綠色熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)與發(fā)展

朱　杰　吳　平

文章編號：1005－6629(2009)01－0049－04中圖分類號：G633.8文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

生物發(fā)光是一個很普遍的生物學(xué)現(xiàn)象。早期的生物研究大多涉及分類、形成和生態(tài)方面，后來重點轉(zhuǎn)移到生態(tài)、生化的研究，目前已進(jìn)入分子生物學(xué)的研究水平。從不同生物體內(nèi)提取的熒光蛋白的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)不盡相同。迄今，腔腸動物門多管水母屬的維多利亞多管水母（aequorea victoria）的發(fā)光蛋白系統(tǒng)研究得較為深入。

多管水母體內(nèi)存在著兩種發(fā)光蛋白，即光蛋白——水母素（aequorin）和綠色熒光蛋白（GFP，green fluorescent protein）。光蛋白作為分子標(biāo)記及Ca2+的生物學(xué)指示劑，已被成功地應(yīng)用于哺乳動物、植物、酵母、大腸桿菌細(xì)胞，用于檢測很多重要的生理學(xué)和病理學(xué)反應(yīng)。GFP作為良好的細(xì)胞、發(fā)育、分子生物學(xué)的活體標(biāo)記，用于監(jiān)測各種體系中的基因表達(dá)、蛋白定位以及多種細(xì)胞活動。利用GFP進(jìn)行示蹤的研究范圍相當(dāng)廣泛，從細(xì)胞生物學(xué)的基礎(chǔ)研究如細(xì)胞骨架和細(xì)胞分化、細(xì)胞器動力學(xué)和囊泡跟蹤，到一些熱門的前沿和學(xué)科和技術(shù)領(lǐng)域，如器官移植、基因治療、神經(jīng)生物學(xué)等等。

日本科學(xué)家下村修（Osamu Shimomura）、美國科學(xué)家馬丁·沙爾菲（Martin Chalfie）和美籍華裔科學(xué)家錢永?。≧oger Y. Tsien）因在發(fā)現(xiàn)和研究綠色熒光蛋白方面做出貢獻(xiàn)而分享了2008年的諾貝爾化學(xué)獎。他們的工作不但在科學(xué)上對化學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有重要的意義，而且也與人們的日常生活密切相關(guān)，對于提高人類的生活品質(zhì)以及進(jìn)一步改善人類的健康有十分重要的意義。

1研究GFP的時間線索

GFP從最初被發(fā)現(xiàn)到今天廣為應(yīng)用，經(jīng)歷了半個多世紀(jì)的時間。首先簡單回顧一下這半個多世紀(jì)內(nèi)和GFP相關(guān)的主要事件。

1955年人們首次注意到水母體內(nèi)的綠色熒光物質(zhì)。

1962年下村修從維多利亞多管水母中提取并分離了GFP，證實了綠色熒光物質(zhì)是一種蛋白質(zhì)。它的溶液在日光下略呈綠色，在白熾燈下略顯黃色，而在紫外燈下則發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光。

1969年之前稱為綠色蛋白質(zhì)（green protein）得名“綠色熒光蛋白”。

1974年研究發(fā)現(xiàn)光蛋白和GFP兩種分子之間會發(fā)生能量轉(zhuǎn)移（圖2）。

1979年下村修找到了GFP中的生色基團(tuán)（Chromophore）（圖3，圖5）。

1985年普臘石（Douglas Prasher）根據(jù)蛋白質(zhì)的氨基酸順序拿到了光蛋白（水母素）的基因。

1992年普臘石拿到了GFP的基因。

1993年GFP中生色基團(tuán)的結(jié)構(gòu)被確認(rèn)。

1994年沙爾菲通過大腸桿菌和線蟲研究獲得了GFP的生色機(jī)理；是年，第一種藍(lán)色熒光蛋白被報道，并提到了它可用于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）實驗中。

1995年研制出了增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP），它的轉(zhuǎn)錄速度比野生GFP快四倍。

1996年得到了野生GFP和EGFP的晶體結(jié)構(gòu)，錢永健在EGFP的基礎(chǔ)上，利用突變技術(shù)，設(shè)計并研制出黃色熒光蛋白。

1997年光蛋白和GFP被用于Ca²⁺的敏感指示劑。

1999年后各種各樣的熒光蛋白被發(fā)明、改造并用于科學(xué)研究。

在研究GFP的50多年間，2008年諾貝爾化學(xué)獎的三位得主做出了至關(guān)重要的貢獻(xiàn)。

2下村修與維多利亞水母

在下村修以前就有人研究過生物發(fā)光現(xiàn)象，例如螢火蟲發(fā)出熒光，是由熒光酶（luciferase）作為酶催化氧化底物分子熒光素（luciferin）以后產(chǎn)生熒光。而蛋白質(zhì)本身發(fā)光，無需底物，起源是下村修的研究。

1962年，下村修和約翰森等在《細(xì)胞和比較生理學(xué)雜志》上報道，他們分離純化了維多利亞多管水母中的發(fā)光蛋白—水母素。據(jù)說下村修用水母提取發(fā)光蛋白時，有天下班前，他將產(chǎn)物倒進(jìn)水池里。臨出門前關(guān)燈，回望了一眼水池，見到水池閃閃發(fā)光。因為水池也排放有養(yǎng)魚缸的水，他懷疑是魚缸成分影響了光蛋白。然而不久之后，他便確定鈣離子能增強(qiáng)光蛋白發(fā)光。

1963年，他和另一位研究者約翰森在《科學(xué)》雜志報道鈣和光蛋白發(fā)光的關(guān)系。其后Ridgway和Ashley提出可以用光蛋白來檢測鈣濃度，創(chuàng)造了檢測鈣的新方法。鈣離子是生物體內(nèi)的重要信號分子，光蛋白成為第一個有空間分辨能力的鈣檢測方法，是目前仍用的方法之一。

其實早在1955年，Davenport和Nicol就發(fā)現(xiàn)水母可以發(fā)出綠光，但不知其因。在1962年下村修和約翰森在那篇純化光蛋白的文章中，有個注腳，說還發(fā)現(xiàn)了另一種蛋白，它在日光下略呈綠色，在白熾燈下略顯黃色，而在紫外燈下則發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光。其后他們仔細(xì)研究了其發(fā)光特性。1974年，通過純化他們得到了這種蛋白，當(dāng)時稱之為綠色蛋白，即現(xiàn)在所謂的稱綠色熒光蛋白。Morin和Hastings提出光蛋白和GFP之間可以發(fā)生能量轉(zhuǎn)移。光蛋白在鈣刺激下會發(fā)光，其能量可轉(zhuǎn)移到GFP，刺激GFP發(fā)光（圖2）。

GFP是一種酸性球狀蛋白質(zhì)，它的發(fā)射光譜在505 nm具有吸收峰；激發(fā)光譜則在395 nm和470 nm具有吸收高峰（圖4）。

只有完整的GFP分子才會產(chǎn)生生物熒光，但與熒光的產(chǎn)生直接有關(guān)的是GFP分子中一小段被稱為生色基團(tuán)的部位。在GFP的初級氨基酸序列上，第65個至第67個氨基酸（Ser-Tyr-Gly）形成環(huán)狀六肽三體，以共價鍵與GFP蛋白肽鍵骨架相連（圖5）。生色基團(tuán)形成的機(jī)理目前尚不清楚，但在有分子氧存在的條件下，酪氨酸氧化成脫氫酪氨酸，并環(huán)化形成六肽，這可能是形成色基的必然過程。下村修最先推導(dǎo)了水母GFP色基結(jié)構(gòu)，后來又進(jìn)行了進(jìn)一步驗證與修改。

下村修本人對GFP的應(yīng)用前景不感興趣，也沒有意識到應(yīng)用的重要性。但他的研究卻切切實實地對之后的生物科學(xué)起到了革命性的作用。當(dāng)他離開普林斯頓到Woods Hole海洋研究所后，他的同事普臘石（Douglas Prasher）對生物示蹤分子非常感興趣。1985年普臘石和日裔科學(xué)家Satoshi Inouye獨立根據(jù)蛋白質(zhì)順序拿到了光蛋白的基因（準(zhǔn)確地說是cDNA）。1992年，普臘石拿到了GFP的基因。有了cDNA，一般生物學(xué)研究者就能很好地應(yīng)用它，比使用蛋白質(zhì)更為方便。

1996年，GFP的晶體結(jié)構(gòu)也被研究得到，它是一個由11個β－折疊的蛋白質(zhì)以一個α－螺旋蛋白質(zhì)為中心軸所形成的籠狀圓柱體，生色基團(tuán)是α－螺旋蛋白質(zhì)的重要組成部分，它的位置非常接近這個籠狀圓柱體的中心位置（圖6）。另一種平面的GFP表示方式如圖7，其中綠色的代表β－折疊，紅色的代表α－螺旋。

3沙爾菲將GFP應(yīng)用于生物示蹤

將GFP表達(dá)到其他生物體這項工作，1994年由兩個實驗室獨立進(jìn)行：美國哥倫比亞大學(xué)做線蟲的沙爾菲實驗室，和加州大學(xué)圣迭哥分校、Scripps海洋研究所的兩位日裔科學(xué)家Inouye和Tsuji。

沙爾菲在之前的工作中一直和Caenorhabditis elegans（一種被廣泛用于生物研究的線蟲）打交道。C. elegans這種線蟲只有959個細(xì)胞的一個腦，并且其三分之一的基因和人類基因有關(guān)。更重要的是，C. elegans是透明的，研究人員可以很方便的應(yīng)用顯微鏡對其進(jìn)行觀察研究。

1988年當(dāng)沙爾菲得知GFP后，他意識到可以使用這一工具對C. elegans進(jìn)行研究，它可以作為變化的綠色信號對線蟲不同細(xì)胞間的活動進(jìn)行示蹤觀察。他將GFP基因與其他不同基因結(jié)合成可發(fā)出熒光的蛋白質(zhì)的想法付諸于實踐后，就能觀察到細(xì)胞中不同蛋白質(zhì)的形成。

沙爾菲使用DNA技術(shù)，將GFP的基因作為一個片段注射到成熟的線蟲的性腺細(xì)胞核中（圖7A），由于線蟲是雌雄同體，它可以使自已受精。GFP基因就出現(xiàn)在它的卵中（圖7B），這些卵分裂后形成新的細(xì)胞核在紫外光照射下可發(fā)出熒光（圖7C和D），圖7E中顯示了兩個這樣的細(xì)胞核。

光蛋白和GFP都有重要的應(yīng)用，但光蛋白是熒光酶的一種，它需要熒光素才能發(fā)光，而GFP蛋白質(zhì)本身即能發(fā)光，在原理上有重大突破。在上世紀(jì)90年代，科學(xué)家一般認(rèn)為熒光物質(zhì)在細(xì)胞中是通過許多步驟得到，每一步都需要蛋白質(zhì)來控制，并且此過程需要一些特殊的蛋白質(zhì)（熒光素）來產(chǎn)生GFP中的生色基團(tuán)。但沙爾菲用實驗證實了這個假設(shè)是錯誤的。沙爾菲的研究向人們展示了綠色熒光蛋白作為發(fā)光的示蹤分子的作用。

當(dāng)時沙爾菲的論文引起了巨大轟動，很多生物學(xué)研究者紛紛將GFP引入自己的系統(tǒng)。在一個新系統(tǒng)表達(dá)GFP就能在《自然》、《科學(xué)》上發(fā)表文章，其實不過是跟風(fēng)性質(zhì)，沒有原創(chuàng)性。

將GFP用作示蹤分子，具有以下優(yōu)點：①熒光穩(wěn)定；②檢測方便；③無種屬特異性，也沒有細(xì)胞種類和位置的限制；④GFP對受體細(xì)胞基本無毒害；⑤由于其他生物本身不含有GFP，因此不會出現(xiàn)假陽性結(jié)果；⑥不需任何反應(yīng)底物和輔助因子；⑦可制成永久標(biāo)本；⑧靈敏度高。

盡管GFP作為報告基因或示蹤分子有許多優(yōu)點，但野生GFP發(fā)出的熒光較弱。其次，熒光反應(yīng)不是酶反應(yīng)，不能通過添加某些物質(zhì)來加強(qiáng)信號，且不易對熒光進(jìn)行定量檢測。另一方面，GFP基因在植物細(xì)胞內(nèi)的表現(xiàn)頻率并不高，甚至在某些植物細(xì)胞中并不表現(xiàn)。所以有更多的科學(xué)家對GFP進(jìn)行了改進(jìn)。

從1961年到1974年，下村修和約翰森的研究遙遙領(lǐng)先，而很少被人注意。在1974年以后，特別是八十年代后的后繼工作，很多研究生都能夠完成。其中例外的是錢永健所在實驗室所發(fā)現(xiàn)的變種出現(xiàn)新顏色，這一發(fā)現(xiàn)卻非顯而易見。

4錢永健改造并發(fā)展了GFP的應(yīng)用

隨著生物信息學(xué)、定點突變，DNA－shuffling等一系列理論和技術(shù)的應(yīng)用，綠色熒光蛋白的家族成員不斷擴(kuò)大，出現(xiàn)熒光光譜、溫度敏感性等改變的多種變異型。具有不同光譜特性的GFP突變體的獲得拓寬了GFP的應(yīng)用范圍，解決了許多單獨運(yùn)用GFP不能解決的問題。GFP基因的改進(jìn)目前主要通過以下幾個途徑得到突變體GFP：①更換GFP生色團(tuán)氨基酸；②改變堿基組成；③除去GFP基因中隱蔽剪接位點；④插入植物內(nèi)含子；⑤更換強(qiáng)啟動子等突變體GFP；⑥增加熒光強(qiáng)度和熱穩(wěn)定性。

目前已有的具不同光譜的突變型有EBFP（增強(qiáng)型藍(lán)色熒光蛋白）、ECFP（增強(qiáng)型青色熒光蛋白）、EGFP（增強(qiáng)型綠色熒光蛋白）和EVFP（增強(qiáng)型黃色熒光蛋白），分別呈現(xiàn)藍(lán)、青、綠、黃四種顏色。至今所獲得突變型的最大發(fā)射波長為529nm，為黃綠色熒光。

錢永健是和下村修研究相關(guān)的一位重要科學(xué)家。從八十年代一開始，他的工作就非常引人矚目。同時他十分肯定下村修的工作，較早公開介紹下村修的發(fā)現(xiàn)。在他的研究工作中，有兩項重要工作都與下村修有一定聯(lián)系。

一項是研究鈣染料。1980年錢永健發(fā)明檢測Ca²⁺濃度的染料分子，1981年改進(jìn)了將染料引入細(xì)胞的方法，以后發(fā)明了更多、更好的染料，被廣泛地應(yīng)用。檢測鈣的方法有三種：選擇性電極、光蛋白、鈣染料。在錢永健研制的鈣染料沒有出現(xiàn)以前，具有空間檢測能力的只有光蛋白，但當(dāng)時光蛋白需要注射到細(xì)胞內(nèi)，應(yīng)用不方便。錢永健的鈣染料可以通透到細(xì)胞里面去。

錢永健的第二項工作是研究GFP。1994年起，錢永健開始研究并改造GFP，并獲得了多項發(fā)現(xiàn)。世界上用的大多數(shù)是錢永健實驗室改造后的變種。改造后的GFP促進(jìn)了生色基團(tuán)的折疊，改善了其熒光特性，甚至可以得到紅色、黃綠色、藍(lán)色等多種顏色的熒光蛋白，有的可激活、可變色，大大拓寬了GFP研究的領(lǐng)域。他被公認(rèn)為這方面的先驅(qū)。

錢永健對人們理解GFP及GFP族的化學(xué)熒光特性做出了重要的貢獻(xiàn)，他使不同的GFP產(chǎn)生的熒光顏色覆蓋了整個可見光譜，同時他改善了生色基團(tuán)，增強(qiáng)了GFP的熒光效應(yīng)，也使熒光的穩(wěn)定性增強(qiáng)。他發(fā)展了GFP，使之成為極有效的研究動態(tài)生命過程的基因標(biāo)記工具。

5結(jié)束語

科學(xué)上一個偶然的發(fā)現(xiàn)往往會引起巨大的科學(xué)革命，新工具的出現(xiàn)會使研究取得意想不到的新成果。當(dāng)年下村修研究了GFP，但他并沒有意識到GFP重要的應(yīng)用前景。沙爾菲恰恰在自己的實驗研究過程中采用了最新的GFP研究成果，并發(fā)展了GFP的應(yīng)用領(lǐng)域。而當(dāng)今世界上用的GFP大多數(shù)是錢永健實驗室改造后的變種。

獲得2008年諾貝爾化學(xué)獎的三位科學(xué)家在發(fā)現(xiàn)和研究GFP的過程中各有貢獻(xiàn)，而且可以看出他們的研究是一脈相承的。隨著分子生物學(xué)理論與技術(shù)的發(fā)展，對GFP研究的進(jìn)一步深入，GFP在分子生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)一步加強(qiáng)。GFP工程，包括GFP蛋白工程和GFP基因工程，尤其GFP基因作為新型報告基因越來越受到關(guān)注。當(dāng)然在應(yīng)用GFP作為研究工具時，也遇到了一些問題。例如將GFP作為選擇標(biāo)記基因成功構(gòu)建多種表達(dá)外源基因的重組質(zhì)粒時發(fā)現(xiàn)一些因素影響著GFP的檢測。此外，在細(xì)胞生物學(xué)的研究過程中發(fā)現(xiàn)新生GFP通過折疊和加工成為具有活性的形式過程十分緩慢。但隨著生物技術(shù)的發(fā)展，對GFP的基礎(chǔ)理論研究的進(jìn)一步深入和新型突變體的不斷出現(xiàn)，有理由相信這些問題終將會得到解決，從而使GFP更好地為科學(xué)研究服務(wù)。

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