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    濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎造模方法的實(shí)驗(yàn)研究

    2007-12-29 00:00:00戴世學(xué)鄭學(xué)寶葉秋麗李江超
    云南中醫(yī)中藥雜志 2007年11期


      摘要:目的:復(fù)制濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型,探討該模型的客觀指標(biāo)評(píng)價(jià)體系。方法:采用高脂高糖飲食造成濕熱體質(zhì),用三硝基苯磺酸(7NBS)和乙醇混合液灌腸誘發(fā)濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎,觀察大鼠證候、結(jié)腸病理學(xué)改變及血清白介素-6(IL-6)。結(jié)果:模型大鼠出現(xiàn)粘液便、懶動(dòng)、食欲減退等濕熱證候,病理切片可見結(jié)腸粘膜出現(xiàn)明顯潰瘍、病理學(xué)評(píng)分有顯著性差異(P<0.01),血清IL-6明顯升高(P<0.01)。結(jié)論:采用飲食加化學(xué)刺激法首次成功復(fù)制出濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎的大鼠模型,并擬定證候、病理及免疫三大指標(biāo)體系。可為臨床和實(shí)驗(yàn)研究提供參考。
      關(guān)鍵詞:濕熱證;潰瘍性結(jié)腸炎;模型;白介素-6
      中圖分類號(hào):R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A
      文章編號(hào):1007-2349(2007)11-0037-03
      
      潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是臨床引起腹瀉的常見病和難治病,其辨證分型以濕熱型最常見,但在該病的造模實(shí)驗(yàn)研究當(dāng)中,目前只復(fù)制出肝郁脾虛和脾虛兩種動(dòng)物模型,尚未復(fù)制出最常見的濕熱型動(dòng)物模型,更未能建立該模型的客觀指標(biāo)評(píng)價(jià)體系?;谏鲜鰡栴},本研究運(yùn)用中醫(yī)的病因病機(jī)理論及潰瘍性結(jié)腸炎的西醫(yī)發(fā)病機(jī)制學(xué)說,采用飲食加化學(xué)刺激的方法,首次成功復(fù)制出濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎的大鼠模,并初步擬定了客觀指標(biāo)評(píng)價(jià)體系,為臨床和實(shí)驗(yàn)研究提供成熟的動(dòng)物模型。具體實(shí)驗(yàn)情況如下。
      
      1 材料與方法
      
      1.1 材料
      1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 36只3月齡SPF級(jí)SD大鼠,雌雄各半,體重(200±20)購(gòu)自廣東實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物合格證編號(hào):2006A027。
      1.1.2 試劑及物品 三硝基苯磺酸由美國(guó)Sigma公司生產(chǎn),批號(hào):026K5006。大鼠血清IL-6(EIJSA法檢測(cè))試劑盒由美國(guó)California R&B公司生產(chǎn)。紅星二鍋頭(酒精度為56°)為北京紅星股份有限公司產(chǎn)品;蜂蜜由海南卓灃蜂業(yè)有限公司生產(chǎn)。
      1.1.3 儀器 EPICS公司高速離心機(jī)(HERAEUS-1.0R),電子天平為上海臺(tái)之衡電子衡器有限公司產(chǎn)品,酶標(biāo)儀由Bio-Tek公司生產(chǎn)。
      1.2 造模方法 采用高脂高糖飲食加化學(xué)刺激法。隨機(jī)選取9只大鼠為空白對(duì)照組,普通飼料喂養(yǎng),自由飲水。其余27只為造模組(其中18只另分別作治療和對(duì)照組,此文暫不討論),以普通飼料喂養(yǎng)為基礎(chǔ),自由飲用濃度為200s/L的蜜糖水,每日上午灌服豬油lOg/ks,約30min后再灌服56度白酒(紅星二鍋頭)10ml/k8,共持續(xù)10天,以造成內(nèi)因濕熱模型;于造模第11天禁食24h,用3%戊巴比妥鈉30rag/k8腹腔注射麻醉,予三硝基苯磺酸(TNBs)lOOmg/k8(約等于TNBs原液0.20ml/100g)加50%乙醇0.25ml,用直徑約1.5mm的聚丙烯管插入肛門上段約8cm后一次性注入上述混合試劑。造出濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎大鼠模型。
      1.3 觀察指標(biāo)
      1.3.1 一般情況 泄瀉程度、大便的性狀、顏色、氣味、精神狀態(tài)、飲食量、毛發(fā)等,計(jì)算24h濕糞重量和記錄體重。
      1.3.2 評(píng)分 肉眼觀察結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)改變并按表1進(jìn)行評(píng)分。
      1.3.3 血清 IL-6檢測(cè)。
      1.3.4 病理切片 觀察結(jié)腸病理改變。結(jié)果見表l。
      
      1.4 標(biāo)本處理和指標(biāo)檢測(cè)
      1.4.1 血標(biāo)本 造模后觀察72h,確定模型穩(wěn)定,用ELISA法檢測(cè)空白及模型組大鼠血清IL-6含量,結(jié)果用ng/L表示。
      1.4.2 結(jié)腸標(biāo)本 頸椎脫臼處死大鼠,剖腹取距離肛門約8cm結(jié)腸一段做HE染色。
      1.4.3 糞便 用鼠籠收集大鼠24h濕糞,用電子天平稱取濕糞重量。
      1.5 統(tǒng)計(jì)方法 采用t檢驗(yàn)。
      
      2 結(jié)果
      
      2.1 證候 濕熱造模期間部分大鼠出現(xiàn)短時(shí)間站立不穩(wěn)、呼吸加快的醉酒表現(xiàn),飲食量和體重下降,且出現(xiàn)最具特征性的粘液便,常為兩節(jié)糞便由一絲狀粘液連結(jié),不易拉斷(圖1);糞便的顏色及穢味加深加重。灌腸造成潰瘍性結(jié)腸炎模型后,大鼠腹瀉明顯,24h濕糞重量見表2。其中部分大鼠出現(xiàn)明顯中毒性結(jié)腸擴(kuò)張和腸粘連(圖2及圖3)。
      
      
      2.2 病理學(xué)檢查 模型組大鼠結(jié)腸粘膜出現(xiàn)明顯充血水腫,可見多個(gè)潰瘍?cè)睿罅垦装Y細(xì)胞浸潤(rùn),HE染色切片8/vv8Tg8fB+UcePqsW/02A==見圖4,評(píng)分見表2。
      2.3 免疫學(xué)檢查 血清IL-6明顯升高,見表2。
      
      
      3 討論
      
      3.1 造模結(jié)果評(píng)價(jià) IL-6是組織損傷后產(chǎn)生的一種重要細(xì)胞因子,具有免疫調(diào)節(jié)作用,它與炎癥的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系。在濕熱證本質(zhì)的研究中發(fā)現(xiàn)IL-6與濕熱的發(fā)生存在重要關(guān)系,故本研究選取IL-6作為濕熱的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。大鼠出現(xiàn)絲狀粘液便、懶動(dòng)、食欲及體重下降等表現(xiàn),符合中醫(yī)理論“濕性粘滯、重濁、趨下”等特點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)造模后IL-6顯著升高,且部分大鼠出現(xiàn)中毒性結(jié)腸擴(kuò)張、腸粘連等UC的嚴(yán)重并發(fā)癥,結(jié)合證候及病理學(xué)檢查,證實(shí)濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎的造模方法成功,且該模型穩(wěn)定性理想。
      3.2 造模方法概述及評(píng)價(jià) 1984年Morris采用三硝基苯磺酸(TNtks)與乙醇混合液灌腸成功復(fù)制出UC的大鼠模型,此方法后來被廣泛參考和采用。當(dāng)前UC的造模方法主要分4類:化學(xué)性刺激法,主要是用三硝基苯磺酸、葡聚糖硫酸鈉、乙酸等灌腸造模,免疫學(xué)方法,主要有大鼠結(jié)腸細(xì)菌株模型、胎鼠結(jié)腸包埋法等;復(fù)合法,主要是將兩種化學(xué)方法進(jìn)行結(jié)合;中醫(yī)方面的造模方法目前只復(fù)制出肝郁脾虛及脾虛兩種證型的UC模型,尚未復(fù)制出最常見的濕熱型UC模型,且上述研究均沒有為特定證型的UC制定系統(tǒng)客觀的指標(biāo)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)體系。
      3.3 濕熱型潰瘍性結(jié)腸炎模型的客觀指標(biāo)評(píng)價(jià)體系 該模型是西醫(yī)疾病與特定中醫(yī)證型結(jié)合起來的模型。故應(yīng)“同時(shí)具備濕熱證和潰瘍性結(jié)腸炎的客觀指標(biāo)”。根據(jù)UC的免疫學(xué)發(fā)病機(jī)制。結(jié)合濕熱證本質(zhì)與免疫的關(guān)系,本研究擬定了以下濕熱型UC的客觀指標(biāo)評(píng)價(jià)體系:
      3.3.1 濕熱證候指標(biāo) 糞便出現(xiàn)明顯粘液,黃色加深、味穢,排便次數(shù)增多且不易排盡而易粘附于肛周;食欲下降、懶動(dòng)、毛發(fā)失榮、對(duì)刺激反應(yīng)下降,體重減輕等。
      3.3.2 病理學(xué)指標(biāo) 病理切片和評(píng)分。
      3.3.3 免疫學(xué)指標(biāo) 如白介素、抗中性粒細(xì)胞抗體等。
      3.4 本造模方法的細(xì)節(jié)及要點(diǎn)探討
      3.4.1 防止灌腸液流出 灌腸后腸腔壓力增加且在麻醉狀態(tài)下進(jìn)行操作,肛門處于松弛狀態(tài),所以拔管后灌腸液容易流出肛門,故應(yīng)該采取以下措施避免:拔管前后使大鼠處于頭朝下、肛門朝上的體位;緩慢拔管后,按壓肛門至少2min。
      3.4.2 麻醉藥及其劑量選擇 因?yàn)樵搶?shí)驗(yàn)要求動(dòng)物術(shù)中無掙扎且在術(shù)后蘇醒,故應(yīng)選取起效快且作用時(shí)間不宜過長(zhǎng)的麻醉藥。烏拉坦雖然起效快,但術(shù)后蘇醒需要的時(shí)間過長(zhǎng),且麻醉過程中死亡率較高;乙醚起效快,但術(shù)中動(dòng)物易蘇醒不能配合手術(shù)。故3%戊巴比妥鈉是最理想的麻藥。術(shù)中發(fā)現(xiàn)若按0.1ml/100g的劑量,部分大鼠麻醉效果欠佳,追加到0.12ml/100g則麻醉效果理想,且動(dòng)物可在術(shù)后3h內(nèi)全部蘇

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