病理性瘢痕成纖維細(xì)胞中連接蛋白４３的免疫電鏡觀察

張娟娟　呂世軍

[摘要]目的：觀察連接蛋白43（Connexin43,Cx43）在病理性瘢痕成纖維細(xì)胞中的表達(dá)，探討Cx43及其構(gòu)成的縫隙連接在病理性瘢痕中的調(diào)控作用。方法：取正常皮膚2例、正常修復(fù)組織2例、增生性瘢痕5例、瘢痕疙瘩5例，用特異性抗體（Cx43）作為標(biāo)記物,用膠體金標(biāo)記的IgG作示蹤物進(jìn)行免疫電鏡觀察Cx43的分布與表達(dá)，并對(duì)其進(jìn)行定位, 同時(shí)觀察不同標(biāo)本成纖維細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果：Cx43在正常修復(fù)組織及正常皮膚成纖維細(xì)胞的胞漿及近胞膜上表達(dá)，且明顯集中于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；Cx43在增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的表達(dá)明顯減少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中見到少許Cx43金顆粒的聚集；瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞僅在胞漿中見到少許Cx43散在金顆粒。結(jié)論：成纖維細(xì)胞Cx43的表達(dá)下調(diào)可能是造成病理性瘢痕組織中成纖維細(xì)胞間縫隙連接細(xì)胞間通訊異常，從而導(dǎo)致病理性瘢痕發(fā)生的因素之一。

[關(guān)鍵詞]連接蛋白43；病理性瘢痕；免疫電鏡

[中圖分類號(hào)]R619+.6 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1008-6455（2009）01-0063-03

Immunoelectron-microscopy observation of Cx43 in fibroblasts of pathological scar

ZHANGJuan-juan1,LV Shi-jun2

(1.Department ofStomatological Histopathology; 2. Department ofPathology, Weifang Medical Collage, Weifang 261042,Shandong,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the role of connexin43 and gap junctional intercellular communication composed of it in pathological scar by studying expression of connexin43 in fibroblasts.MethodsThe expression, distribution and orientation of Cx43 were observed in 5 hypertrophic scars,5 keloids,2 normal repaired tissues,2 normal skin samples by immunoelectron-microscopy with special antibody for marker and gold colloidal labelled IgG for tracer. The ultrastructure of fibroblasts were also observed.ResultsIn normal skin and repaired tissues, Cx43 were largely expressed at endochylema, cell membrane, and concentrated at the rough endoplasmic reticulum. It was clearly reduced in hypertrophic scars, a few Cx43 granules were observed at the rough endoplasmic reticulum. There were hardly Cx43 granules in keloids.ConclusionLower expression of Cx43 in the fibroblasts maybe one reason of leading to pathological scar. It has a correlation between Cx43 and the abnormality of gap junctional communication channel and Cx43 may have important function in the regulation of pathological scar.

Key words: connexin43; pathological scar; immunoelectron-microscopy

增生性瘢痕(hypertrophic scar, HS)和瘢痕疙瘩(keloid, K)統(tǒng)稱為病理性瘢痕，是皮膚對(duì)創(chuàng)傷、炎癥、燒傷、外科或自發(fā)的一種過度的皮膚纖維增生性疾病，為當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。病理性瘢痕的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，對(duì)其形成機(jī)理的研究主要集中在細(xì)胞因子的生物學(xué)作用以及成纖維細(xì)胞和肥大細(xì)胞等方面[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)病理性瘢痕的發(fā)生與縫隙連接介導(dǎo)的細(xì)胞間通訊異常有密切的關(guān)聯(lián)。縫隙連接（Gap junction）散在分布于細(xì)胞間，是相鄰細(xì)胞間的直接親水性通道，為生物界普遍存在的細(xì)胞間信息交換方式[2]。連接蛋白43（Connexin43，Cx43）是真皮成纖維細(xì)胞表達(dá)最豐富的一種連接蛋白，它廣泛存在于哺乳動(dòng)物各器官、組織中，與機(jī)體許多病理生理過程有密切的聯(lián)系。我們對(duì)不同瘢痕組織成纖維細(xì)胞中Cx43的表達(dá)情況進(jìn)行了觀察，探討Cx43及其構(gòu)成的縫隙連接在病理性瘢痕中的調(diào)控作用。

1材料和方法

1.1 標(biāo)本來源及實(shí)驗(yàn)分組：本實(shí)驗(yàn)所用標(biāo)本均取自濰坊市人民醫(yī)院整形外科，包括瘢痕疙瘩（瘢痕疙瘩邊緣部，即周邊1/3半徑范圍內(nèi))5例、增生性瘢痕（增生性瘢痕邊緣部，即周邊1/3半徑范圍內(nèi)）5例及正常修復(fù)組織（組織損傷后10天左右）2例，正常皮膚2例，所有病人均未經(jīng)激光、冷凍、激素等治療。病理性瘢痕結(jié)合臨床及病理學(xué)檢查診斷明確，取材部位為頭面部、前胸、四肢等。

1.2主要試劑與儀器：兔抗人Cx43多克隆抗體 (Zymed Laboratories,USA),10nm膠體金標(biāo)記羊抗兔IgG及山羊血清封閉液購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，電鏡為日本H-7500型透射電鏡。

1.3膠體金標(biāo)記免疫電鏡：①將標(biāo)本切成1mm3大小，立即放入4%多聚甲醛中固定；②由濰坊醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)教研室電鏡室制作免疫電鏡樣品并進(jìn)行超薄切片，厚度50～70nm，載于200～300目的鎳網(wǎng)上；③1%H2O2 10min，以增進(jìn)樹脂的通透性，有利于抗體的進(jìn)入。雙蒸水洗10min×3次； ④將鎳網(wǎng)覆于正常羊血清(1:20稀釋)滴上，室溫封閉30min，TBS(pH 7.4)洗3min×3次；⑤將鎳網(wǎng)置于兔抗Cx43抗體(1:50稀釋)液滴上4℃孵育過夜。以TBS代替一抗為陰性對(duì)照。復(fù)溫30min，TBS(pH7.4)洗3min×3次，TBS(pH8.2)洗3min×3次；⑥將鎳網(wǎng)覆于膠體金標(biāo)記的羊抗兔IgG(1:20稀釋)液滴上，室溫2h，TBS(pH8.2)洗3min×3次，TBS(pH7.4)洗3min×3次；⑦1%戊二醛后固定15min，TBS(pH7.4)洗3min×3次，雙蒸水噴洗2次；⑧5%醋酸鈾(新鮮雙蒸水配制)避光染色15min，雙蒸水噴洗2次，枸櫞酸鉛染色5min，雙蒸水噴洗2次，濾紙吸干網(wǎng)緣水分，透射電鏡觀察結(jié)果。

2結(jié)果

免疫電鏡結(jié)果顯示正常皮膚組織中成纖維細(xì)胞粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、高爾基復(fù)合體等細(xì)胞器發(fā)育正常，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上有豐富的Cx43陽(yáng)性金顆粒聚集，在其基底層細(xì)胞胞漿內(nèi)及細(xì)胞接觸處亦可見Cx43陽(yáng)性金顆粒(圖1、2)；正常修復(fù)組織成纖維細(xì)胞呈梭形或不規(guī)則形，胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離和多聚核糖體豐富，高爾基復(fù)合體發(fā)達(dá)，膠原合成活躍。在其胞漿及近胞膜上大量Cx43金顆粒聚集，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上聚集尤為明顯，在兩成纖維細(xì)胞的連接處亦可見到Cx43金顆粒的聚集(圖3、4)；增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中可見到不同時(shí)期的成纖維細(xì)胞，有多個(gè)粗細(xì)不等、長(zhǎng)短不一的突起。核為卵圓形，常有切跡。核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻，在核膜下較密集，并可見到1-2個(gè)明顯的核仁。多數(shù)細(xì)胞胞漿內(nèi)可見大量擴(kuò)張的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，高爾基復(fù)合體也很發(fā)達(dá)，并可見到分泌小泡，膠原合成旺盛，細(xì)胞周圍分布有膠原原纖維。Cx43金顆粒在增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的表達(dá)明顯減少，少許粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中見到Cx43金顆粒的聚集(圖5、6)；瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞僅在胞漿中查見少許Cx43的散在金顆粒，細(xì)胞接觸部位未查見金顆粒聚集(圖7、8)。

3討論

成纖維細(xì)胞是瘢痕形成的效應(yīng)細(xì)胞，在病理性瘢痕的形成過程中起主導(dǎo)作用。成纖維細(xì)胞為何在創(chuàng)傷已經(jīng)修復(fù)后，仍處于增殖及生物合成失控狀態(tài)，是因?yàn)槌衫w維細(xì)胞的廣泛異質(zhì)性，還是細(xì)胞因子的綜合作用，或是成纖維細(xì)胞增殖與凋亡失衡導(dǎo)致，其原因尚有待研究。有研究通過粘附式細(xì)胞儀檢測(cè)證實(shí)正常瘢痕成纖維細(xì)胞間通訊正常，增生性瘢痕成纖維細(xì)胞間通訊受到抑制，瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞間通訊被阻斷[3]。另有研究發(fā)現(xiàn)，正常瘢痕成纖維細(xì)胞一旦相互接觸后則停止增殖，而增生性瘢痕中部分成纖維細(xì)胞和瘢痕疙瘩中成纖維細(xì)胞接觸后仍繼續(xù)增殖[4-5]。這些研究結(jié)果表明病理性瘢痕的形成過程中成纖維細(xì)胞間縫隙連接的異常可能是導(dǎo)致其旺盛增殖的原因之一。當(dāng)發(fā)生病理性瘢痕時(shí)，細(xì)胞間的縫隙連接通訊異常，是由于細(xì)胞內(nèi)連接蛋白的表達(dá)異常，還是連接蛋白在組裝成為縫隙連接的過程存在障礙，或是細(xì)胞間縫隙連接的開啟與關(guān)閉障礙，這些都會(huì)引起細(xì)胞間縫隙連接細(xì)胞間通訊的異常，從而影響細(xì)胞間的信息交流，導(dǎo)致病理性瘢痕的發(fā)生。

縫隙連接是由相鄰細(xì)胞間兩側(cè)質(zhì)膜的連接子（Connexon）相連接形成的通道，連接子是由六個(gè)形狀相同、功能一致的蛋白分子亞基，即連接蛋白（Connexin, Cx）圍繞中央孔道排列形成的跨膜蛋白通道。連接蛋白通常根據(jù)分子量大小來命名，目前已克隆出19種鼠類和20種人類的連接蛋白基因[6]。Cx43是由總跨度為2768堿基對(duì)的三條互補(bǔ)脫氧核糖核酸所編碼的，它編碼分子量為43kDa的含有378氨基酸的多肽，是一種非突變型抑癌基因[7]。Cx43廣泛存在于哺乳動(dòng)物各器官、組織中，其分子結(jié)構(gòu)和功能特點(diǎn)決定了它與機(jī)體許多病理生理過程有密切的聯(lián)系。Cx43表達(dá)短暫降低可促進(jìn)細(xì)胞的增殖，但隨著傷口的不斷愈合，細(xì)胞內(nèi)表達(dá)產(chǎn)物會(huì)隨之變化，Cx43的表達(dá)量逐漸增加，從而形成更多的縫隙連接細(xì)胞間通訊，有利于細(xì)胞間的信息交流，大量增殖的細(xì)胞會(huì)逐漸凋亡[8]。若Cx43的表達(dá)持續(xù)低水平甚至不表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致縫隙連接的形成障礙，影響細(xì)胞間的信息傳遞，出現(xiàn)細(xì)胞的持續(xù)增殖，這一結(jié)論在細(xì)胞增殖旺盛的腫瘤組織中已得到了證實(shí)[9-10]，這也可能是病理性瘢痕組織中成纖維細(xì)胞持續(xù)旺盛增殖的一個(gè)原因。

我們的免疫電鏡結(jié)果顯示Cx43主要表達(dá)于成纖維細(xì)胞胞漿的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及細(xì)胞的連接處，且在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中的表達(dá)明顯減少。這說明病理性瘢痕組織成纖維細(xì)胞中Cx43的表達(dá)下調(diào)，從而縫隙連接的形成減少，細(xì)胞間信息交流障礙，使得成纖維細(xì)胞在傷口愈合過程中相互接觸后仍能旺盛增殖，分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)，膠原過度合成與沉積，這可能是病理性瘢痕形成過程中的重要機(jī)制之一。當(dāng)然若同時(shí)存在Cx43組裝成為縫隙連接的過程障礙，或者細(xì)胞間縫隙連接的開啟與關(guān)閉及功能障礙，同樣也會(huì)導(dǎo)致這一結(jié)果。對(duì)于這些因素，我們將在以后進(jìn)行更深入的研究。能否通過修復(fù)病理性瘢痕組織中的縫隙連接來抑制病理性瘢痕中成纖維細(xì)胞的增殖，對(duì)病理性瘢痕的基因治療具有重要意義，有待進(jìn)一步研究。

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[收稿日期]2008-09-28[修回日期]2008-12-10

編輯/張惠娟