桉樹(shù)葉二種酶和蛋白質(zhì)的季節(jié)與年際變化

朱宇林 周興文 黃麗玲 蘇建睦 趙英

摘要：桉樹(shù)是中國(guó)南方地區(qū)的重要用材樹(shù)種，探討其貯藏氮素循環(huán)機(jī)制對(duì)于提高桉樹(shù)人工林氮素利用水平具有一定的研究意義。試驗(yàn)以桉樹(shù)枝葉組織為研究對(duì)象，在觀察其物候期基礎(chǔ)上，采用紫外分光度法測(cè)定了桉樹(shù)葉蛋白質(zhì)含量及谷氨酸合成酶和谷氨酰胺合成酶活性的動(dòng)態(tài)變化。結(jié)果表明，秋季桉樹(shù)葉中的可溶性蛋白含量最低，而在次年的春季其含量最高；夏季其含量則處在春季和秋季中間。谷氨酸合成酶活性在秋季為最高，在次年春季為最低。谷氨酰胺合成酶活性在秋季表現(xiàn)為最高，在次年的春季則表現(xiàn)為最低。桉樹(shù)葉中的可溶性蛋白含量、谷氨酸合成酶活性以及谷氨酰胺合成酶活性與年份和季節(jié)密切相關(guān)，三者分別呈現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)。

關(guān)鍵詞：桉樹(shù)；可溶性蛋白；谷氨酰胺合成酶；谷氨酸合成酶

中圖分類號(hào)：S792.39 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2018）10-0073-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.10.017

Dynamic Changes of Two Kinds of Enzymes and Soluble Protein

of Eucalyptus Leaves in Different Seasons and Years

ZHU Yu-lin，ZHOU Xing-wen，HUANG Li-ling，SU Jian-mu，ZHAO Ying

（College of Biology and Pharmacy of Yulin Normal University，Yulin 537000，Guangxi，China）

Abstract： Eucalyptus is an important economic tree species in southern China. Research on storage metabolism of eucalyptus would increase its nitrogen utilization level， which had certain research significance. Taking the branch and leaf tissue of eucalyptus as research object， the dynamic change of protein content as well as the activity of glutamate synthetase and glutamine synthetase was observed using UV spectrophotometric method based on the phonological phase. The results showed that， in the beginning of autumn， soluble protein content of eucalyptus leaves was at the lowest level； But in the following spring it was the highest. The soluble protein content in summer was between spring and the autumn. Glutamate synthese activity was the highest in autumn and the lowest in spring. The glutamine synthetase activity was the highest in autumn while lowest in spring. The glutamate synthetase activity， soluble protein content， glutamine synthetase activity was closely related to the season and year， the three of which present different changing trends.

Key words： eucalyptus； soluble protein； glutamate synthetase； glutamine synthetase

氮是植物生長(zhǎng)和發(fā)育必需的大量礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)元素，其在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)移和再利用方面極大地影響了植物的生產(chǎn)力和質(zhì)量。谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合成酶是與植物氮素代謝相關(guān)的關(guān)鍵酶，主要催化谷氨酸轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺、參與光呼吸氨、還原氨、循環(huán)氨的再同化等代謝過(guò)程，對(duì)植物的生長(zhǎng)和發(fā)育至關(guān)重要[1，2]。可溶性蛋白是高等植物中所有蛋白質(zhì)組分中最為活躍的一部分，是高等植物體內(nèi)氮素的主要存在形式， 對(duì)樹(shù)木生長(zhǎng)發(fā)育有重要調(diào)節(jié)作用[3]。桉樹(shù)為中國(guó)南方重要的用材樹(shù)種，而多數(shù)桉樹(shù)栽培區(qū)立地條件相對(duì)較差，土壤肥力水平較低，土壤中氮素較缺乏，外施氮肥已成為當(dāng)前提高桉樹(shù)產(chǎn)量的關(guān)鍵技術(shù)措施。但長(zhǎng)期施用化學(xué)氮肥會(huì)引起土壤養(yǎng)分結(jié)構(gòu)失調(diào)、物理性狀變差、導(dǎo)致土壤理化性質(zhì)惡化等嚴(yán)重的生態(tài)問(wèn)題[4]。因此，探討桉樹(shù)氮素營(yíng)養(yǎng)的積累和分配特征，對(duì)于指導(dǎo)桉樹(shù)人工林的氮素養(yǎng)分管理、提高氮素利用效率具有重要的意義。有學(xué)者從土壤理化性質(zhì)方面分析了桉樹(shù)人工林土壤肥力變化的趨勢(shì)及其與植物多樣性的關(guān)系，并取得了一定的研究成果[5，6]，但涉及到林木氮素循環(huán)和轉(zhuǎn)化方面的研究不多[7，8]，其中不同時(shí)期桉樹(shù)貯藏氮素的動(dòng)態(tài)變化研究更為鮮見(jiàn)。因此，針對(duì)目前對(duì)桉樹(shù)氮代謝相關(guān)變化研究較少的實(shí)際，試驗(yàn)探討了不同年份和季節(jié)中桉樹(shù)葉片中可溶性蛋白和谷氨酸合成酶活性以及谷氨酰胺合成酶活性的動(dòng)態(tài)變化，旨在為桉樹(shù)的氮素營(yíng)養(yǎng)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料的采集與處理

參試桉樹(shù)為玉林師范學(xué)院東校區(qū)內(nèi)種植的廣林九號(hào)桉，采樣部位是一年生的桉樹(shù)葉片，采樣時(shí)間分為不同的年份和季節(jié)，即2015年7月、9月、11月、12月以及2016年2月、3月、4月，每月下旬各采樣1次。以上樣品采回后立即整理掛上標(biāo)簽，分開(kāi)封袋，并及時(shí)放進(jìn)超低溫冰箱保存，用于各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定分析。

1.2 方法

1.2.1 可溶性蛋白含量的測(cè)定 采用考馬斯亮藍(lán)法[9]，稱取桉樹(shù)葉0.5 g，放入預(yù)冷的研缽中，加入少許石英砂和5 mL Tris-HCl緩沖液（0.06 mol/L Tris，0.50 mol/L NaCl，pH 7.8）冰浴研磨成勻漿，勻漿倒入10 mL離心管中，在13 000 r/min、4 ℃離心50 min，離心完后棄去離心管下層的沉淀，取上清液倒入潔凈試管中保存，測(cè)定的過(guò)程均要在低溫下進(jìn)行。取上清液2 mL，加10 mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，搖勻，2 min 后在紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)的595 nm波長(zhǎng)下比色。記錄OD值，計(jì)算蛋白質(zhì)含量。

1.2.2 谷氨酸合成酶活性的測(cè)定 參考熊丹[10]的測(cè)定方法，略有改動(dòng)。取桉樹(shù)葉片1 g，剪碎后置于預(yù)冷的研缽中，加預(yù)冷的Tris-HCl（pH 7.6）4 mL，冰浴研磨，12 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶提取液。按照順序向比色皿加入0.4 mL 20 mmol/L的L-谷氨酞胺、0.5 mL 20mmol/L的α-酮戊二酸、0.1 mL 10 mmol/L的KCl、0.2 mL 3 mmol/L的NADH（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）和0.3 mL酶液，總體積3.0 mL，不足部分用25 mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH 7.6）補(bǔ)足（1.5 mL）。反應(yīng)啟動(dòng)后，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于340 nm處每20 s測(cè)定1次OD值，連續(xù)測(cè)定11次，取光密度穩(wěn)定減小的一段來(lái)衡量酶活性。酶活性用氧化的NADH量（以O(shè)D340值減少量表示）來(lái)計(jì)算谷氨酸合成酶的活性

1.2.3 谷氨酰胺合成酶活性的測(cè)定 參考金正勛等[11]的測(cè)定方法，略有改動(dòng)。取新鮮葉片1 g，剪碎后置于預(yù)冷的研缽中，加預(yù)冷的Tris-HCl（pH 8.0）提取緩沖液10 mL，冰浴研磨，12 000 r/min離心10 min，上清液為粗酶提取液。取0.8 mL粗酶液，加入酶反應(yīng)液1.1 mL（對(duì)照管是先加1.8 mL反應(yīng)終止液，再加酶提取液），在40 ℃下反應(yīng)30 min后，測(cè)試管加入反應(yīng)終止液1.8 mL，放置10 min后，測(cè)定540 nm下的OD值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)應(yīng)用Microsoft Office Excel 2007程序處理，并用其作圖，運(yùn)用SAS for Windows統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析，用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 桉樹(shù)葉可溶性蛋白含量的季節(jié)和年際變化

桉樹(shù)葉可溶性蛋白含量的季節(jié)和年際變化測(cè)定情況見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，桉樹(shù)葉可溶性蛋白含量的變化總體呈現(xiàn)為高-低-高-低的趨勢(shì)。從2015年7月到2016年4月，桉樹(shù)葉中可溶性蛋白含量在14.793～89.782 μg/gFW波動(dòng)。其中，桉樹(shù)葉中可溶性蛋白含量在2015年下半年為下降的變化趨勢(shì)，次年上半年為先升后降的變化趨勢(shì)。就季節(jié)而言，可溶性蛋白含量在初春為最高，隨后極顯著下降（P<0.01），夏季其含量有所上升，到了秋季又極顯著下降（P<0.01），進(jìn)入冬季，其含量又極顯著升高（P<0.01）。

對(duì)桉樹(shù)葉中可溶性蛋白含量的季節(jié)和年際變化進(jìn)行方差分析與多重比較，結(jié)果在桉樹(shù)葉的生長(zhǎng)過(guò)程中，可溶性蛋白含量的差異達(dá)到了極顯著水平（F=1 241.60，P<0.000 1）。其中2015年11月的桉樹(shù)葉可溶性蛋白含量最小，2016年3月的可溶性蛋白含量最大。就季節(jié)而言，桉樹(shù)葉中可溶性蛋白含量在冬末和初春較高，兩者之間差異不顯著（P>0.05），但與其他季節(jié)時(shí)段之間存在極顯著差異（P<0.01）。

2.2 桉樹(shù)葉谷氨酸合成酶活性的季節(jié)和年際變化

桉樹(shù)葉谷氨酸合成酶活性的季節(jié)和年際變化測(cè)定情況見(jiàn)圖2。由圖2可見(jiàn)，桉樹(shù)葉中谷氨酸合成酶活性在2015年下半年呈現(xiàn)出先升后降的變化趨勢(shì)，次年上半年呈現(xiàn)出先降后升的變化趨勢(shì)。在不同季節(jié)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，其谷氨酸合成酶活性在初春表現(xiàn)最低，到春末極顯著升高（P<0.01）。夏季后降低，到了初秋其活性極顯著升高（P<0.01），秋冬季節(jié)交替時(shí)，其活性為逐漸降低的變化趨勢(shì)。

2.3 桉樹(shù)葉谷氨酰胺合成酶活性的季節(jié)和年際變化

桉樹(shù)葉谷氨酰胺合成酶活性的動(dòng)態(tài)變化反映了桉樹(shù)在不同時(shí)期生長(zhǎng)過(guò)程體內(nèi)氮素利用的活躍程度，是有機(jī)物代謝及植物生長(zhǎng)的重要生理基礎(chǔ)。桉樹(shù)葉谷氨酰胺合成酶活性的季節(jié)和年際變化測(cè)定情況見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn)，2015年下半年桉樹(shù)葉中谷氨酰胺合成酶活性呈現(xiàn)先升后降再升的變化趨勢(shì)，2016年上半年為逐漸降低的變化趨勢(shì)。不同季節(jié)的谷氨酰胺合成酶活性變化趨勢(shì)也不同，春季逐漸降低，到春末其活性最低；夏季活性極顯著升高（P<0.01）；到了初秋其活性最高，隨后極顯著降低（P<0.01），進(jìn)入冬天后又開(kāi)始升高，冬末下降。

對(duì)桉樹(shù)葉中谷氨酰胺合成酶活性的季節(jié)和年際變化進(jìn)行方差分析與多重比較，結(jié)果在桉樹(shù)葉生長(zhǎng)過(guò)程中，谷氨酰胺合成酶活性的差異達(dá)到極顯著水平（F=16.38，P<0.000 1）。桉樹(shù)葉片的谷氨酰胺合成酶活性在2015年9月是最高的，2016年4月桉樹(shù)葉片谷氨酰胺合成酶活性是最低的。就季節(jié)時(shí)段而言，桉樹(shù)葉中谷氨酰胺合成酶活性在初秋最高，與其他季節(jié)時(shí)段之間差異極顯著（P<0.01），秋末與初春、夏季和冬季差異不顯著（P>0.05），冬末與春季差異不顯著（P>0.05）。

3 討論

3.1 桉樹(shù)葉可溶性蛋白含量的動(dòng)態(tài)分析

可溶性蛋白是高等植物中各種酶和代謝調(diào)節(jié)物的組分，同一高等植物在不同的發(fā)育期中可溶性蛋白含量也存在高低變化[12]。如花生的花針期、結(jié)莢期和飽果期葉片中的可溶性蛋白含量呈現(xiàn)出低-高-低的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)[13]。桉樹(shù)葉中可溶性蛋白在2015年下半年逐漸降低，次年上半年先升后降。其原因可能是2015年下半年桉樹(shù)葉生長(zhǎng)進(jìn)入緩慢期，其合成蛋白的能力逐漸下降，生長(zhǎng)所需蛋白含量大于貯存量，從而出現(xiàn)蛋白含量逐漸降低的現(xiàn)象。而2016上半年桉樹(shù)葉開(kāi)始進(jìn)入生長(zhǎng)旺盛期，各個(gè)生理反應(yīng)活躍，蛋白質(zhì)開(kāi)始分解。在分解蛋白質(zhì)之前，葉片中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)處在一個(gè)準(zhǔn)備階段，營(yíng)養(yǎng)物堆積，因此可溶性蛋白呈現(xiàn)出先升后降的變化趨勢(shì)。桉樹(shù)在生長(zhǎng)季節(jié)需要大量的氮素，貯藏的蛋白質(zhì)會(huì)轉(zhuǎn)變成可溶性蛋白而分解，以補(bǔ)充氮素，所以桉樹(shù)葉在春末可溶性蛋白會(huì)迅速降低，也可能是新梢葉片逐漸增多，其合成有機(jī)物的能力尚未活躍，蛋白質(zhì)的合成能力也尚未增強(qiáng)，使此時(shí)可溶性蛋白含量處在一個(gè)較低水平；夏季桉樹(shù)葉生長(zhǎng)進(jìn)入活躍期，葉片的各個(gè)生理機(jī)能增強(qiáng)，合成有機(jī)物增多，氮化物合成可溶性蛋白的含量也隨著增多；進(jìn)入秋季后，葉片各個(gè)生理反應(yīng)能力逐漸減弱，合成的可溶性蛋白也相對(duì)減少，此時(shí)葉片的生長(zhǎng)消耗量大于合成量，可溶性蛋白含量呈現(xiàn)出降低的變化趨勢(shì)；冬季葉片生長(zhǎng)緩慢，可溶性蛋白含量的消耗量變小，其貯存量逐漸增多；在冬末，葉片為下一輪的生長(zhǎng)做準(zhǔn)備而把蛋白質(zhì)大量貯存起來(lái)，因此可溶性蛋白含量急劇增多。

3.2 桉樹(shù)葉谷氨酸合成酶活性的動(dòng)態(tài)分析

高等植物體不同部位或相同部位在不同的發(fā)育階段，對(duì)氮化物需求量都不相同。如種子成熟時(shí)，它得到的氮素大部分是運(yùn)輸系統(tǒng)運(yùn)來(lái)的酞胺、脲和精氨酸等化合物，這些物質(zhì)大部分需要將氮釋放出來(lái)，再依靠谷氨酸合成酶和谷氨酰胺合成酶同化，轉(zhuǎn)化成相關(guān)的合成貯藏蛋白所需的氨基酸。根吸收氮素主要是靠迅速向地上的輸導(dǎo)系統(tǒng)運(yùn)輸，莖和枝僅僅是氮素的轉(zhuǎn)運(yùn)站和通道；而高等植物體內(nèi)同化作用的主要器官是葉片，生長(zhǎng)發(fā)育前期儲(chǔ)存氮素的主要場(chǎng)所也是葉片[14]。谷氨酸合成酶是谷氨酸合成的關(guān)鍵酶，可以提高高等植物氮素的利用率，谷氨酸合成酶在衰老的葉片中高度表達(dá)會(huì)提高高等植物氮素的再利用、加速生長(zhǎng)和減少氮素的損失[15]。谷氨酸合成酶的活性隨著含氮量的增加而提高，氮素充足有利于增加酶蛋白量，從而促進(jìn)酶的活性[16]。2015年下半年谷氨酸合成酶活性較高的原因可能是桉樹(shù)在這兩個(gè)季節(jié)中正處在生產(chǎn)發(fā)育遲緩期，正要積累較多有機(jī)物，為次年生長(zhǎng)作準(zhǔn)備，所以此時(shí)葉片中的氨同化作用較強(qiáng)，谷氨酸合成酶活性也隨之相應(yīng)提高，氮素的貯備變多。2016年上半年谷氨酸合成酶活性降低是因?yàn)殍駱?shù)在春季生長(zhǎng)旺盛期，新梢葉片增多，葉片中的有機(jī)物、氮化物等的積累量還很少，氮元素的轉(zhuǎn)移還沒(méi)有完全，因此2016年4月桉樹(shù)葉中谷氨酸合成酶活性較低。

3.3 桉樹(shù)葉谷氨酰胺合成酶的動(dòng)態(tài)分析

谷氨酰胺合成酶是高等植物氨同化的關(guān)鍵酶，在高等植物氮代謝過(guò)程中起著重要作用[17]。理論上來(lái)說(shuō)，在春季，桉樹(shù)正處于生長(zhǎng)旺盛時(shí)期，氨同化水平應(yīng)該是處在一個(gè)很活躍的狀態(tài)中，植物吸收環(huán)境中的NO3-和NH4+合成氨基酸與蛋白質(zhì)等有機(jī)化合過(guò)程都很活躍，谷氨酰胺合成酶的活性應(yīng)該處在一個(gè)極高的水平上。然而，在試驗(yàn)測(cè)定中，春季桉樹(shù)葉谷氨酰胺合成酶活性處在一個(gè)較低的水平上，而在秋冬季節(jié)，谷氨酰胺合成酶的活性反而處在一個(gè)較高的水平上。在2015年的7月采樣時(shí)發(fā)現(xiàn)桉樹(shù)枝條上結(jié)有果實(shí)，觀察發(fā)現(xiàn)果實(shí)已成熟。鑒于此，可能是因?yàn)殍駱?shù)在秋冬季節(jié)果實(shí)已經(jīng)完全發(fā)育成熟，在種子成熟時(shí)期，種子得到的氮素主要是靠運(yùn)輸系統(tǒng)來(lái)轉(zhuǎn)運(yùn)酞胺、脲和精氨酸等化合物，它們大部分需要將氮釋放出來(lái)，然后由谷氨酰胺和谷氨酸同化，轉(zhuǎn)化成其他的合成貯藏蛋白所需的氨基酸，所以谷氨酰胺合成酶的活性顯著升高。春季谷氨酰胺合成酶活性比秋季低，其原因可能是春季新梢葉片的增多，氮元素還未來(lái)得及從老葉中轉(zhuǎn)移到新葉里進(jìn)行氮素代謝，其本身的蛋白質(zhì)、氨基酸等有機(jī)物的含量少，各個(gè)生理反應(yīng)還不夠活躍，從而表現(xiàn)出谷氨酰胺合成酶活性處在很低的狀態(tài)。

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