞外囊泡是人本身身體生理所具有的,它們可以通過(guò)一些非侵入性的途徑,比如口服攝入、鼻腔黏膜給藥,甚至可以吸入給藥。EXOs 藥物更適合商品化,我們可以通過(guò)基因操作來(lái)選擇外泌體的來(lái)源細(xì)胞,從而生產(chǎn)具有無(wú)限繁殖潛力的克隆細(xì)胞系,來(lái)確保可再生的成本效益[28]。然而,在軟骨修復(fù)這個(gè)方面,利用EXOs 治療OA 仍有一些問(wèn)題亟待解決,如向關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射EXOs 后對(duì)關(guān)節(jié)腔內(nèi)EXOs 的分布情況和清除速率如何進(jìn)行準(zhǔn)確的評(píng)估目前尚未研究透徹,但不管怎樣,EXOs 未來(lái)在治療OA 的地位肯定會(huì)呈指數(shù)般上升。

    猜你喜歡
    外泌體滑膜骨性
    基于滑膜控制的船舶永磁同步推進(jìn)電機(jī)直接轉(zhuǎn)矩控制研究
    外泌體miRNA在肝細(xì)胞癌中的研究進(jìn)展
    高層建筑施工中的滑膜施工技術(shù)要點(diǎn)探討
    間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體在口腔組織再生中的研究進(jìn)展
    循環(huán)外泌體在心血管疾病中作用的研究進(jìn)展
    肩盂骨性Bankart損傷骨缺損測(cè)量研究進(jìn)展
    外泌體在腫瘤中的研究進(jìn)展
    中藥治療踝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎
    滑膜肉瘤的研究進(jìn)展
    克氏針張力牽引固定法治療骨性錘狀指
    免费一级毛片在线播放高清视频 | 精品国产一区二区久久| 欧美大码av| 久久精品国产综合久久久| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 日韩人妻精品一区2区三区| bbb黄色大片| 国产男女内射视频| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 99久久人妻综合| 国产一卡二卡三卡精品| 精品福利永久在线观看| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 下体分泌物呈黄色| 一区福利在线观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 首页视频小说图片口味搜索| 无限看片的www在线观看| 三上悠亚av全集在线观看| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 大陆偷拍与自拍| 69精品国产乱码久久久| 久久青草综合色| 麻豆乱淫一区二区| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 久热这里只有精品99| 亚洲七黄色美女视频| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲精品久久午夜乱码| 欧美日韩亚洲高清精品| 欧美日本中文国产一区发布| 啪啪无遮挡十八禁网站| 亚洲avbb在线观看| 九色亚洲精品在线播放| 少妇被粗大的猛进出69影院| 亚洲一区二区三区欧美精品| 亚洲精品国产色婷婷电影| av不卡在线播放| 日韩一区二区三区影片| 国产欧美日韩一区二区三 | 亚洲自偷自拍图片 自拍| 日本五十路高清| 国产一区二区激情短视频 | 午夜福利视频在线观看免费| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 久久久久视频综合| 老司机影院成人| 一个人免费看片子| 99精国产麻豆久久婷婷| 操出白浆在线播放| 我的亚洲天堂| 久久久久久免费高清国产稀缺| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产免费福利视频在线观看| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 我要看黄色一级片免费的| 日本五十路高清| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 免费在线观看影片大全网站| www.999成人在线观看| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| www.熟女人妻精品国产| 欧美日韩精品网址| 美女中出高潮动态图| 国产有黄有色有爽视频| 99久久精品国产亚洲精品| 色播在线永久视频| 午夜福利视频在线观看免费| 精品福利永久在线观看| 久久国产精品人妻蜜桃| 亚洲精品国产区一区二| 日本黄色日本黄色录像| 午夜老司机福利片| 国产成+人综合+亚洲专区| av线在线观看网站| 国产免费现黄频在线看| 色婷婷av一区二区三区视频| 男男h啪啪无遮挡| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 亚洲第一青青草原| 一进一出抽搐动态| 精品国产国语对白av| 成年av动漫网址| 大香蕉久久网| 亚洲av男天堂| 美女国产高潮福利片在线看| 两个人免费观看高清视频| 亚洲黑人精品在线| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲熟女毛片儿| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 好男人电影高清在线观看| 成年人免费黄色播放视频| 波多野结衣一区麻豆| 青青草视频在线视频观看| 97精品久久久久久久久久精品| 日韩电影二区| 69av精品久久久久久 | 丝袜脚勾引网站| 精品视频人人做人人爽| av超薄肉色丝袜交足视频| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 日韩中文字幕欧美一区二区| 国产一区二区激情短视频 | 80岁老熟妇乱子伦牲交| 制服诱惑二区| 久久国产亚洲av麻豆专区| 18禁观看日本| 精品久久久久久久毛片微露脸 | www.自偷自拍.com| 国产有黄有色有爽视频| av一本久久久久| 一区二区三区四区激情视频| 午夜精品国产一区二区电影| 91精品三级在线观看| 男女下面插进去视频免费观看| 高清av免费在线| 亚洲专区国产一区二区| 国产三级黄色录像| 99热网站在线观看| 97精品久久久久久久久久精品| 免费在线观看完整版高清| 成年人黄色毛片网站| 我的亚洲天堂| av在线app专区| 亚洲九九香蕉| 午夜激情久久久久久久| 国产一级毛片在线| 视频区欧美日本亚洲| 成人国产av品久久久| 丰满饥渴人妻一区二区三| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产区一区二久久| 99热全是精品| 国产免费现黄频在线看| 国产精品欧美亚洲77777| 又紧又爽又黄一区二区| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 久久这里只有精品19| 我要看黄色一级片免费的| 国产日韩欧美在线精品| 日韩人妻精品一区2区三区| 久久国产精品人妻蜜桃| 丁香六月天网| 大型av网站在线播放| www.熟女人妻精品国产| 国产深夜福利视频在线观看| 国产成人精品无人区| 法律面前人人平等表现在哪些方面 | 欧美日韩黄片免| 十八禁网站网址无遮挡| 国产成人欧美在线观看 | 99久久综合免费| 国产成人系列免费观看| 国产精品成人在线| 丰满少妇做爰视频| a级片在线免费高清观看视频| 后天国语完整版免费观看| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 日本91视频免费播放| 国产精品 国内视频| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 丁香六月天网| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 亚洲色图综合在线观看| 国产真人三级小视频在线观看| 中亚洲国语对白在线视频| 精品第一国产精品| 精品人妻1区二区| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 久久国产亚洲av麻豆专区| 欧美av亚洲av综合av国产av| 又大又爽又粗| 99久久99久久久精品蜜桃| 精品一区二区三卡| 一进一出抽搐动态| 午夜两性在线视频| 久久人妻熟女aⅴ| 多毛熟女@视频| 飞空精品影院首页| 欧美在线一区亚洲| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 丝袜喷水一区| 最近最新免费中文字幕在线| 国产av国产精品国产| 嫩草影视91久久| 久久精品国产亚洲av高清一级| 精品第一国产精品| 日本欧美视频一区| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 脱女人内裤的视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产一区二区在线观看av| 曰老女人黄片| 成人免费观看视频高清| 国产精品欧美亚洲77777| 国产成人欧美| 交换朋友夫妻互换小说| 精品卡一卡二卡四卡免费| 精品视频人人做人人爽| 日本wwww免费看| 国产老妇伦熟女老妇高清| 自线自在国产av| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国产精品 欧美亚洲| 啦啦啦在线免费观看视频4| 一级毛片电影观看| 免费日韩欧美在线观看| 在线观看免费视频网站a站| 欧美激情极品国产一区二区三区| 天堂中文最新版在线下载| av又黄又爽大尺度在线免费看| 丰满少妇做爰视频| 国产精品久久久久久精品古装| 啦啦啦免费观看视频1| 亚洲成人国产一区在线观看| 大香蕉久久成人网| 国产一区二区 视频在线| 9191精品国产免费久久| 动漫黄色视频在线观看| 久久毛片免费看一区二区三区| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 久久香蕉激情| 人人澡人人妻人| 久热爱精品视频在线9| 国产又爽黄色视频| 国产av精品麻豆| 99热国产这里只有精品6| 久久国产精品人妻蜜桃| 99热全是精品| 亚洲视频免费观看视频| 1024视频免费在线观看| 男女国产视频网站| 下体分泌物呈黄色| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 免费高清在线观看视频在线观看| 久久精品国产综合久久久| 日韩欧美一区视频在线观看| 日本wwww免费看| 欧美精品亚洲一区二区| 国产免费现黄频在线看| 免费av中文字幕在线| av线在线观看网站| 欧美精品一区二区免费开放| 国产精品1区2区在线观看. | 搡老熟女国产l中国老女人| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 一区在线观看完整版| 伦理电影免费视频| 国产高清视频在线播放一区 | 精品国产国语对白av| 男女午夜视频在线观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 91九色精品人成在线观看| 国产主播在线观看一区二区| 亚洲av男天堂| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 精品国产国语对白av| 免费在线观看完整版高清| 最新在线观看一区二区三区| 一边摸一边做爽爽视频免费| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 国产成人av激情在线播放| 国产精品久久久av美女十八| 三级毛片av免费| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| videosex国产| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产野战对白在线观看| 免费在线观看黄色视频的| 午夜激情av网站| 91成年电影在线观看| 午夜成年电影在线免费观看| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 99国产精品一区二区三区| 亚洲国产日韩一区二区| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 亚洲五月色婷婷综合| 99国产综合亚洲精品| 黑人欧美特级aaaaaa片| 日韩精品免费视频一区二区三区| 99热网站在线观看| 久久久久久久国产电影| 成年人黄色毛片网站| 欧美日韩av久久| 99国产综合亚洲精品| 脱女人内裤的视频| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 黑人猛操日本美女一级片| av天堂在线播放| av网站免费在线观看视频| 午夜成年电影在线免费观看| 一区二区三区激情视频| 99精品欧美一区二区三区四区| 三级毛片av免费| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 久久久精品区二区三区| 亚洲,欧美精品.| 亚洲av国产av综合av卡| 久久青草综合色| 久久久久久久国产电影| 国产免费福利视频在线观看| 国产高清videossex| 欧美亚洲日本最大视频资源| 欧美另类一区| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 18禁观看日本| 日韩欧美免费精品| 久久午夜综合久久蜜桃| 午夜视频精品福利| 男女免费视频国产| 桃花免费在线播放| 久热爱精品视频在线9| 亚洲精品粉嫩美女一区| 欧美一级毛片孕妇| 蜜桃国产av成人99| 91成年电影在线观看| 一级片'在线观看视频| 午夜激情久久久久久久| 亚洲精品在线美女| 在线看a的网站| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 亚洲专区中文字幕在线| 最近最新中文字幕大全免费视频| 婷婷丁香在线五月| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 成年人免费黄色播放视频| 亚洲免费av在线视频| 午夜福利影视在线免费观看| 成年动漫av网址| 波多野结衣一区麻豆| 亚洲精品国产av成人精品| 久久亚洲精品不卡| 香蕉国产在线看| 精品国产国语对白av| 日韩欧美一区视频在线观看| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产成人a∨麻豆精品| 天天影视国产精品| 1024视频免费在线观看| 一级毛片精品| 丝袜喷水一区| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | cao死你这个sao货| 成年人午夜在线观看视频| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 真人做人爱边吃奶动态| 国产亚洲欧美在线一区二区| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲精品粉嫩美女一区| 丁香六月欧美| 久久久国产精品麻豆| 一级毛片精品| 久久精品人人爽人人爽视色| 在线观看免费高清a一片| 成年人免费黄色播放视频| 天堂8中文在线网| 国产又色又爽无遮挡免| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 国产av一区二区精品久久| 国产激情久久老熟女| 亚洲欧美色中文字幕在线| 国产区一区二久久| 午夜影院在线不卡| 国产亚洲欧美精品永久| 日韩电影二区| 欧美国产精品一级二级三级| 两个人免费观看高清视频| 午夜激情久久久久久久| 欧美精品高潮呻吟av久久| 欧美黄色淫秽网站| tube8黄色片| 在线av久久热| 精品人妻1区二区| 国产一区二区在线观看av| www.自偷自拍.com| 夜夜夜夜夜久久久久| 亚洲少妇的诱惑av| 99香蕉大伊视频| 欧美精品亚洲一区二区| 成年美女黄网站色视频大全免费| 日日爽夜夜爽网站| 黄片小视频在线播放| 中文字幕最新亚洲高清| 在线永久观看黄色视频| 久久ye,这里只有精品| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 中文字幕色久视频| 国产xxxxx性猛交| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 久久久久久人人人人人| 成人手机av| 老司机在亚洲福利影院| 啪啪无遮挡十八禁网站| 色婷婷久久久亚洲欧美| av网站免费在线观看视频| 亚洲欧美一区二区三区久久| 国产精品一区二区在线观看99| 亚洲av片天天在线观看| 91av网站免费观看| 久久久久网色| 老鸭窝网址在线观看| 欧美日韩av久久| 永久免费av网站大全| 日本av手机在线免费观看| 嫩草影视91久久| 一区在线观看完整版| 日韩一区二区三区影片| 交换朋友夫妻互换小说| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲中文av在线| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 亚洲国产精品999| 多毛熟女@视频| 欧美午夜高清在线| 亚洲情色 制服丝袜| 精品人妻1区二区| 99热网站在线观看| 啦啦啦免费观看视频1| 一级毛片电影观看| 国产又色又爽无遮挡免| 黄色怎么调成土黄色| 国产精品九九99| 午夜日韩欧美国产| 黄色视频,在线免费观看| 欧美人与性动交α欧美软件| 亚洲黑人精品在线| 一级黄色大片毛片| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 亚洲精品国产区一区二| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 老熟女久久久| 女人精品久久久久毛片| 在线观看免费视频网站a站| 精品一区在线观看国产| av欧美777| 亚洲精品乱久久久久久| 人妻 亚洲 视频| 最新在线观看一区二区三区| 少妇精品久久久久久久| 狂野欧美激情性xxxx| 18禁观看日本| 亚洲免费av在线视频| 欧美在线黄色| 午夜成年电影在线免费观看| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 精品一区二区三区av网在线观看 | 亚洲九九香蕉| 水蜜桃什么品种好| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲综合色网址| 国产又爽黄色视频| 国产高清国产精品国产三级| 啦啦啦免费观看视频1| 女人精品久久久久毛片| 国产在线观看jvid| 欧美日韩福利视频一区二区| 欧美黑人欧美精品刺激| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 亚洲真实伦在线观看| 日本一区二区免费在线视频| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 精华霜和精华液先用哪个| 视频区欧美日本亚洲| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 高清毛片免费观看视频网站| 亚洲第一电影网av| 亚洲精品在线观看二区| 成人av在线播放网站| 在线a可以看的网站| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 亚洲av片天天在线观看| 国产黄a三级三级三级人| 天堂影院成人在线观看| 国产主播在线观看一区二区| 特大巨黑吊av在线直播| av中文乱码字幕在线| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 麻豆av在线久日| 精品福利观看| 国产高清有码在线观看视频 | 亚洲一区二区三区不卡视频| 99热只有精品国产| 午夜福利成人在线免费观看| 国产真人三级小视频在线观看| 午夜福利成人在线免费观看| 国产一区在线观看成人免费| 国产日本99.免费观看| 亚洲 国产 在线| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 亚洲专区中文字幕在线| 精品久久久久久久毛片微露脸| xxx96com| 在线永久观看黄色视频| 久久伊人香网站| 亚洲片人在线观看| 亚洲欧美精品综合久久99| 久久久国产欧美日韩av| 国产亚洲欧美98| 国产精品综合久久久久久久免费| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲一区二区三区色噜噜| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 老鸭窝网址在线观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 又黄又粗又硬又大视频| 国产精品精品国产色婷婷| 9191精品国产免费久久| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产人伦9x9x在线观看| 丰满的人妻完整版| 国产麻豆成人av免费视频| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 男女视频在线观看网站免费 | 国产三级黄色录像| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 国产精品一及| 色尼玛亚洲综合影院| 一a级毛片在线观看| 桃色一区二区三区在线观看| 老熟妇仑乱视频hdxx| 久9热在线精品视频| 日本成人三级电影网站| 日韩av在线大香蕉| 婷婷精品国产亚洲av| 国产精品久久视频播放| 757午夜福利合集在线观看| 淫秽高清视频在线观看| 成人欧美大片| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 九色国产91popny在线| 深夜精品福利| xxx96com| 国产av不卡久久| 久久久久久久久中文| 黄频高清免费视频| 亚洲成人免费电影在线观看| 久久这里只有精品19| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 中文字幕久久专区| or卡值多少钱| 国产精品一区二区精品视频观看| 午夜福利视频1000在线观看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 老鸭窝网址在线观看| 黄片大片在线免费观看| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 亚洲精品av麻豆狂野| 欧美黄色片欧美黄色片| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 老汉色av国产亚洲站长工具| 韩国av一区二区三区四区| 久久久国产精品麻豆| 欧美日韩国产亚洲二区| 最近最新中文字幕大全免费视频| 超碰成人久久| 成人午夜高清在线视频| www日本在线高清视频| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 国产午夜精品论理片| 免费搜索国产男女视频| 国产亚洲av高清不卡| 1024手机看黄色片| 精品人妻1区二区| 老司机福利观看| 欧美黑人精品巨大| 91老司机精品| 嫩草影院精品99| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 久久精品成人免费网站| 亚洲电影在线观看av| 三级毛片av免费| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 午夜久久久久精精品| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 久久精品国产综合久久久| 日韩高清综合在线| 久久国产乱子伦精品免费另类| 免费在线观看日本一区| 99久久无色码亚洲精品果冻| 国产av在哪里看| 日韩大尺度精品在线看网址| 国产精品 国内视频| 亚洲乱码一区二区免费版| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产精品久久视频播放| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 黄色毛片三级朝国网站| 精品久久久久久久末码| 精品人妻1区二区| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 亚洲国产欧美一区二区综合| 午夜福利18| 国产激情偷乱视频一区二区| 久久久久九九精品影院| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 亚洲av片天天在线观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 久久这里只有精品中国| 成人永久免费在线观看视频| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 亚洲激情在线av| 免费在线观看日本一区|