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    人羊膜對(duì)創(chuàng)面愈合的促進(jìn)作用

    2009-02-24 09:17:06范金財(cái)蔡國斌
    中國美容醫(yī)學(xué) 2009年1期
    關(guān)鍵詞:羊膜甘油創(chuàng)面

    梁 婧 范金財(cái) 蔡國斌

    有效的創(chuàng)面覆蓋是創(chuàng)面愈合過程中的重要環(huán)節(jié)。創(chuàng)面覆蓋物種類繁多,可分為常規(guī)敷料、生物敷料和合成敷料等幾大類,具有保護(hù)創(chuàng)面、預(yù)防感染、防止體液和營養(yǎng)物質(zhì)丟失、促進(jìn)創(chuàng)面愈合等特點(diǎn)。羊膜作為生物敷料中較重要的一類,其應(yīng)用最早始于1910年,Davis首先把胎膜(羊膜+絨毛膜)作為手術(shù)替代材料來進(jìn)行皮膚移植取得成功。1913年Stem和Sabella分別報(bào)道了用羊膜來治療皮膚燒傷和皮膚潰瘍。此后羊膜被廣泛應(yīng)用于各種手術(shù):用于眼科,治療角膜缺損、結(jié)膜炎癥及缺損,效果良好[1-2];用于燒傷等創(chuàng)面的覆蓋,具有誘導(dǎo)上皮再生、減少滲出物、減輕疼痛等功能;用于顱腦、腹腔和腰椎手術(shù),可起到組織修補(bǔ)和預(yù)防粘連的作用。羊膜以其來源廣泛、取材方便、生物相容性好、抗原性低等優(yōu)點(diǎn)而被譽(yù)為“神奇之膜”。Ravishanker等[3]強(qiáng)調(diào)了在發(fā)展中國家醫(yī)院建立“羊膜庫”的重要作用。1998年在華沙建立了中央羊膜組織儲(chǔ)備庫。本文就有關(guān)羊膜的生物學(xué)特性、制備、貯存,對(duì)創(chuàng)面愈合的促進(jìn)作用及其機(jī)制,以及羊膜的生物學(xué)改良等方面綜述如下。

    1概述

    1.1 羊膜的生物學(xué)特性:羊膜是從細(xì)胞滋養(yǎng)層衍化而來,位于胎兒絨毛膜的表面,為光滑、無血管、無神經(jīng)、無淋巴的雙層透明薄膜,厚約0.02~0.5mm,是人體中最厚的基底膜。由5層構(gòu)成:①羊膜上皮:大部分為單層立方上皮,有合成、分泌和沉積基底膜和細(xì)胞外間質(zhì)成分的能力;②基底膜:由狹窄的無細(xì)胞網(wǎng)狀纖維構(gòu)成,厚度不一,含Ⅰ型膠原纖維網(wǎng)、層粘連蛋白和硫肝糖蛋白;③致密層:薄而致密,無細(xì)胞,由網(wǎng)狀纖維組成;④成纖維細(xì)胞層:是羊膜厚度的主要組成部分,由成纖維細(xì)胞和網(wǎng)狀纖維構(gòu)成;⑤海綿層:由波浪狀網(wǎng)織纖維構(gòu)成[4]。組織學(xué)及電鏡觀察,見羊膜內(nèi)層是來自內(nèi)胚層的上皮組織,包括數(shù)層鱗狀上皮細(xì)胞,但也可以見到成型的低立方形細(xì)胞;在近臍根部有時(shí)可見較厚的復(fù)層鱗狀上皮區(qū),因而證實(shí)妊娠早期的羊膜具有與胎兒皮膚極相似的結(jié)構(gòu)[5],認(rèn)為羊膜可能具有與皮膚相同的防御保護(hù)和屏障功能,在局部能起到保護(hù)創(chuàng)面不受細(xì)菌侵入,減少感染機(jī)會(huì)的作用。

    1.2 羊膜的制備及貯存

    1.2.1 羊膜的制備:嚴(yán)格按照供體醫(yī)學(xué)標(biāo)準(zhǔn),無菌條件下取新分娩的健康剖宮產(chǎn)孕婦胎盤。產(chǎn)前母體行血清學(xué)檢查排除人體免疫缺陷病毒、乙肝病毒和丙肝病毒,排除巨細(xì)胞病毒和梅毒螺旋體等感染,孕婦產(chǎn)道無淋球菌或衣原體感染病史,無其他傳染性疾病和惡性腫瘤病史。將胎盤置于超凈工作臺(tái)中,用含抗菌藥物的PBS溶液反復(fù)沖洗以去除表面的凝血塊,然后鈍性分離將羊膜與絨毛膜組織分開,去除羊膜基底面殘留的絨毛膜和血管組織,生理鹽水反復(fù)沖洗后剪成所需大小方塊,浸泡于0.1%慶大霉素溶液或1∶1000新潔爾滅中15min后即可用于創(chuàng)面。

    1.2.2 羊膜的貯存:自從Kim等首次應(yīng)用4℃、體積分?jǐn)?shù)100%的甘油保存的羊膜移植重建兔眼表獲得成功后,保存羊膜在臨床中的應(yīng)用已非常廣泛。羊膜的貯存方法很多,大致有以下幾類:

    1.2.2.1 DMEM/甘油深低溫保存法:將羊膜片放入裝有滅菌DMEM/甘油液(DMEM/甘油體積比為1∶1)的羊膜容器(經(jīng)高壓消毒的中性硅玻璃瓶),封閉瓶口置于-80℃冰箱保存。用前室溫自然解凍,并在生理鹽水中浸泡復(fù)水。

    1.2.2.2 純甘油4℃保存法:將羊膜片放入裝有消毒純甘油的羊膜容器,24h后取出羊膜片,轉(zhuǎn)移到另一純甘油瓶中,封閉瓶口抽出殘留氣體后置于4℃冰箱中保存30天后使用。用前在生理鹽水中浸泡復(fù)水。

    1.2.2.3 無水酒精保存法:將羊膜片放入裝有體積分?jǐn)?shù)為75%酒精的羊膜容器中,24h后取出轉(zhuǎn)移到另一裝有體積分?jǐn)?shù)100%酒精的容器中,4℃或室溫保存?zhèn)溆茫少A存半年,但要注意保持酒精濃度。用前在生理鹽水中浸泡復(fù)水。

    1.2.2.4 真空干燥保存法:將羊膜片放入羊膜容器中,低溫真空干燥1h,加蓋蠟封后置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。用前在生理鹽水中浸泡復(fù)水。

    目前我國基層醫(yī)院應(yīng)用最為廣泛的是純甘油4℃保存法,此方法簡便易行,經(jīng)濟(jì)安全,100%甘油作脫水和冷凍保護(hù)劑,可減輕冷凍對(duì)細(xì)胞的損傷,同時(shí)甘油對(duì)微生物還有殺滅作用;DMEM/甘油深低溫保存法因?yàn)樾枰扇∩畹蜏乩鋬鲈O(shè)備,在我國應(yīng)用較少,除了甘油的保護(hù)作用外,DMEM保存液中還含有供細(xì)胞生長的各種氨基酸、微量元素、各種維生素及緩沖系統(tǒng)的平衡液,且其Na+濃度與羊水較接近[6];無水酒精保存法來源方便,可消毒防腐,但可使組織脫水、蛋白凝固變性,是無活性保存法;真空干燥保存法使蛋白質(zhì)凝固變性,也是無活性保存,但此法不需要液體,攜帶方便。

    1.3 羊膜的敷治方法

    1.3.1創(chuàng)面處理:首先要處理創(chuàng)面,如潰瘍邊緣瘢痕增生明顯或有老化的肉芽組織應(yīng)將其切除;創(chuàng)面肉芽水腫嚴(yán)重者,可采用3%~5%高滲鹽水濕敷,消除肉芽水腫;創(chuàng)面感染嚴(yán)重者,可根據(jù)創(chuàng)面的細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果,選用有效的抗生素濕敷;對(duì)于骨外露面積較大者,可行骨鉆孔或咬除部分骨皮質(zhì)以利于肉芽生長。

    1.3.2羊膜的貼敷:徹底清創(chuàng)后以75%酒精消毒周圍皮膚,1‰新潔爾滅消毒創(chuàng)面,按創(chuàng)面大小剪取羊膜。新鮮羊膜可直接貼敷,用酒精貯存的羊膜經(jīng)外用鹽水清洗后敷于創(chuàng)面,避免酒精對(duì)創(chuàng)面的刺激。羊膜應(yīng)平整敷于創(chuàng)面,趕盡羊膜下氣體使羊膜與創(chuàng)面緊貼。羊膜邊緣應(yīng)超出創(chuàng)緣約1cm。創(chuàng)面滲出較多時(shí),可貼敷帶孔羊膜。羊膜貼敷后可暴露創(chuàng)面,也可以無菌敷料包扎。大部分創(chuàng)面在1~2天左右干燥結(jié)痂,可不必更換,直至創(chuàng)面愈合羊膜自行脫落。如膜下積膿,應(yīng)及時(shí)清除后重新貼敷羊膜。羊膜干燥后注意觀察創(chuàng)面遠(yuǎn)端的血液循環(huán)情況。

    2羊膜對(duì)創(chuàng)面愈合的促進(jìn)作用及作用機(jī)制

    2.1 加快創(chuàng)面上皮化及愈合進(jìn)程:動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用效果顯示,羊膜覆蓋創(chuàng)面后,上皮組織從創(chuàng)面周邊的皮緣向內(nèi)爬行,創(chuàng)面肉芽組織生長明顯,生長速度明顯較對(duì)照組快。其原因可能與以下因素有關(guān):①創(chuàng)面覆蓋羊膜后,膜下既沒有大量積液,減少了創(chuàng)面感染因素,又阻止了水分蒸發(fā),保護(hù)了創(chuàng)面上殘留的上皮細(xì)胞,從而促進(jìn)了創(chuàng)面的愈合[7];②羊膜細(xì)胞內(nèi)含有豐富的次級(jí)溶酶體,能使炎癥局部的肥大細(xì)胞分泌組胺潛在釋放因子,使局部血管擴(kuò)張,改善局部的血流灌注,改善創(chuàng)面局部缺血狀況;③感染的控制和局部血液循環(huán)的改善為創(chuàng)面愈合提供有利條件;④羊膜含有纖維粘連素、層粘連素、Ⅳ型膠原、硫酸乙酰肝素蛋白多糖,以及其他一些蛋白多糖大分子和一些細(xì)胞生長因子(Koizumi,NJ等研究發(fā)現(xiàn),羊膜含有高水平的EGF、KGF、HGF和bFGF等多種生長因子),有促進(jìn)細(xì)胞黏附、遷移、增值和分化等重要功能,阻止上皮細(xì)胞凋亡;⑤另外,基底膜上的Ⅳ型膠原可延長接種其上的上皮細(xì)胞生長壽命,并保持其表型[8]。

    2.2 減輕或消除創(chuàng)面疼痛:羊膜覆蓋創(chuàng)面后,具有明顯的疼痛減輕或消失作用。應(yīng)用羊膜代替表皮,可起到物理屏障作用。貼敷創(chuàng)面后隔絕與外界的接觸,減輕創(chuàng)面淺表神經(jīng)暴露因冷熱或機(jī)械性刺激引起的疼痛,還可減少水分蒸發(fā),防止創(chuàng)面枯干。此外如上文所述,羊膜細(xì)胞內(nèi)含有豐富的次級(jí)溶酶體,能使炎癥局部的肥大細(xì)胞分泌組胺潛在釋放因子,通過使局部血管擴(kuò)張改善局部的血流灌注,改善創(chuàng)面局部缺血狀況,避免創(chuàng)面組織壞死引起的疼痛。同時(shí)羊膜內(nèi)含有活性成分如神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)遞質(zhì), 能營養(yǎng)神經(jīng)、促進(jìn)神經(jīng)纖維再生。Mligiliche等[9]將羊膜細(xì)胞外基質(zhì)制成管狀誘導(dǎo)周圍神經(jīng)再生,用以修復(fù)鼠坐骨神經(jīng)缺損,發(fā)現(xiàn)合適管徑的羊膜管能誘導(dǎo)坐骨神經(jīng)再生。張琪等[10]應(yīng)用復(fù)合自體Schwann細(xì)胞的羊膜基底膜卷修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損,也證實(shí)了羊膜可以引導(dǎo)神經(jīng)再生和延伸。

    2.3 保護(hù)創(chuàng)面,減少創(chuàng)面滲出:創(chuàng)面貼敷羊膜后,漿液性滲出減少,創(chuàng)面周圍水腫減輕或消失,原色澤蒼白的創(chuàng)面逐漸轉(zhuǎn)為紅潤,羊膜逐漸形成干燥的羊膜痂,患者略有緊繃感,創(chuàng)面愈合后痂皮自行脫落,表面完整。在整個(gè)創(chuàng)面愈合過程中,羊膜發(fā)揮著一個(gè)半透膜的作用,既避免了體液大量丟失,又有效防止了膜下積液形成,使創(chuàng)面保持一定濕度。這是以羊膜的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為基礎(chǔ)的:電鏡下,見羊膜上皮細(xì)胞表面有許多微絨毛,基底部有細(xì)胞突起伸入基底膜形成足突樣結(jié)構(gòu)。細(xì)胞突起與基底膜之間通過半橋粒結(jié)構(gòu)形成緊密連接,微絨毛和橋粒連接共同在羊膜上皮細(xì)胞之間組成復(fù)雜的迷路型管道系統(tǒng),成為溝通羊膜腔與羊膜基質(zhì)的通道。同時(shí),羊膜具有許多酶參與甾體激素代謝,減輕創(chuàng)面水腫;羊膜上皮中活性物質(zhì)如IL受體拮抗劑、IL-10和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑等促進(jìn)移植區(qū)多形核中性粒細(xì)胞凋亡,利于炎癥吸收[11];某些可溶性細(xì)胞因子如抗新生血管化蛋白抑制新生血管長入,減少免疫細(xì)胞來源等。

    2.4 抑制細(xì)菌生長,預(yù)防創(chuàng)面感染:Rejzek等[12]通過實(shí)驗(yàn)觀察到羊膜覆蓋能抑制創(chuàng)面的細(xì)菌生長,其抑菌作用比同種異體皮大1 000倍,并認(rèn)為羊膜對(duì)燒傷創(chuàng)面的抗感染能力主要是由于羊膜覆蓋創(chuàng)面造成一個(gè)閉合環(huán)境,防止了細(xì)菌污染,同時(shí)使機(jī)體本身的防御能力得以在局部發(fā)揮最大的作用。羊膜孔隙數(shù)平均為2×106/mm2,孔徑為0.3~3.4μm,可允許水分和一些小分子物質(zhì)通過,而一般細(xì)菌不易通過直徑﹤5μm的孔隙[13],使其成為保護(hù)創(chuàng)面的天然屏障。另表明,羊膜內(nèi)含有抑菌因子、次級(jí)溶酶體、產(chǎn)生甾體類激素的酶等活性物質(zhì),可有效抑制細(xì)菌生長;羊膜上皮在細(xì)菌細(xì)胞壁的脂多糖或肽聚糖刺激下能產(chǎn)生β-防御素,β-防御素可能與天然免疫有關(guān)[14]。

    2.5 減少創(chuàng)面瘢痕形成:經(jīng)隨訪,羊膜覆蓋后創(chuàng)面愈合處瘢痕增生不明顯,彈性及韌性良好,柔軟耐磨。有研究表明,炎癥是刺激瘢痕形成的原因[15]。羊膜通過不同的途徑抑制創(chuàng)面炎癥反應(yīng),從而起到抗纖維化,減少瘢痕的作用:羊膜可以抑制白細(xì)胞介素表達(dá)、調(diào)整炎性趨化因子表達(dá)、誘導(dǎo)多核白細(xì)胞凋亡;通過抑制轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor TGF)β的mRNA表達(dá)來抑制成纖維細(xì)胞的活性,減少瘢痕形成?;谙抡{(diào)TGF-β2信號(hào)系統(tǒng)降低瘢痕粘連的原理, Shah等[16]發(fā)現(xiàn)在切口周圍注射中和TGF-β2的抗體時(shí)能有效抑制瘢痕形成。此外,羊膜上皮細(xì)胞含有抗炎因子,可促進(jìn)炎性細(xì)胞凋亡,抑制原有膠原過度分解,避免移植后炎性反應(yīng)的發(fā)生[17-19]。Tseng等研究發(fā)現(xiàn),羊膜可誘導(dǎo)TGR、P51,P52和P53等在創(chuàng)傷愈合中與成纖維細(xì)胞活動(dòng)有關(guān)的信號(hào)下調(diào),從而達(dá)到抗纖維化效果。Adinolfi等用免疫熒光技術(shù)證明人羊膜上皮細(xì)胞膜上不表達(dá)HLA-A、B、C及DR抗原,也不表達(dá)TGF-β2微球蛋白,而且體外羊膜上皮細(xì)胞與異基因淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)未見細(xì)胞毒T細(xì)胞產(chǎn)生,因而抗原性弱,同種異體移植排斥反應(yīng)小。羊膜含有抗新生血管化蛋白,對(duì)新生血管有一定的抑制作用。

    3羊膜的生物學(xué)改良

    近年來,很多學(xué)者通過生物工程技術(shù)對(duì)羊膜進(jìn)行生物學(xué)改良,改變羊膜結(jié)構(gòu)(去羊膜上皮細(xì)胞或改變上皮細(xì)胞性質(zhì))及成分(吸附特殊藥物,使羊膜固有化學(xué)成分發(fā)生變化),在保持羊膜基本生理特性的同時(shí)賦予其更多的生物功能,取得一定成果。

    3.1 生物復(fù)合型羊膜:以帶有活性組織細(xì)胞為主要特征的羊膜,主要用于各種原因所致的經(jīng)單純藥物治療或傳統(tǒng)羊膜移植術(shù)無效的嚴(yán)重創(chuàng)面。羊膜以其無毒性,良好的生物組織相容性,生物可降解性及降解可調(diào)節(jié)性,以及不引起機(jī)體免疫排斥反應(yīng),具有可塑性和一定的機(jī)械強(qiáng)度等生物學(xué)特性,成為組織工程中附載種子細(xì)胞的理想生物材料。羊膜附載骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、表皮細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、人胚胎干細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等種子細(xì)胞的皮膚組織工程材料,在實(shí)驗(yàn)和研究中已得到一定應(yīng)用。

    3.2 藥學(xué)羊膜:含有特定藥物成分的羊膜細(xì)胞外基質(zhì),根據(jù)所含藥物種類不同,又可細(xì)分為單一藥物型羊膜和復(fù)合型藥物羊膜。羊膜基底膜富含膠原纖維和網(wǎng)狀纖維,交織排列成網(wǎng)狀,網(wǎng)孔間隙0.5~15.0μm,能容納大量藥物分子,可吸附藥液作為“藥庫”。羊膜可自行降解,在較長時(shí)間內(nèi)逐步釋放藥物,維持局部有效的藥物濃度,成為良好的膜控半定量釋藥系統(tǒng)。

    3.3 生物復(fù)合型藥學(xué)羊膜:可稱其為超級(jí)羊膜。既載有活性組織細(xì)胞如角膜緣干細(xì)胞或多能干細(xì)胞,又含有特定藥物成分如抗生素或抗排斥藥物。

    綜上,羊膜以其來源廣泛,利用方便,柔韌性好,易延展,免疫組織相容性好,能有效支持附載種子細(xì)胞并能誘導(dǎo)其分化,符合倫理學(xué)原則等優(yōu)點(diǎn)成為生物敷料及組織工程材料的理想選擇。隨著材料工程、生物工程、組織工程和基因工程等技術(shù)的不斷發(fā)展,克服羊膜質(zhì)脆、易碎不耐壓以及易溶解等不足;尋找更能保持羊膜活性的人工羊膜制備及貯存方法;構(gòu)建更加適于并能有效附載種子細(xì)胞及其分化所需生物環(huán)境的組織工程載體材料;通過基因修飾等技術(shù)對(duì)種子細(xì)胞進(jìn)行有針對(duì)性的改良等都成為可能??傊?,羊膜的生物學(xué)改良將得到更廣泛的研究和應(yīng)用,羊膜上皮細(xì)胞,羊膜活性成分及羊膜外基質(zhì)與不同的功能細(xì)胞、生物制劑、活性藥物相互組合應(yīng)用,與新的技術(shù)完美結(jié)合,使各成分發(fā)揮其最大效應(yīng)而構(gòu)建復(fù)合型生物羊膜,應(yīng)用于創(chuàng)面的修復(fù)與皮膚缺損的治療,必將組織修復(fù)帶入一個(gè)新的領(lǐng)域。

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    [收稿日期]2008-10-21[修回日期]2008-12-30

    編輯/張惠娟

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