結(jié)核分支桿菌耐藥基因的雜交檢測

韓中波　周亞麗

【摘要】 目的 采用PCR-反向斑點(diǎn)雜交檢測結(jié)核分支桿菌中rpoB基因、KatG基因和rpsL基因突變。評價(jià)該方法檢測結(jié)核分支桿菌利福平(RFP)、異煙肼(INH)和鏈霉素耐藥性，探討直接檢測結(jié)核患者痰標(biāo)本的可行性。方法 用PCR-反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)分析對75株臨床分離株和45例肺結(jié)核患者涂陽痰標(biāo)本進(jìn)行rpoB、rpsL和KatG基因突變的檢測。結(jié)果 臨床耐藥株分離株進(jìn)行rpoB、rpsL和KatG基因突變的檢測，其突變率分別為83．9％、62．5％、57．1％。肺結(jié)核患者涂陽痰標(biāo)本中耐藥株突變率分別為81．0％、60．0％、52．9％。結(jié)論 rpoB基因、KatG基因和rpsL基因突變與結(jié)核分支桿菌耐利福平、異煙肼和鏈霉素密切相關(guān)，應(yīng)用PCR-反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)可快速檢測結(jié)核分支桿菌對異煙肼、鏈霉素和利福平耐藥性。PCR-反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)有望成為結(jié)核分支桿菌耐藥性檢測的重要方法之一。

【關(guān)鍵詞】結(jié)核分支桿菌；反向斑點(diǎn)雜交；藥物耐受性

近年來全球結(jié)核病呈現(xiàn)死灰復(fù)燃的趨勢，其主要原因是耐藥(DR-TB)和耐多藥(MDR-TB)結(jié)核病的廣泛分布和迅速傳播。異煙肼(INH)、鏈霉素(SM)、利福平（RFP）作為結(jié)核病治療中最主要的一線抗結(jié)核藥物，對其耐藥性的研究日益受到重視。傳統(tǒng)的結(jié)核分支桿菌耐藥性測定由于需要6～8周時(shí)間，不能及時(shí)指導(dǎo)臨床用藥。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，對結(jié)核菌的耐藥機(jī)制有了進(jìn)一步認(rèn)識(shí)，認(rèn)為結(jié)核分支桿菌耐異煙肼的產(chǎn)生是過氧化氫酶－過氧化物酶的編碼基因KatG基因的缺失和突變有關(guān)，也inhA基因突變也有相關(guān)性；耐鏈霉素的產(chǎn)生是由于其核糖體蛋白S12編碼基因rpsL和16SrRNA的編碼基因rrs的缺失和突變所導(dǎo)致；結(jié)核分支桿菌耐RFP與其核心區(qū)域rpoB基因突變有關(guān)^[1、2]。筆者采用采用PCR－反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)分別對肺結(jié)核患者痰標(biāo)本臨床分離株和結(jié)核患者痰標(biāo)本直接進(jìn)行KatG基因、rpsL基因、rpoB基因的突變檢測，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1．1 標(biāo)本來源 75株臨床分離株和45例肺結(jié)核患者涂陽痰標(biāo)本均來自吉林市結(jié)核病防治研究所，其中31例耐RFP，28例耐INH，24例耐SM。 45例肺結(jié)核患者涂陽痰標(biāo)本按結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)規(guī)程進(jìn)行菌種鑒定及藥敏實(shí)驗(yàn)證實(shí)為結(jié)核分支桿菌，其中21例耐RFP，17例耐INH，20例耐SM。

1．2 細(xì)菌DNA的制備^[3]臨床分離株DNA用常規(guī)酚／氯仿抽提法提取標(biāo)本中DNA。

1．3 PCR擴(kuò)增 采用25 ul反應(yīng)體系，4×dNTPs終濃度為0．2 mmol／L，Bio-標(biāo)記引物終濃度為0．2 umol／L，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃變性I min，58℃退火1 min，72℃延伸I min，循環(huán)30次，最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳。紫外檢測出現(xiàn)267 bp條帶。

1．4 雜交檢測 將點(diǎn)有探針的硝酸纖維素膜裝入雜交袋中，加入雜交液放置水浴鍋中進(jìn)行預(yù)雜交：45℃×30 min。將Bio-標(biāo)記引物的PCR擴(kuò)增陽性產(chǎn)物變性：95 ℃×l0 min，取出迅速放入冰盒中，每ml雜交液一般加 l0ul變性的擴(kuò)增產(chǎn)物，放置水浴鍋中進(jìn)行雜交：45℃×30 min。洗膜：洗液1 、45℃× 3 min，洗液2 、45℃×3 min。SA-AP：用l：1000的稀釋液(洗液I)與膜在37℃作用30 min。洗膜：洗液I、45℃× 3 min，洗液II 、45℃×3 min。顯色：每毫升洗液I加入NBT 6．6ul、BICP 3．3ul混勻，將配好的顯色液加入雜交袋中，閉光37℃顯色5 min，觀察結(jié)果

2 結(jié)果

應(yīng)用PCR-反相斑點(diǎn)雜交技術(shù)檢測rpoB、rpsL和KatG基因突變結(jié)果（見表1、2）。75株臨床分離株進(jìn)行rpoB、rpsL和KatG基因突變的檢測，PCR擴(kuò)增均為陽性，其耐藥株突變率分別為83．9％、62．5％、57．1％，其敏感株突變率分別為0、0、2．1％。

45例肺結(jié)核患者涂陽痰標(biāo)本進(jìn)行rpoB、rpsL和KatG基因突變的檢測，其耐藥株突變率分別為81．0％、60．0％、52．9％, 其敏感株突變率分別為0、4．1%、3．7％。

3 討論

目前，結(jié)核分支桿菌耐藥性測定仍多采用絕對濃度法、比例法等經(jīng)典方法。但由于結(jié)核分支桿菌生長緩慢，而耐藥結(jié)核分支桿菌生長更為緩慢，其耐藥性測定需6～8周甚至更長，不能及時(shí)指導(dǎo)臨床用藥。Bactec結(jié)核培養(yǎng)系統(tǒng)因其價(jià)格昂貴等諸多不便限制了其廣泛使用。近年來，隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展已研究發(fā)現(xiàn)結(jié)核分支桿菌耐RFP與其核心區(qū)域rpoB基因突變有關(guān)，結(jié)核分支桿菌耐異煙肼的產(chǎn)生是過氧化氫酶－過氧化物酶的編碼基因KatG基因的缺失和突變有關(guān)，也inhA基因突變也有相關(guān)性；耐鏈霉素的產(chǎn)生是由于其核糖體蛋白S12編碼基因rpsL和16SrRNA的編碼基因rrs的缺失和突變所導(dǎo)致。

本實(shí)驗(yàn)室前期通過PCR-SSCP方法得出耐異煙肼時(shí)，KatG基因突變率為63．1%，耐鏈霉素時(shí)，rpsL基因突變率為72．2%，耐利福平時(shí)，rpoB基因突變率為90．1%^[3]。但PCR-SSCP方法建立在凝膠電泳基礎(chǔ)上，難于標(biāo)準(zhǔn)化和質(zhì)量控制，難以大規(guī)模推廣。通過對KatG、inhA、rpsL、rrs基因核心易變區(qū)進(jìn)行DNA序列分析。根據(jù)基因突變的中心區(qū)域，設(shè)計(jì)靶基因，制備寡核苷酸探針，點(diǎn)樣在雜交膜上，進(jìn)行PCR－寡核苷酸探針反相斑點(diǎn)雜交。

PCR-反相斑點(diǎn)雜交檢測臨床分離株rpoB、rpsL和KatG基因突變，耐藥株的rpoB、rpsL和KatG基因突變率分別為83．9％、62．5％、57．1％，這與一些報(bào)道相近^[4]。還有2．1%的敏感株KatG基因發(fā)生突變，原因有待于進(jìn)一步探討。PCR－反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)直接檢測了54例肺結(jié)核患者痰標(biāo)本，耐藥株突變率分別為81．0％、60．0％、52．9％。突變率略低于其臨床分離株。這可能是由于痰標(biāo)本雜質(zhì)多，同時(shí)痰標(biāo)本的處理和靶DNA濃度對PCR擴(kuò)增有直接影響。PCR－反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)以其簡便、快速、靈敏并可以直接檢測未經(jīng)培養(yǎng)的痰標(biāo)本中結(jié)核分支桿菌rpoB、rpsL和KatG基因突變，可在2 d內(nèi)出結(jié)果，從而彌補(bǔ)了常規(guī)藥敏實(shí)驗(yàn)的不足，有望成為臨床耐藥性測定的重要手段之一。

參考文獻(xiàn)

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