甜菊糖甙的測(cè)定方法

于聰敏，石巖

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)旱作技術(shù)山東省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島266109）

綜述

甜菊糖甙的測(cè)定方法

于聰敏，石巖

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)旱作技術(shù)山東省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島266109）

對(duì)目前甜菊糖甙測(cè)定方法進(jìn)行了綜述，并比較了容量法、重量法、流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法、分光光度法、毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法、薄層色譜法之間的差異性和優(yōu)缺點(diǎn)。目前應(yīng)用最廣泛的測(cè)定方法是高效液相色譜法。

甜葉菊；甜菊糖甙；測(cè)定方法

甜菊糖甙是一種具有甜味的萜烯類(lèi)配糖體，分子式為C38H60O18，分子量為803，其純度在90%以上為白色粉末，純度在80%～90%之間為微黃色粉末。目前，從甜葉菊中分離出來(lái)的甜菊糖甙共有8種[1]，其中占最主要的是Stevioside成分[1，2]，約占總量的60%～70%，甜度約為蔗糖的300倍，余味長(zhǎng)而微苦如青草。其次是Rebaudioside A，約15%～20%，甜度為蔗糖的450倍，甜味最接近蔗糖。其他組分含量都較少。甜菊糖甙在人體內(nèi)不參與代謝，不產(chǎn)生熱量，作為一種非糖、非營(yíng)養(yǎng)型的甜味劑，不僅符合現(xiàn)代健康飲食的要求，還具有清熱、利尿、調(diào)節(jié)胃酸的功效，為糖尿病、肥胖癥、高血壓、心臟病等患者提供了不誘發(fā)病情的甜味代糖品，因此近年來(lái)在食品和醫(yī)學(xué)中得到廣泛應(yīng)用。甜菊糖有著廣闊的發(fā)展前景，但目前準(zhǔn)確而又簡(jiǎn)單易行檢測(cè)方法尚未建立，現(xiàn)階段用于分析甜菊糖甙含量的方法主要有容量法、重量法、流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法、分光光度法、毛細(xì)管電泳法、高效液相色譜法、薄層色譜法，現(xiàn)將這些方法的基本情況綜述如下。

1 測(cè)定方法

1.1 高效液相色譜法

高效液相色譜法是以液體作為流動(dòng)相，并采用顆粒極細(xì)的高效固定相的柱色譜分離技術(shù)。高效液相色譜對(duì)樣品的適用性廣，不受分析對(duì)象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，因而彌補(bǔ)了氣相色譜法的不足。在目前已知的有機(jī)化合物中，可用氣相色譜分析的約占20%，而80%則需用高效液相色譜來(lái)分析。國(guó)標(biāo)8270-1999中規(guī)定高效液相色譜儀的條件選擇為：

色譜柱：-NH2基柱；流動(dòng)相：乙腈∶水=80∶20；流速：1.2 mL/min；檢測(cè)：紫外檢測(cè)器、波長(zhǎng)210 nm；

進(jìn)樣量：15μL。Tomas Vanek[3]等采用反相色譜法對(duì)甜葉菊糖進(jìn)行了分離，彭啟華[4]采用了反相高效液相法測(cè)定甜菊糖甙的含量在43.80%～60.39%。劉超[5]等用高效液相測(cè)得甜葉菊糖中的Stevioside和Rebaudioside A的回收率分別是98.61%、97.40%；檢出限分別是0.3ng/L、4.7ng/L。其所用色譜儀條件選擇如下(品種未提）：

色譜柱：Kromasi1 NH2柱(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：V(乙腈)∶V(水)=75∶25；柱溫：30℃；流速：0.6mL/min；進(jìn)樣量：20μL；DAD檢測(cè)：210～400nm。

吳巖[6]等用DNA檢測(cè)器對(duì)粗甜菊糖中甜菊苷進(jìn)行測(cè)量，其線性范圍50～3000μg，平均回收率為99.5%，其含量的平均值為0.358%。

1.2 薄層色譜法

薄層色譜(thin1ayer chromatography)常用TLC表示，又稱(chēng)薄層層析，屬于固-液吸附色譜。是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種微量、快速而簡(jiǎn)單的色譜法，它兼?zhèn)淞酥V和紙色譜的優(yōu)點(diǎn)。一方面適用于小量樣品(幾到幾十微克，甚至0.01μg）的分離；另一方面若在制作薄層板時(shí)，把吸附層加厚，將樣品點(diǎn)成一條線，則可分離多達(dá)500mg的樣品。王圣剛[7]等用薄層層析法對(duì)甜葉菊種子中是否存在甜菊糖甙進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甜葉菊種子中含有甜菊糖甙。

陳慕英[8]等利用氯仿∶甲醇∶水(35∶20∶1)將甜菊提取液在硅膠G板上展開(kāi)，然后洗脫，蒽酮-硫酸顯色，最后在620nm處測(cè)出了甜菊甙單體含量。施榮福[9]等以氯仿∶甲醇∶水(30∶20∶4)為展開(kāi)劑、50%H2SO4為顯色劑，在350nm顯色波長(zhǎng)下成功地將甜菊糖甙的主要組分進(jìn)行了分離。此方法能快速分離測(cè)定不同組分，但對(duì)含量的測(cè)定還不夠精確。

1.3 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳是以彈性石英毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離的電泳分離分析方法。毛細(xì)管電泳主要有以下幾類(lèi)：(1)毛細(xì)管區(qū)帶電泳；(2)毛細(xì)管凝膠電泳；(3)膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜；(4)親和毛細(xì)管電泳；(5)毛細(xì)管電色譜；(6)毛細(xì)管等電聚焦電泳；(7)毛細(xì)管等速電泳。邵寒娟等[10]利用毛細(xì)管區(qū)帶電泳快速分離測(cè)定了甜菊糖甙，分離體系選擇50mmo1/L的Tris-硼砂；緩沖液選用pH=8；進(jìn)樣量為2psi×s；電壓選擇為25kV；柱溫選擇30℃；得到甜菊糖甙的線性范圍為0.5～7.0mg/mL。優(yōu)化條件下，得到甜葉菊提取物中的甜菊糖甙占干葉重5.48%，回收率為95.69%～100.48%。Liu J[11]等利用該方法分離測(cè)定甜菊糖苷的含量，測(cè)得其線性范圍是0.010～2.000mg/mL，檢出限是0.010mg/mL。這一方法具有以下優(yōu)點(diǎn).1)較好的分離效果；2)需要較低的成本；3)實(shí)驗(yàn)材料的用取量少。

1.4 流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法

在NaOH堿性介質(zhì)中，F(xiàn)e(CN）6-3可以直接氧化甜菊糖甙產(chǎn)生強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光。甜菊糖甙在水溶液中沒(méi)有熒光。當(dāng)加入鐵氰化鉀后，在NaOH中產(chǎn)生較強(qiáng)熒光現(xiàn)象。楊丹[12]結(jié)合流動(dòng)注射分析技術(shù)，提出了一種直接化學(xué)發(fā)光測(cè)定甜菊糖甙的新方法?；静僮鳛槿√鹑~菊葉片，105℃下干燥30min后80℃下干燥5h，稱(chēng)重研細(xì)，無(wú)水乙醇提取、振蕩過(guò)夜。次日10000r/min離心10min，取出上清用無(wú)水乙醇定容到100mL。用化學(xué)發(fā)光方法在線性范圍內(nèi)測(cè)定，重復(fù)3次。其測(cè)定甜菊糖甙的線性范圍為0.05～10mg/mL，檢出限為0.05 mg/mL，回收率為98%。楊丹用此方法測(cè)得甜葉菊干葉片中甜菊糖甙的含量為9.28%，此方法操作簡(jiǎn)單，成本低，但精確度低。

1.5 分光光度法

分光光度法是根據(jù)物質(zhì)對(duì)光都有其特定的吸收波長(zhǎng)或波長(zhǎng)范圍，根據(jù)光吸收對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性定量測(cè)定的一種方法。甜菊糖甙在酸性蒽酮試劑中定量地水解成葡萄糖，葡萄糖與蒽酮反應(yīng)，在乙醇介質(zhì)中形成黃色絡(luò)合物。此反應(yīng)容易受酸度影響。黃海水[13]等用72型分光光度儀，在最大吸收波長(zhǎng)445nm處，用不同濃度的葡萄糖溶液作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)計(jì)算得出甜菊糖甙的含量。韋業(yè)成[14]將烘干的甜葉菊葉置于索氏提取器中，用甲醇提取糖甙，經(jīng)過(guò)脫色、沉淀、溶液分配等獲得的糖甙與蒽酮在酸性條件中加熱，所得的綠色絡(luò)合物，用72型分光光度計(jì)在620nm下比色測(cè)定，韋業(yè)成[6]用此方法測(cè)得總的甜菊糖甙為含量11.5%；項(xiàng)秀珠[15]等用甜菊糖甙酸解后與蒽酮反應(yīng)液，在波長(zhǎng)622nm處有最大吸收峰，對(duì)甜菊糖甙混合物進(jìn)行測(cè)定，得其回收率均在95%以上，甜菊糖甙的總含量為11.76%。

1.6 容量法

甜菊糖甙的酸解產(chǎn)物-異甜菊醇具有羧基，能與堿溶液反應(yīng)，從而根據(jù)酸堿滴定容量關(guān)系可計(jì)算出甜菊糖甙的含量。國(guó)標(biāo)法8270-1999中取定量甜菊糖甙樣品，通過(guò)加熱酸解后用氫氧化鉀乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，同時(shí)做一空白試驗(yàn)。測(cè)得甜菊糖甙的含量可按下式計(jì)算：

c-氫氧化鉀乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的實(shí)際濃度，mo1/L；

V-氫氧化鉀乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液消耗的體積，mL；

V1-空白試驗(yàn)氫氧化鉀乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液消耗的體積，mL；

804.86 -甜菊糖甙的分子量；

m-樣品的質(zhì)量，g。

1.7 重量法

重量法是基于甜菊糖甙中的多種糖甙在酸性溶液加熱水解成非糖配基(甙元），非糖配基(甙元）能與2，4-二硝基苯肼生成苯腙沉淀，然后根據(jù)下式：

結(jié)合分子量關(guān)系計(jì)算得出甜菊糖甙含量[16]，其中1.611是甜菊糖甙與其配基異構(gòu)體二硝基苯腙的分子量比值。

2 小結(jié)

綜上所述，在化學(xué)分析法中，主要利用甜菊糖甙酸解后的物質(zhì)與酸堿反應(yīng)進(jìn)行定量測(cè)定，由于界限不是十分明確，影響測(cè)定，易產(chǎn)生較大誤差。儀器分析中，分光光度法測(cè)定的是甜菊糖甙總甙量，不能更好地鑒定分離甜菊糖甙各種成分。毛細(xì)管電泳法出結(jié)果時(shí)間短，但前期處理耗時(shí)太長(zhǎng)，另外對(duì)儀器要求高，操作精細(xì)，不利于甜菊糖甙的快速測(cè)定。薄層層析在對(duì)于甜菊糖甙的定性測(cè)量中十分有效，能迅速測(cè)其有效成分，但在甜菊糖甙的含量測(cè)定中需要借助于薄層色譜儀，薄層色譜測(cè)定法較高效液相色譜法測(cè)定速度快，花費(fèi)低，而高效液相色譜法較為準(zhǔn)確，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，二者可以結(jié)合使用，薄層色譜法作為一個(gè)初步的篩選過(guò)程，高效液相色譜法做更深入的測(cè)量。

綜合各種因素，從測(cè)量的時(shí)間、精度以及成本進(jìn)行綜合比較可以看出，高效液相色譜是目前應(yīng)用最為普遍的一種測(cè)定方法，因?yàn)樗刹僮餍詮?qiáng)，有多種可配檢測(cè)器，可檢測(cè)多種樣品，具有高效，準(zhǔn)確，快速，簡(jiǎn)單，易操作等優(yōu)點(diǎn)。

[1]GEUNS J M C.Stevioside[J].Phytochemistry，2003，64：913-921.

[2]常麗娟，王竹天，楊大進(jìn).甜菊糖苷化學(xué)分析法研究概況[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)(衛(wèi)生學(xué)分冊(cè))，2007(3)：197-200

[3]Tomas Vanek，A1es Nepovym，Pave1 Va1ycek.Journa1 of food composition and ana1ysis，2001(14).383.

[4]彭啟華，樊紹文，王文龍.高效液相色譜法分離和測(cè)定甜菊甙[J].色譜，1985，2(1）：6-10.

[5]劉超，李來(lái)生，許麗麗，等.高效液相色譜法測(cè)定甜葉菊糖中的甜菊苷和萊鮑迪苷A[J].分析實(shí)驗(yàn)室，2007，26(7）：23-26.

[6]吳巖，楊長(zhǎng)志，劉永，等.高效液相色譜法測(cè)定甜葉菊粗糖苷中甜菊苷的含量[J].食品工業(yè)科技，2007(7）：214-215.

[7]王圣剛，王貴民.薄層層析法分析甜葉菊種子糖苷[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2007(4）：48.

[8]陳慕英，于喜水，孫玉華，等.甜菊甙類(lèi)的研究[J].中醫(yī)藥信息，2001(3）：23-24.

[9]施榮福，史作清，馮君謙，等.食品飲料中甜菊甙的檢測(cè)方法[J].中國(guó)食品添加劑，1994(3）：19-23.

[10]邵寒娟，胡涌剛，丁亮，等.毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離測(cè)定甜菊主要甜味成分甜菊苷[J].廈門(mén)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001(1）：150-156.

[11]LIU J.Separation and determination of stevia sweeteners by capi11ary e1ectrophoresis and high perofrmance 1iquid chromatography[J].Journa1 of Liquid Chromatography，1995，18(9).1703-1719.

[12]楊丹，郝再斌.流動(dòng)注射化學(xué)發(fā)光法測(cè)定甜葉菊糖苷[J].化學(xué)工程師，2005(4）：23-24.

[13]黃海水，林靜.甜菊糖甙總甙量的快速測(cè)定[J].廈門(mén)大學(xué)學(xué)報(bào)，1990，29(3）：354-355.

[14]韋業(yè)成.甜葉菊總甙定量測(cè)定的新方法[J].食品科學(xué)，1983(7）：25-27.

[15]項(xiàng)秀珠，郭秀珠，黃品湖.甜菊甙含量的測(cè)定方法研究[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，1996(2）：97-99.

[16]李玉秀，陳錦濤，馬永明.甜菊糖甙的提取、測(cè)定和利用[J].亞熱帶植物科學(xué)，1981(2)：19-26.

Determination Methods of Stevioside

YU Cong-min，SHI Yan (Key Laboratory of Drought-resistant Technology,Qingdao Agricultural University,Qingdao 266109,China)

The methods for the determination of stevioside were summarized.The advantages and disadvantages of the methods were compared.The most important approach between the methods is the high performance 1iquid chromatography.

Stevia rebaudiana Bertoni;Stevioside;Determination methods

雜566.9

A

1007-2624(2009）01-0065-03

2008-03-04

于聰敏(1984-），女，在讀碩士，主要從事作物栽培生理研究。

石巖，E-mai1.yanshi@qau.edu.cn