大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)不同時間3β-羥基類固醇脫氫酶的表達(dá)

畢宏達(dá) 王曉云 周廣東 劉 偉 李 鳴 邢 新

大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)不同時間3β-羥基類固醇脫氫酶的表達(dá)

畢宏達(dá) 王曉云 周廣東 劉 偉 李 鳴 邢 新

目的探討通過差速貼壁法獲得的7天齡、3周齡大鼠睪丸間質(zhì)內(nèi)細(xì)胞的細(xì)胞群體構(gòu)成、體外培養(yǎng)不同時間3β-羥基類固醇脫氫酶（3β-HSD）的表達(dá)水平變化，以及細(xì)胞睪酮分泌功能變化。方法聯(lián)合應(yīng)用膠原酶消化、不銹鋼濾網(wǎng)過濾及差速貼壁法獲得7天齡、3周齡雄性Wistar大鼠睪丸間質(zhì)組織內(nèi)細(xì)胞，貼壁細(xì)胞以DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)，分別對原代培養(yǎng)2 h、4 d細(xì)胞進(jìn)行3β-HSD免疫化學(xué)染色及流式細(xì)胞分析，原代培養(yǎng)細(xì)胞同時給予人絨毛膜促性腺激素（HCG）刺激，測定HCG刺激組和非刺激組各代細(xì)胞培養(yǎng)液上清中睪酮水平及其對HCG刺激的反應(yīng)。結(jié)果7天齡、3周齡鼠差速貼壁法獲得的睪丸間質(zhì)內(nèi)細(xì)胞群經(jīng)流式細(xì)胞鑒定，3β-HSD陽性細(xì)胞所占比例分別為（5.4±1.2）%、（59.2±3.2）%；培養(yǎng)4 d后，兩組3β-HSD陽性細(xì)胞比例分別為（93.6±1.2）%、（95.4±3.2）%。兩組原代培養(yǎng)細(xì)胞均有睪酮生成功能，在HCG刺激下睪酮分泌均明顯上升，7天齡組培養(yǎng)細(xì)胞睪酮分泌高峰遲于3周齡組。結(jié)論差速貼壁法獲得的7天齡、3周齡大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞群中均含有部分Leydig干細(xì)胞（Stem Leydig cells，SLCs），SLCs在體外培養(yǎng)過程中逐漸分化，表達(dá)3β-羥基類固醇脫氫酶，并產(chǎn)生睪酮。

睪丸間質(zhì)細(xì)胞差速貼壁法睪酮3β-羥基類固醇脫氫酶組織工程

因創(chuàng)傷、腫瘤等導(dǎo)致的睪丸缺失臨床上并不少見。隨著現(xiàn)代社會生活節(jié)奏加快、環(huán)境污染、人口老齡化等原因，雄激素缺乏癥呈逐年上升的趨勢。采用組織工程技術(shù)構(gòu)建具有生物學(xué)活性的雄激素分泌組織，有望成為治療上述疾病的理想治療途徑。但是，傳統(tǒng)的Leydig細(xì)胞分離技術(shù)主要采用膠原酶消化、Percoll密度梯度離心等一系列復(fù)雜方法，細(xì)胞得率低、活力差，使種子細(xì)胞的來源問題成為困擾組織工程化雄激素分泌組織研究的瓶頸。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)Leydig細(xì)胞在大鼠睪丸分離細(xì)胞中具有貼壁迅速的特點，據(jù)此建立了一種簡易快速的Leydig細(xì)胞分離技術(shù)。與傳統(tǒng)的Leydig細(xì)胞分離方法相比，差速貼壁法分離的Leydig細(xì)胞得量大、純度較高、細(xì)胞活力良好，初步解決了組織工程技術(shù)構(gòu)建雄激素分泌組織種子細(xì)胞來源的問題。用該方法獲得的Leydig細(xì)胞所構(gòu)建的組織工程化雄激素分泌組織能在較長時期維持睪酮分泌功能[1-2]。

但是，差速貼壁法所獲得的Leydig細(xì)胞具體的細(xì)胞成分目前還不清楚，其中是否含有Leydig干細(xì)胞（Stem Leydig cells，SLCs）成分尚不肯定；對不同鼠齡的大鼠采用差速貼壁法獲得的Leydig細(xì)胞成分是否完全一致仍不明確。本研究中，我們選擇兩種不同鼠齡的大鼠，以差速貼壁法獲取睪丸間質(zhì)Leydig細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，通過不同培養(yǎng)階段對Leydig細(xì)胞標(biāo)志物3β-羥基類固醇脫氫酶（3β-HSD）的檢測，深入研究經(jīng)差速貼壁法獲得大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞具體成分，探討所獲得細(xì)胞在體外培養(yǎng)中的轉(zhuǎn)化過程，以進(jìn)一步優(yōu)化雄激素分泌組織的種子細(xì)胞構(gòu)成。

1 材料與方法

1.1 睪丸間質(zhì)細(xì)胞獲取

出生后7天齡、3周齡雄性Wistar大鼠（中科院上海實驗動物中心提供）脫頸法處死，無菌取睪丸，PBS沖洗后，冰上剝離白膜及較大的血管。將0.25%膠原酶NB4（Serva，德國）與組織量按1:1比例，37℃、100次/分鐘振蕩消化至睪丸組織形狀剛好消失，曲細(xì)精管間組織松散，但曲細(xì)精管連續(xù)而無明顯斷裂時，加入2倍于消化懸液體積的培養(yǎng)液或PBS終止消化，以直徑為30 μm的不銹鋼濾網(wǎng)過濾，濾液經(jīng)1500 r/min離心5 min，所得細(xì)胞計數(shù)后以2.5×106cell/cm2的密度進(jìn)行接種。37℃、5%CO2、95%O2和100%濕度下，以無血清的DMEM/F12(1:1)培養(yǎng)液培養(yǎng)。2 h后吸棄培養(yǎng)液中未貼壁的懸浮細(xì)胞，以PBS漂洗后加入DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.2 原代及培養(yǎng)4 d后細(xì)胞成分分析

1.2.1 3β-HSD免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定

原代細(xì)胞貼壁分離后即刻行3β-HSD免疫化學(xué)染色。以4%多聚甲醛固定10 min，PBS沖洗，1.25%Triton-X 100破膜，正常羊血清封閉非特異性反應(yīng)位點，滴加兔抗人3β-HSD特異性多克隆抗體、4℃過夜，PBS沖洗一抗，滴加羊抗兔IgG第二抗體，37℃反應(yīng)30 min，DAB顯色，蘇木素核襯染，鏡下觀察。原代細(xì)胞培養(yǎng)4 d后重復(fù)上述實驗。

1.2.2 3β-HSD免疫細(xì)胞化學(xué)流式細(xì)胞儀檢測鑒定

原代細(xì)胞貼壁分離后即刻，以0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化，收集待測細(xì)胞，PBS沖洗，4%多聚甲醛固定，1%Triton-BSA進(jìn)行細(xì)胞膜穿孔，標(biāo)記兔抗人3β-HSD特異性多克隆抗體（1:100，Santa Cruz，美國）及FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG（1:1 000，DAKO，美國），流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter，USA）進(jìn)行3β-HSD陽性鑒定，檢測陽性細(xì)胞百分比。原代細(xì)胞培養(yǎng)4 d后重復(fù)上述實驗。

1.3 原代培養(yǎng)細(xì)胞睪酮分泌功能檢測

原代細(xì)胞按每孔1.0×105個接種于24孔板上，每天收集原代細(xì)胞HCG刺激組和無刺激組培養(yǎng)液上清，經(jīng)Access全自動免疫分析系統(tǒng)（RIA，微粒子發(fā)光原理）（Beckman Coulter，USA）測定睪酮水平。

2 實驗結(jié)果

2.1 差速貼壁法獲得睪丸間質(zhì)內(nèi)細(xì)胞

7天齡的Wistar大鼠睪丸去除白膜后，濕重為(0.081±0.023)g；3周齡大鼠睪丸去白膜后濕重為(1.67±0.49)g。采用差速貼壁法，7天齡大鼠每克睪丸組織濕重可獲得（0.06±0.004）×106個細(xì)胞，3周齡大鼠睪丸每克濕重收獲細(xì)胞數(shù)為（1.4±0.6）×106個。

2.2 原代培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)改變

原代培養(yǎng)2 h后，7天齡、3周齡大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞均為圓形，未鋪展(圖1-A、D)。原代培養(yǎng)12 h，7天齡大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞多數(shù)為長梭形，鏡下觀察具有高折光性，細(xì)胞聚集為條索狀，呈特征性的六邊形排列（圖1-B）；培養(yǎng)4 d后，多數(shù)細(xì)胞完全鋪展，呈拉網(wǎng)樣生長（圖1-C）。3周齡鼠睪丸間質(zhì)內(nèi)細(xì)胞原代培養(yǎng)12 h后細(xì)胞開始鋪展，呈拉網(wǎng)樣生長，其中部分細(xì)胞呈長梭形（圖1-E），培養(yǎng)過程中細(xì)胞形態(tài)無顯著改變（圖1-E、F）。

2.3 培養(yǎng)細(xì)胞成分分析

7天齡大鼠差速貼壁法獲得的睪丸間內(nèi)細(xì)胞絕大多數(shù)3β-HSD免疫化學(xué)染色陰性（圖2-A），體外培養(yǎng)4 d后絕大多數(shù)細(xì)胞表達(dá)3β-HSD（圖2-B）；經(jīng)流式細(xì)胞分析，貼壁分離即刻（5.4±1.2）%細(xì)胞3β-HSD陽性，原代培養(yǎng)4 d后3β-HSD陽性細(xì)胞比例為（93.6±1.2）%（圖3-A、B）。3周齡大鼠大部分原代細(xì)胞表達(dá)3β-HSD（圖3-C），培養(yǎng)4 d后，絕大多數(shù)梭形細(xì)胞及鋪展細(xì)胞均表達(dá)3β-HSD（圖3-D）；經(jīng)流式細(xì)胞分析，貼壁分離即刻（59.2±3.2）%細(xì)胞3β-HSD陽性，原代培養(yǎng)4 d后3β-HSD陽性細(xì)胞比例為（95.4±3.2）%（圖3-C、D）。

2.4 培養(yǎng)細(xì)胞睪酮分泌功能檢測

7天齡鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞在培養(yǎng)中睪酮分泌能力逐漸增強(qiáng)，第5天達(dá)到高峰（圖4）；3周齡鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞在培養(yǎng)第2天睪酮分泌功能達(dá)到高峰，其后逐漸下降（圖5）。兩組培養(yǎng)的睪丸間質(zhì)細(xì)胞均對HCG刺激有反應(yīng)，在HCG作用下睪酮分泌增加。

圖1 原代培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)變化

圖2 培養(yǎng)細(xì)胞3β-HSD免疫組織化學(xué)染色

圖3 培養(yǎng)細(xì)胞3β-HSD流式細(xì)胞學(xué)分析

圖47 天齡大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌能力檢測

3 討論

組織工程技術(shù)的發(fā)展可能為睪丸缺失、雄激素缺乏性疾病的治療提供理想的治療手段。作為組織工程化雄激素分泌組織的重要種子細(xì)胞，睪丸Leydig細(xì)胞的獲取一直是限制該研究深入的瓶頸。傳統(tǒng)的Leydig細(xì)胞收獲技術(shù)，是基于細(xì)胞密度差異基礎(chǔ)上、以Percoll密度梯度離心為主要手段的一系列復(fù)雜分離過程，細(xì)胞獲得量少、流失量大且活力低。本課題組在前期研究中采用差速貼壁的方法收獲Leydig細(xì)胞，初步解決了雄激素分泌組織構(gòu)建的種子細(xì)胞來源問題。但對于差速貼壁法獲得的Leydig細(xì)胞具體細(xì)胞成分了解尚少。本研究中，我們采用差速貼壁法收獲7天齡、3周齡大鼠睪丸間質(zhì)內(nèi)細(xì)胞，通過細(xì)胞培養(yǎng)觀察、免疫組織細(xì)胞化學(xué)染色、流式細(xì)胞術(shù)分析以及細(xì)胞生物學(xué)活性檢查等方法，證實了經(jīng)差速貼壁法，從不同鼠齡的大鼠睪丸內(nèi)獲得的Leydig細(xì)胞中均含有一定比例的SLCs，不同鼠齡大鼠睪丸Leydig細(xì)胞群中干細(xì)胞比例是不同的，但在體外培養(yǎng)過程中所獲得的SLCs均逐漸分化，獲得3β-HSD酶活性。

睪丸SLCs是具有向Leydig成體細(xì)胞定向分化能力的間充質(zhì)來源干細(xì)胞，大鼠的SLCs在出生后第2周(有報道最早于出生后第10天)開始向成體細(xì)胞分化，形成Leydig前體細(xì)胞（Progenitor Leydig cells，PLCs）。3β-HSD的表達(dá)與否，是SLCs與PLCs區(qū)別的重要標(biāo)志[3-4]。本研究中，我們在體外培養(yǎng)的不同時段對兩組培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行3β-HSD免疫化學(xué)染色鑒定及流式細(xì)胞分析，原代培養(yǎng)4 d后的檢測結(jié)果，證實了所獲得的細(xì)胞為純化的Leydig系細(xì)胞。而在培養(yǎng)初期（貼壁2 h），兩組均有部分細(xì)胞為3β-HSD陰性，培養(yǎng)4 d后細(xì)胞3β-HSD陽性率明顯升高。我們在培養(yǎng)過程中沒有觀察到細(xì)胞增殖現(xiàn)象，不存在陽性細(xì)胞增殖導(dǎo)致培養(yǎng)細(xì)胞3β-HSD陽性率升高的可能。因此可以肯定，培養(yǎng)初期的3β-HSD陰性細(xì)胞在培養(yǎng)過程中發(fā)生了轉(zhuǎn)化，獲得了3β-HSD活性。上述結(jié)果表明，差速貼壁法能夠獲得的7天齡、3周齡大鼠睪丸Leydig系細(xì)胞中，都含有一定比例的SLCs。但是，在DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)條件下，所獲得的SLCs很快發(fā)生了分化。

圖53 周齡大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌能力檢測

不同鼠齡的大鼠，經(jīng)差速貼壁法獲得的Leydig細(xì)胞中干細(xì)胞所占的比例存在較大差異，這種差異與大鼠睪丸Leydig細(xì)胞發(fā)育的階段特點是一致的。睪丸SLCs向成體細(xì)胞分化開始于出生后第10天，7天齡大鼠睪丸間質(zhì)內(nèi)SLCs尚處于未分化狀態(tài)，僅有少量的胎兒型Leydig細(xì)胞存在[5]。自出生后第10天開始，SLCs大量增殖、分化，產(chǎn)生成體Leydig細(xì)胞，SLCs在睪丸間質(zhì)內(nèi)的比例隨著Leydig細(xì)胞的發(fā)育成熟逐漸下降[6]。我們通過差速貼壁法獲得的睪丸間質(zhì)細(xì)胞，在7天齡大鼠組以睪丸間質(zhì)干細(xì)胞為主，在3周齡大鼠組Leydig前體細(xì)胞、成體細(xì)胞占到了較高的比例，反映了SLCs在睪丸組織內(nèi)所占比例的變化規(guī)律。

兩組大鼠Leydig細(xì)胞在培養(yǎng)過程中都檢測到睪酮分泌功能，在HCG刺激下睪酮分泌能力均明顯提高，但睪酮分泌功能變化不完全一致。3周齡組細(xì)胞中因成體細(xì)胞占到了一定比例，早期即表現(xiàn)出睪酮分泌能力，在培養(yǎng)第2天達(dá)到睪酮分泌高峰后逐漸下降；7天齡組最初睪酮分泌水平較低，在培養(yǎng)過程中細(xì)胞逐漸獲得睪酮分泌活性，分泌高峰出現(xiàn)在培養(yǎng)第5天。上述結(jié)果說明，SLCs有助于睪丸Leydig細(xì)胞維持睪酮分泌的持續(xù)時間。在成年動物體內(nèi)，雄激素來源主要依賴于睪酮分泌功能最旺盛的成體Leydig細(xì)胞，而成體Leydig細(xì)胞為終末分化細(xì)胞，不具備增殖能力，其數(shù)量的穩(wěn)定依靠SLCs維持。我們以前構(gòu)建的雄激素分泌組織在較長時間（6個月）內(nèi)維持睪酮分泌能力，與差速貼壁法獲得的Leydig細(xì)胞中含有一定量的SLCs不無關(guān)系。

純化的SLCs在特殊設(shè)計的培養(yǎng)體系內(nèi)能夠維持細(xì)胞表型穩(wěn)定，持續(xù)增殖[6]。本研究中，我們獲得的SLCs未出現(xiàn)增殖現(xiàn)象，并且細(xì)胞在培養(yǎng)過程中很快出現(xiàn)分化。一方面是由于目前的培養(yǎng)體系不利于細(xì)胞擴(kuò)增；另一方面，差速貼壁法獲得的細(xì)胞群中，各級Leydig細(xì)胞成分混雜在一起，細(xì)胞共培養(yǎng)通常會促使干細(xì)胞分化。通過改善細(xì)胞培養(yǎng)體系、細(xì)胞純化等措施，有望實現(xiàn)差速貼壁法獲得的SLCs的穩(wěn)定體外擴(kuò)增，并通過調(diào)節(jié)種子細(xì)胞中干細(xì)胞比例的方式，優(yōu)化雄激素分泌組織種子細(xì)胞的構(gòu)成，實現(xiàn)組織工程化雄激素分泌組織維持長期、穩(wěn)定的睪酮分泌功能。

綜上所述，經(jīng)差速貼壁法獲得的睪丸間質(zhì)細(xì)胞群中含有一定比例的SLCs，其比例隨著動物年齡的不同而存在一定差異，體外培養(yǎng)過程中SLCs能夠分化為有睪酮分泌功能的成體細(xì)胞，有助于差速貼壁法獲得的細(xì)胞群睪酮分泌功能的持續(xù)。但是，差速貼壁法獲得的睪丸Leydig系各種細(xì)胞成分的純化、增殖，仍需進(jìn)一步深入研究。

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Expression of 3β-Hydroxysteroid Dehydrogenase in Rat Leydig Cells Cultured by Differential Adhesion In Vitro

BI Hongda1,WANG Xiaoyun1,ZHOU Guangdongi2,LIU Wei2,LI Ming1,XING Xin1.
1 Department of Plastic Surgery, Changhai Hispital,Second Military Medical University,Shanghai 200433,China.2 Shanghai Laboratory of Tissue Engineering, Shanghai Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding auther:XING Xin.

ObjectiveTo investigate the constitution of cells population,changes in 3β-hydroxysteroid dehydrogenase (3β-HSD)expression and androgen productivity in rat Leydig cells cultured by differential adhesion during 4 days primary culture.MethodsTestes from 7 days and 3 weeks old rats were harvested,then Leydig cells were isolated by using collagenase dispersion,stainless steel mesh infiltration and differential adhesion.3β-HSD expression in cultured cells was observed by immunohistochemistry and flow Cytometry analysis immediately after cell isolation and 4 days later.Testosterone level in isolated Leydig cells with or without HCG stimulation was also tested.ResultsIn 7 days group and 3 weeks old group 3β-HSD positive rates in cultured cells were 5.4±1.2%and 59.2±3.2%respectively after isolation immediately.4 days affer culture,most of the cultured cells(93.6±1.2%in 7 days old group,95.4±3.2%in 3 weeks old group)became 3β-HSD positive.Testosterone level,increased by HCG stimulation,in cultured cells from both groups.ConclusionLeydig cells obtained by differential adhesion from 7 days and 3 weeks old rats consist Stem Leydig cells(SLCs).These SLCs were differentiated and gained 3β-HSD activity during cell culture.

Leydig Cell;Differential Adhesion;Testosterone;3β-hydrosteroid dehydrogenase;Tissue Engineering

Q813.1+1

A

1673－0364（2009）－01－0007－05

2008年12月11日；

2009年1月14日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.01.003

200433上海市第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院整形外科（畢宏達(dá)，王曉云，李鳴，邢新）；200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院，上海組織工程重點實驗室（周廣東，劉偉）。

邢新。