金釵石斛提取物抗白內(nèi)障的體外實驗研究

白金麗　溫淑湘

摘要：目的：研究金釵石斛(Dendrobium nobile Lindl，)總生物堿和粗多糖對白內(nèi)障的抑制作用。方法：采用溶劑法分離提取金釵石斛總生物堿和粗多糖；DMEM低糖培養(yǎng)基體外培養(yǎng)ICR大鼠晶狀體，將晶狀體分為7個組，分別在培養(yǎng)后6、12、18、24h共4個時段于解剖顯微鏡下觀察并記錄晶狀體混濁度的改變；檢測晶狀體水溶性蛋白、谷胱甘N(GSH)的含量及總超氧化物歧化酶(T SOD)和丙二醛(MDA)的活性。結(jié)果：在培養(yǎng)的各個時段，正常對照組晶狀體始終保持透明，各藥物組晶狀體混濁度與模型組相比明顯較輕(P<0.05)，而金釵石斛總生物堿和粗多糖均能減輕晶狀體混濁度，并能顯著升高晶狀體水溶性蛋白、GSH含量及T SOD活性，降低MDA的活性(均P<0.05)，其中石斛總生物堿高劑量組效果最佳。結(jié)論：金釵石斛總生物堿和粗多糖在體外均有一定的抗白內(nèi)障之效，而總生物堿的效果優(yōu)于粗多糖。

關(guān)鍵詞：金釵石斛；白內(nèi)障；氧化損傷；晶狀體

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：A

文章編號：1007--2349(2009)09--0057--03

白內(nèi)障(cataract)是眼睛內(nèi)晶狀體發(fā)生混濁由透明變成不透明，阻礙光線進入眼內(nèi)，從而影響了視力。初期混濁對視力影響不大，而后漸加重，明顯影響視力甚至失明。在世界范圍內(nèi)白內(nèi)障是致盲的首要病因，現(xiàn)在世界上大約有2千萬人是由于白內(nèi)障而致盲，另有1億白內(nèi)障患者需要手術(shù)恢復視力，在大多數(shù)的非洲和亞洲國家，白內(nèi)障至少占盲人的一半。據(jù)我國調(diào)查的結(jié)果，白內(nèi)障也是我國引起失明的最主要的眼病。當前許多中藥研究都是從提高晶狀體抗氧化能力人手，利用抗氧化劑或抗氧化酶激活劑來消除或中和晶狀體中的氧化產(chǎn)物，阻止或逆轉(zhuǎn)晶狀體變渾濁，從而抑制或延緩白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展。石斛是一種名貴中藥材，抗白內(nèi)障是其主治功效之一。已有研究證實，石斛水煎劑可通過改變晶狀體相關(guān)酶的活性而對D半乳糖性白內(nèi)障起到防治作用，石斛的乙酸乙酯提取物在體外還可抑制醛糖還原酶和過氧化脂質(zhì)(LPO)的產(chǎn)生，這些研究在一定程度上揭示了石斛抗白內(nèi)障的作用機理。然而，石斛化學成分復雜，其抗白內(nèi)障的具體有效成分是什么，至今仍未見報道。本實驗通過體外培養(yǎng)晶狀體，對金釵石斛(Dendrobium nobile Lindl，)的粗提物總生物堿(totalalkaloids)和粗多糖(polysaccharides)抗白內(nèi)障作用進行了探討。

1材料和方法

1，1試驗材料動物SD清潔級大鼠，雌雄不限，4～5周齡，體重(80～120)g，共計20只。由昆明醫(yī)學院動物房提供，合格證號：滇實驗動物證第2005035號。

藥材和試劑：金釵石斛由云南鴻翔藥業(yè)有限公司提供；DMEM低糖培養(yǎng)基(上海玉博生物科技有限公司)；胎牛血清(長春西諾生物科技有限公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS，上海貝基生物科技有限公司)；體積分數(shù)30％過氧化氫(H₂O₂，浙江臨安化工二廠)；吡諾克辛鈉滴眼液(武漢五景藥業(yè)有限責任公司，批號；070202)；Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒(上海申能博彩生物科技有限公司)；谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)測定試劑盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

試劑配制改良碘化鉍鉀試劑：甲液：0.85g次硝酸鉍溶于10mL冰醋酸，加水40mL；乙液：8.g碘化鉀溶于20mL水中；將甲液與乙液等量混合后，取1mL與2mL醋酸混合，供生物堿的顯色用。Molish試劑：甲液：a萘酚1g，加75％乙醇至10mL；乙液：濃硫酸；作為多糖的檢測用。

儀器RⅡ型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi公司)；SHZ IliA型循環(huán)水式多用真空泵(上海豫康科教儀器設備有限公司)；BSllOS型電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)；HI-98128型pH計(北京HANNA)SW CJ IF型超凈臺(蘇州凈化設備廠)；Galaxy s型C02培養(yǎng)箱(美國RS Biotech)；ST PT型解剖顯微鏡(日本OLYMPUS)；PRISMTMR型低溫高速離心機(美國Labnet)；7200型分光光度計(上海尤尼柯儀器有限公司)。

1，2試驗方法1，2，1金釵石斛總生物堿和粗多糖的分離提取及檢識金釵石斛總生物堿和粗多糖的提取方法：干燥金釵石斛切碎打成粗粉，加入95％乙醇85℃回流提取(4.5h／次×3次)，合并提取液，減壓回收乙醇后得到石斛浸膏，加1mol／L HCL調(diào)節(jié)浸膏的pH為3，氯仿萃取3遍后，棄氯仿層，加濃氨水調(diào)母液pH＝11，再經(jīng)氯仿萃取3遍，將氯仿層合并，減壓濃縮，揮干氯仿后即得到總生物堿。將醇提后的藥渣曬干后加人20倍體積的水，100℃回流提取(3h／次×4次)，合并提取液，減壓濃縮后，加入95％乙醇，直至醇濃度為70％，置于冰箱內(nèi)，隔夜取出沉淀用無水乙醇和丙酮各洗滌3遍，再經(jīng)Sevag法除蛋白處理，冷凍干燥，得到粗多糖?？偵飰A的檢識參照文獻：取少量分離所得的總生物堿于試管內(nèi)，加入蒸餾水和少許二甲基亞砜(DMSO)將其充分溶解，滴在薄層板上，噴霧改良碘化鉍鉀試劑后，可見薄層板上在提取物溶液的點顯現(xiàn)出非常明顯的桔紅色斑點，由此證明提取物為生物堿。粗多糖的檢識參照文獻：取多糖水溶液1mL加入Molish試劑3滴，搖勻，傾斜試管，沿試管壁緩慢滴加1mL濃硫酸，靜置，可見在試液與濃硫酸交界面產(chǎn)生非常明顯的紫色環(huán)，證明提取物為多糖。1，2，2藥物配制用PBS分別將總生物堿和粗多糖配制成濃度為50mg／mL的溶液(生物堿加少許DMSO助溶)，0.22μm微孔濾膜過濾滅菌處理后—20℃保存待用。1，2，3晶狀體的培養(yǎng)及分組參照文獻：頸椎脫臼處死大鼠，用眼科剪、鑷迅速摘取雙眼眼球，以含800U／mL青霉素、800ug／mL鏈霉素的冷PBS液漂洗眼球后，投入含相同濃度雙抗液的PBS液中浸泡，轉(zhuǎn)人超凈臺。約10min后將大鼠眼球轉(zhuǎn)移至含500U／mL青霉素、50μg／mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，小心從眼球后極部剪開鞏膜，取出晶狀體，去除晶狀體表面的虹膜和玻璃體，晶狀體經(jīng)PBS液漂洗2遍后，再用DMEM液漂洗1遍，然后再放入已預熱的24孔組織培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每孔含1mL DMEM培養(yǎng)基(含20％胎牛血清、100μ／mL青霉素、100μg／mL鏈霉素)，預培養(yǎng)5h(37.0℃、體積分數(shù)5％COD后，剔除受損傷或已混濁的晶狀體。將35只未受損傷、透明的晶狀體按照隨機原則分7個組培養(yǎng)，每組5只。正常對照組(DMEM培養(yǎng)基+10％胎牛血清)，模型組(正常組培養(yǎng)基+2mmol／L H₂O₂)，生物堿高、低劑量組(正常組培

養(yǎng)基中各加入2mmol／L的H₂O₂，同時分別添加4、2mg／mL生物堿)，多糖高、低劑量組(在正常組培養(yǎng)基中各加入2mmol／L的H202，同時分別添加4、2mg／mL粗多糖)，陽性對照組(正常組培養(yǎng)基+2mmoL／L的H20z+10％吡諾克辛鈉滴眼液)。上述各組培養(yǎng)基均含IOOU／mL青霉素及100μg／mL鏈霉素。1，2，4觀察并照相記錄晶狀體混濁度加藥培養(yǎng)后，每6h更換1次培養(yǎng)液以保持H₂O₂濃度不變。同時觀察并記錄各組晶狀體混濁度。離體培養(yǎng)晶狀體混濁度的分級方法參照文獻。1，2，5晶狀體水溶性蛋白GSH含量及SOD、MDA活性檢測晶狀體拍照后，用冷PBS液洗滌2遍，盡量洗凈培養(yǎng)液，再用濾紙吸干水分，稱質(zhì)量。按質(zhì)量與體積比為1:10的量加入冷PBS液，在冰浴上充分勻漿后倒入2mL離心管中，4℃、12000r／min離心20min，取上清即為晶狀體水溶性蛋白，采用Bradford法檢測定蛋白含量。取剩余上清，分別采用二硫代二硝基苯甲酸法檢測GSH含量，采用黃嘌呤氧化酶法測定總超氧化物歧化酶(T SOD)活性，采用硫代巴比妥酸(thibabitu-ric acid，TBA)法檢測MDA活性，以上操作方法均嚴格按照試劑盒說明書進行。1，2，6統(tǒng)計學方法應用統(tǒng)計軟件SPSS11.5對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2結(jié)果

2，1各組藥物對晶狀體混濁度的影響各時段晶狀體混濁度經(jīng)量化處理后，進行t檢驗，各個藥物添加組中，陽性對照組、生物堿高劑量組晶狀體混濁度較模型組顯著減輕(均P<0.05)；生物堿高、低劑量組及粗多糖高、低劑量組晶狀體混濁度與陽性對照組比較均無顯著性差異(P>0.05)。將各組晶狀體混濁度與過氧化氫損傷的時間進行相關(guān)性分析，其中生物堿高劑量組差異有顯著性意義(P<0.01)，其他各組差異也均有顯著性意義(P<0.05)，由此可見，隨H₂O₂作用時間的延長，晶狀體混濁度逐漸加重。結(jié)果見表1。

2，2各組藥物對晶狀體水溶性蛋白、GSH含量及MDA、T—sOD活性的影響由表2可見，模型組與正常對照組比較，水溶性蛋白含量、GSH含量、T—SOD活性均顯著降低，MDA活性顯著升高(均P<0.05)，而陽性對照組、生物堿組、粗多糖組可顯著升高水溶性蛋白、GSH含量以及T—SOD活性，降低MDA活性，各給藥組與模型組比較，差異均有顯著性意義(P<0.05)。生物堿高劑量組水溶性蛋白含量顯著高于陽性對照組(P<0.05)，GSH含量除多糖低劑量組顯著低于陽性對照組外(P<0.05)，其他各實驗組與陽性對照組比較均無顯著性差異(P>0.05)；T—SOD活性除生物堿低劑量組和多糖低劑量組顯著低于陽性對照組外(P<0.05)，其他各組與陽性對照組比較均無顯著性差異(P>0.05)；MDA活性除生物堿高劑量組顯著低于陽性對照組(P<0.05)外，其他各組與陽性對照組比較均無顯著性差異(P>0.05)。

3討論

晶狀體的氧化損傷是目前常用的白內(nèi)障研究模型，而H₂O₂是很好的氧化損傷誘導劑。體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)功能下降或氧化作用增強均可導致眼組織的損傷，誘發(fā)或促進白內(nèi)障的形成。而活性氧簇，如H₂O₂、超氧陰離子、單態(tài)氧、氫氧根等可以引起很多生物學變化，最終使晶狀體的水不溶性蛋白增加而形成白內(nèi)障。GSH是一種抗氧化酶，在晶狀體中含量較高，對晶狀體起著多方面的重要作用。SOD和MDA常常相互配合用以反映組織細胞氧化／抗氧化系統(tǒng)功能的平衡。本研究采用體外構(gòu)建氧化損傷白內(nèi)障模型的方法，對金釵石斛總生物堿和粗多糖的抗白內(nèi)障作用進行探討。結(jié)果顯示，模型組可溶性蛋白含量顯著低于正常對照組，而各用藥組可顯著緩解可溶性蛋白的減少，生物堿高劑量組尤其明顯；同時，金釵石斛的提取物總生物堿和粗多糖均可提高晶狀體GSH含量及SOD活性，同時降低MDA活性，即通過提高晶狀體抗氧化能力而達到抑制白內(nèi)障的作用。

金釵石斛能顯著提高SOD水平，降低LPO而起到抗白內(nèi)障的作用，但其抗白內(nèi)障的確切有效成分至今仍未見報道。本實驗證實，金釵石斛的兩種藥效部位(總生物堿和粗多糖)在體外可通過減輕晶狀體的氧化損傷而抑制白內(nèi)障的進程，且總生物堿的效果優(yōu)于粗多糖。然而，金釵石斛化學成分復雜，據(jù)文獻報道，其總生物堿含量達0.4％～0.6％，種類有30多種，多糖含量也高達4％，并以各種不同的形式存在，因此，下一步研究可從這兩種粗提物人手，進一步挖掘金釵石斛抗白內(nèi)障的確切有效成分，并闡明其抗氧化的具體反應過程，這對于抗白內(nèi)障的藥物研究以及金釵石斛藥用價值的開發(fā)都有著重要的意義。