冬棗基因改良的研究進(jìn)展

李　鋒

摘要：冬棗屬于高呼吸強(qiáng)度的非躍變型果實(shí)，ABA對(duì)其后熟及貯期表老起著非常重要的作用，影響棗果后熟過程中各類酶活性和果實(shí)貯藏物質(zhì)的降解速率及硬度，是導(dǎo)致棗果變軟衰老的啟動(dòng)因素。因此，在保持果品鮮食品質(zhì)的前提下延長(zhǎng)貯藏期，是果實(shí)遺傳改良中亟待解決的問題。

關(guān)鍵詞：冬棗；基因；脫落酸；轉(zhuǎn)化

冬棗是鮮食棗果中的珍品，作為我國(guó)特有的晚熟鮮食果品，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和市場(chǎng)開發(fā)前景。冬棗果肉富含人體所需的多種氨基酸和維生素，尤以維生素C含量最為豐富，同時(shí)還含有環(huán)磷酸腺昔和鳥磷酸腺昔等物質(zhì)。冬棗成熟期集中，貯藏期短，常溫下僅能保存6—7天，目前，冬棗采后保鮮主要采用常溫，低溫、氣調(diào)、濕冷及冰溫、冷凍和防腐保鮮等方法，但果實(shí)出庫(kù)后品質(zhì)不佳，貨架期也只有35天。如何在保持果品鮮食品質(zhì)的前提下延長(zhǎng)貯藏期，是果實(shí)遺傳改良中亟待解決的問題之一，基因工程技術(shù)的利用為此開辟了一條新途徑。

1、果樹遺傳轉(zhuǎn)化研究概況

果樹多為多年生木本植物，世代周期長(zhǎng)、雜合性高、自交不親和與遺傳背景復(fù)雜等特點(diǎn)給木本果樹的有性雜交育種帶來(lái)重重困難。然而，無(wú)論從提高經(jīng)濟(jì)價(jià)值的角度，還是從提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的角度來(lái)說，培育果樹新種質(zhì)都具有重要意義。植物基因工程技術(shù)為果樹育種提供了新途徑，基因工程技術(shù)具有傳統(tǒng)育種不可比擬的優(yōu)勢(shì)；首先，定向改良植物性狀。其次多采用離體繁殖材料，取材不受季節(jié)限制，可大大縮短育種周期；再者，利用基因工程技術(shù)對(duì)果樹進(jìn)行遺傳改良，一旦獲得轉(zhuǎn)基因植株，且目的基因表達(dá)出所需性狀，即可通過組織培養(yǎng)、扦插或嫁接等無(wú)性繁殖方式對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行擴(kuò)大繁殖，由于不通過有性繁殖，因而個(gè)體間性狀一致。由于棗樹組織培養(yǎng)植株再生的難度較大，缺少合適的再生體系，與其他果樹遺傳轉(zhuǎn)化相比進(jìn)展緩慢。

1.1果樹遺傳轉(zhuǎn)化愛體系統(tǒng)植物遺傳轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)應(yīng)具備高效穩(wěn)定的再生能力，穩(wěn)定的外植體來(lái)源、較高的遺傳穩(wěn)定性和對(duì)選擇劑敏感等條件。目前，應(yīng)用于植物遺傳轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)有以下幾種：直接分化芽系統(tǒng)，胚狀體受體系統(tǒng)、愈傷組織受體系統(tǒng)、原生質(zhì)體受體系統(tǒng)和種質(zhì)系統(tǒng)。在木本果樹上應(yīng)用較多的為直接分化芽系統(tǒng)和胚狀體受體系統(tǒng)。

直接分化芽系統(tǒng)的外植體細(xì)胞不經(jīng)過愈傷組織的形成而直接分化不定芽，特別是由莖尖分生細(xì)胞建立的直接分化系統(tǒng)具有很好的遺傳穩(wěn)定性。該方法更適于無(wú)性繁殖的果樹、花卉等。如在柑橘類的遺傳轉(zhuǎn)化中多采用莖段、胚軸等作為受體，通過誘導(dǎo)不定芽再生植株。

胚狀體受體系統(tǒng)在果樹遺傳轉(zhuǎn)化中應(yīng)用較為廣泛；果樹上第一例獲得成功的報(bào)道，即是以核桃胚狀體細(xì)胞為受體再生出轉(zhuǎn)基因植株。

原生質(zhì)體作為“裸露”的植物細(xì)胞同樣具有全能性，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下可再生出植株，因此也是理想的遺傳轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)；而木本果樹原生質(zhì)體再生植株周期長(zhǎng)，技術(shù)難度大，因此，在果樹上以原生質(zhì)體為受體進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的報(bào)道較少。

種質(zhì)系統(tǒng)是指以植物的生殖細(xì)胞，如花粉粒、卵細(xì)胞為受體細(xì)胞進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)。果樹一般是高度雜合體，如果利用花粉粒、卵細(xì)胞為受體必經(jīng)過純合加倍過程，這樣會(huì)導(dǎo)致原有優(yōu)良性狀的丟失。

許多果樹建立高效的愈傷組織誘導(dǎo)體系比較困難，因此愈傷組織受體系統(tǒng)的應(yīng)用受到了限制。從再生植株變異程度等角度比較而言，直接分化系統(tǒng)和胚狀體受體系統(tǒng)具有較大的優(yōu)勢(shì)。因此，在外植體再生植株過程應(yīng)盡量越過愈傷組織階段，通過直接分化不定芽或胚狀體途徑建立高效穩(wěn)定的再生體系。

1.2果樹遺傳轉(zhuǎn)化方法目前，應(yīng)用于木本果樹的遺傳轉(zhuǎn)化方法有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍轟擊法，聚乙二醇誘導(dǎo)法、電穿孔法、硅碳纖維介導(dǎo)法等。

1.2.1農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在眾多的植物轉(zhuǎn)基因方法中，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法以其簡(jiǎn)便、高效和機(jī)制研究最為清楚等特點(diǎn)成為應(yīng)用最廣泛的方法。大多數(shù)果樹對(duì)農(nóng)桿菌感染敏感，此法的應(yīng)用可收到良好效果。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的果樹遺傳轉(zhuǎn)化中，農(nóng)桿菌菌株和生長(zhǎng)時(shí)期，植物受體的再生能力及基因型的依賴性是制約轉(zhuǎn)化效率的主要因素。在蘋果、柑橘、梨、蔓越桔和杏的研究中發(fā)現(xiàn)，EHA101及其衍生而來(lái)的菌株EHA105較LBA4404菌株具有更強(qiáng)的轉(zhuǎn)化能力。農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化時(shí)，只有感受態(tài)細(xì)胞即處于活躍代謝期或分裂期的細(xì)胞才能被轉(zhuǎn)化，因此在果樹遺傳轉(zhuǎn)化過程中經(jīng)常采用預(yù)培養(yǎng)、創(chuàng)傷外植體等方法以獲得狀態(tài)良好的受體，從而提高轉(zhuǎn)化效率。Bondt等人發(fā)現(xiàn)，gus基因的瞬時(shí)表達(dá)和gus基因的穩(wěn)定表達(dá)之間不呈現(xiàn)良好的相關(guān)性。

1.2.2基因槍轟擊法基因槍轟擊法是利用包被有外源DNA的金屬微粒，通過高速轟擊將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞、組織和器官。Fitch等以番木瓜的合子胚為受體，通過基因槍轟擊法將番木瓜環(huán)斑病毒外殼蛋白(PRV—CP)基因?qū)胧荏w細(xì)胞，再生出轉(zhuǎn)基因植株。Bechker等(2000)以香蕉胚懸浮細(xì)胞為受體，利用基因搶轟擊法進(jìn)行了轉(zhuǎn)化，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。一些研究小組在基因槍轟擊法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法配合使用上做了有益嘗試。Scorza等(1995)利用基因槍轟擊無(wú)核葡萄體細(xì)胞胚2次，然后將體細(xì)胞胚與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。May等(1995)以香蕉莖尖為受體，先用基因槍轟擊組織，造成微小創(chuàng)傷，再用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入gus基因，由轉(zhuǎn)化的莖尖分生組織細(xì)胞直接再生出植株。

1.2.3其他方法聚乙二醇誘導(dǎo)法，電穿孔法，硅碳纖維介導(dǎo)法等也在果樹遺傳轉(zhuǎn)化中應(yīng)用。然而這些方法多以原生質(zhì)體為受體。木本果樹原生質(zhì)體再生植株周期長(zhǎng)，難度大，并且再生植株變異率高，遺傳不穩(wěn)定，因此在木本果樹的遺傳轉(zhuǎn)化中應(yīng)用不多。

1.3基因工程植術(shù)在果樹改良方面的應(yīng)用

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良果樹的工作日益受到重視，通過轉(zhuǎn)基因提高果樹抗病蟲害能力是主要內(nèi)容之一。在蘋果上首次獲得成功的遺傳轉(zhuǎn)化就是將來(lái)自蘇云金芽孢桿菌的Bt毒蛋白基因轉(zhuǎn)入蘋果，得到了轉(zhuǎn)基因植株。提高果樹抗逆性的基因工程研究也取得了階段性成果，幾個(gè)研究小組分別獲得了耐鹽、抗冷的轉(zhuǎn)基因植株。Gao等(2000)分別將來(lái)自大腸桿菌的膽堿氧化酶(COD)基因和來(lái)自蘋果的依賴于NADP的6-磷酸山梨醇脫氫酶基因轉(zhuǎn)入日本柿，獲得了耐鹽的轉(zhuǎn)基因植株。Cervera等(2000)將酵母HAL2基因?qū)烁涕?，也獲得了耐鹽性提高的轉(zhuǎn)基因植株。

在利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)縮短果樹童期的研究也取得了較大進(jìn)展，Pefia等(2001)將來(lái)自擬南芥的LEAFY和API基因?qū)颂鸪群头e橙，轉(zhuǎn)化植株表現(xiàn)出童期縮短和提早開花的特性，這種性狀可遺傳給后代，轉(zhuǎn)基因植株的實(shí)生苗也表現(xiàn)出童期縮短的性狀。

增強(qiáng)果實(shí)耐貯性方面的研究主要集中在減少乙烯合成量和延緩細(xì)胞壁降解等方面。silvia等(2002)在草墓中表達(dá)果膠裂解酶的反義基因，轉(zhuǎn)基因植株的果實(shí)在色澤、大小、形狀和重量諸方面與對(duì)照植株的果實(shí)無(wú)明顯差異，但相對(duì)較硬，在后熟過程中硬度的降低速度也相對(duì)緩慢。果膠裂解酶基因的表達(dá)分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量約為對(duì)照株的70％。在44個(gè)轉(zhuǎn)基因植株中，有33株的產(chǎn)量低于對(duì)照，其原因有待研究。不過，從該結(jié)果可得出，在延緩果實(shí)軟化的基因工程中果膠裂解酶基因可看作是一個(gè)很好的候選基因。

2、ABA與果實(shí)成熟的調(diào)控

脫落酸(Abscisic acid，ABA)是一種植物激素，早在20世紀(jì)60年代就被發(fā)現(xiàn)。目前，人們已認(rèn)識(shí)到ABA參與了植物的許多活動(dòng)，包括種子的發(fā)育、休眠與萌發(fā)、植物對(duì)多種逆境脅迫的應(yīng)答、果實(shí)成熟的調(diào)控、以及糖信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)等附。

2.1ABA在果實(shí)成熟過程中的作用果實(shí)成熟是一個(gè)復(fù)雜的過程，出現(xiàn)特異性成熟基因的表達(dá)和果實(shí)細(xì)胞代謝的變化，受內(nèi)部和外部多種因素的影響。根據(jù)果實(shí)成熟過程中是否有呼吸躍變，可將果實(shí)分為兩類：呼吸躍變型和非呼吸躍變型。ABA在上述兩類果實(shí)的成熟過程中發(fā)揮著不同的調(diào)控作用。

在呼吸躍變型果實(shí)的成熟過程中，ABA可能作為果實(shí)“原初啟動(dòng)信使”，通過影響果實(shí)乙烯合成來(lái)調(diào)控果實(shí)的成熟。陳昆松等(1999)發(fā)現(xiàn)，獼猴桃果實(shí)后熟過程中，ABA積累出現(xiàn)在果實(shí)后熟前期，而乙烯躍變發(fā)生在果實(shí)后熟中后期，乙烯加速了果實(shí)軟化的進(jìn)程，但與軟化啟動(dòng)過程無(wú)明顯關(guān)系，說明ABA在稱猴桃果實(shí)后熟過程中起著啟動(dòng)和調(diào)控作用。陳尚武等(2000)的研究結(jié)果表明：蘋果果實(shí)發(fā)育后期及成熟期果實(shí)內(nèi)源ABA濃度升高，成熟期果實(shí)乙烯臺(tái)成速率與果實(shí)內(nèi)源ABA濃度呈現(xiàn)明顯的正相關(guān)，用ABA合成抑制劑fluridone處理蘋果果實(shí)后，果實(shí)內(nèi)源ABA濃度顯著降低，乙烯躍變推遲，推測(cè)ABA可能是蘋果果實(shí)成熟過程中位于乙烯上游的內(nèi)源調(diào)控因子。

作為調(diào)控果實(shí)成熟的重要激素，ABA在非呼吸躍變型果實(shí)中起著比乙烯更為重要的作用。Oavies等(1997)使用生長(zhǎng)素類似物處理葡萄果實(shí)，導(dǎo)致果實(shí)成熟啟動(dòng)推遲2周，而ABA含量的增加也被相應(yīng)的推遲，說明ABA對(duì)葡萄果實(shí)的成熟啟動(dòng)起著重要作用。張有林等(2000)以葡萄和鮮棗為材料研究了果實(shí)采后貯期ABA含量的變化，發(fā)現(xiàn)用ABA合成抑制劑三碘苯甲酸處理葡萄和鮮棗果實(shí)，然后低溫貯藏，明顯抑制了ABA的形成，取得了良好的保鮮效果。另外，外源ABA處理能促進(jìn)草毒提前成熟。這些結(jié)果喪明，在非呼吸躍變型果實(shí)成熟過程中ABA起主導(dǎo)作用，ABA含量增長(zhǎng)發(fā)生在果實(shí)成熟之前，可認(rèn)為是ABA的增加誘發(fā)了果實(shí)成熟的啟動(dòng)。

2.2beta基因和als突變基因在高等植物中，甜菜堿由膽堿經(jīng)兩步氧化反應(yīng)合成，分別由膽堿單加氧酶(CMO)和甜菜堿醛脫氫酶(BADH)催化；在哺乳動(dòng)物和一些微生物中，則由膽堿脫氫酶(CDH)催化膽堿形成甜菜堿醛，再由BADH催化合成甜菜堿；還有一些微生物如球形節(jié)桿菌和滋養(yǎng)節(jié)桿菌中，膽堿可不經(jīng)過甜菜堿醛而在膽堿氧化酶(COD)的催化下直接生成甜菜堿，到目前為止COD只在微生物中發(fā)現(xiàn)。大腸桿菌的CDH由betA基因編碼，能催化膽堿形成甜菜堿醛，也能催化甜菜堿醛脫氫產(chǎn)生甜菜堿，只是催化后一步的效率較低，即兼具膽堿單氧化物酶和甜菜堿醛脫氫酶的功能，這使轉(zhuǎn)移單一基因就可使植物臺(tái)成甜菜堿成為可能。Lilius等(1996)將betA基因轉(zhuǎn)入煙草，轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性比對(duì)照植株有明顯提高。

20世紀(jì)80年代中期，人們已成功地從擬南芥和煙草的抗除草劑植株及野生型植株中克隆出als基因。Haughn等(1986)通過誘變技術(shù)得到表現(xiàn)除草劑抗性的擬南芥突變系。用野生型擬南芥als基因?yàn)樘结槒某輨┛剐灾晗档幕蚪M文庫(kù)中分離到突變als基因。ats基因編碼乙酞乳酸合成酶(acetolactate synthase，ALS)，該酶是Leu，IIe和Val合成途徑中的第一個(gè)酶，是磺酸脈類除草劑的靶酶?；翘}類除草劑是一類較新的廣譜性除草劑，其特性是高效(克/公頃的施用量)和對(duì)哺乳動(dòng)物的低毒性。細(xì)菌、真菌和高等植物都顯示了對(duì)這類除草劑的敏感性。哺乳動(dòng)物并不利用分支氨基酸合成途徑，而是通過食物獲得分支氨基酸，因此磺酰脲類除草劑對(duì)哺乳動(dòng)物是低毒或無(wú)毒的。由于突變的als基因?qū)酋ｋ孱惓輨┑母呖剐?，以及磺酰脲類除草劑的廣譜高效性和對(duì)哺乳動(dòng)物的低毒性，其已被應(yīng)用于農(nóng)作物的遺傳轉(zhuǎn)化研究中，培育抗除草劑作物已成為作物育種的一個(gè)重要方面。在果樹上，Yao等(1994)將突變的als基因轉(zhuǎn)入蘋果栽培種嘎娜，獲得的再生植株表現(xiàn)為對(duì)磺酞脈類除草剖的抗性。