α-甘露糖苷酶與木薯塊根采后生理變質(zhì)的關(guān)系

安飛飛 薛晶晶 韋卓文 陳松筆

摘要：分析α-甘露糖苷酶與木薯塊根采后生理變質(zhì)（PPD）發(fā)生的關(guān)系，為有效控制木薯PPD發(fā)生提供新思路。采用RT-PCR分析α-甘露糖苷酶基因在塊根PPD發(fā)生過(guò)程中的表達(dá)模式，ELISA檢測(cè)α-甘露糖苷酶活性變化。SC9完整薯塊儲(chǔ)存5 d后開(kāi)始出現(xiàn)PPD現(xiàn)象，20 μmol/L幾夫堿噴施木薯塊根切片可顯著延緩PPD的發(fā)生。隨著PPD程度的加重，α-甘露糖苷酶活性顯著增高，在儲(chǔ)存9 d時(shí)達(dá)到最大值326.24 U/L。MeMNS1、MeMNS4、MeGMII的表達(dá)隨著PPD過(guò)程而逐步增強(qiáng)，且MeGMII表達(dá)最顯著，采后9 d SC9塊根中MeGMII的表達(dá)量達(dá)到對(duì)照的28.05倍，而MeMNS3-1、MeMNS3-2、MeMNS5表達(dá)的變化與木薯塊根PPD程度間無(wú)明顯規(guī)律。α-甘露糖苷酶參與木薯塊根PPD發(fā)生的過(guò)程，且α-甘露糖苷酶活性與PPD程度呈正相關(guān)，其中MeGMII可能是參與此過(guò)程的關(guān)鍵基因。

關(guān)鍵詞：木薯;塊根;α-甘露糖苷酶;采后生理變質(zhì)

中圖分類號(hào)：S533.01 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）02-0165-05

收稿日期：2021-05-17

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：2019YFD1000501）;海南省自然科學(xué)基金（編號(hào)：320MS100）。

作者簡(jiǎn)介：安飛飛（1983—），女，河北保定人，碩士，副研究員，主要從事木薯抗性育種研究。E-mail：aff85110@163.com。

通信作者：陳松筆，博士，研究員，主要從事木薯遺傳育種研究工作。E-mail：songbichen@catas.cn。

木薯（Manihot esculenta Crantz）是世界亞熱帶和熱帶地區(qū)近10億人的主要糧食作物，在我國(guó)南方主要作為淀粉工業(yè)和生物質(zhì)能源的重要原料。與其他薯類作物（馬鈴薯、甘薯）相比，木薯的塊根保質(zhì)期非常短，通常在采后1～3 d就開(kāi)始發(fā)生變質(zhì)，這種木薯特有的現(xiàn)象稱之為“采后生理變質(zhì)（postharvest physiological deterioration，PPD）”[1]。PPD使木薯淀粉透明度下降，嚴(yán)重影響淀粉及燃料乙醇加工。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年亞洲、拉丁美洲、加勒比海地區(qū)及非洲因木薯PPD而造成的經(jīng)濟(jì)損失分別為8%、10%、29%[2]，直接經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)2億美元[1-3]。木薯PPD已成為產(chǎn)業(yè)發(fā)展亟需解決的重要問(wèn)題之一，而至今尚未有一種行之有效的方法能抑制塊根PPD發(fā)生[2，4]。因此，解析延緩木薯塊根PPD產(chǎn)生的分子機(jī)理、選育耐PPD木薯品種是全球木薯育種家面臨的挑戰(zhàn)。

木薯PPD發(fā)生過(guò)程分為初級(jí)變質(zhì)和次級(jí)變質(zhì)，初級(jí)變質(zhì)由酚類等物質(zhì)氧化引起，隨后出現(xiàn)呼吸速率增強(qiáng)、脂質(zhì)成分改變、乙烯合成、傷口誘導(dǎo)的氧化爆發(fā)、次級(jí)代謝物的積累[2，5-10]。然后，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，微生物侵入引發(fā)次級(jí)變質(zhì)，最終導(dǎo)致整個(gè)塊根變質(zhì)[11-12]。其他薯類作物如馬鈴薯、甘薯薯塊受到傷害后會(huì)產(chǎn)生一系列的應(yīng)答反應(yīng)，同時(shí)在細(xì)胞中形成木質(zhì)素等次生代謝物，保留在細(xì)胞壁中修復(fù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，重新形成保護(hù)屏障，減少水分散失和抵抗外界微生物侵染[13]。而木薯塊根在生物進(jìn)化過(guò)程中，其傷口修復(fù)功能慢慢退化[14-15]。因此推測(cè)，木薯塊根不能及時(shí)修復(fù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)使傷口愈合，可能是木薯較其他薯類作物不耐貯存的原因之一;而關(guān)于通過(guò)細(xì)胞壁修復(fù)來(lái)延緩木薯PPD的研究還未見(jiàn)報(bào)道。細(xì)胞壁糖蛋白含有大量的N-聚糖結(jié)構(gòu)，α-甘露糖苷酶是真核生物對(duì)N-聚糖進(jìn)行修飾的關(guān)鍵酶，分為Ⅰ類、Ⅱ類α-甘露糖苷酶，Ⅰ類 α-甘露糖苷酶屬于糖基水解酶47家族 （GH47），Ⅱ類α-甘露糖苷酶屬于糖基水解酶38家族 （GH38）[16-17] 。2類酶均可通過(guò)水解N-聚糖中的各種α-甘露糖苷鍵，完成對(duì)N-聚糖的修飾[18-19]。α-甘露糖苷酶對(duì)N-聚糖的修飾直接影響細(xì)胞壁的組成，在桃果實(shí)中被證實(shí)可以通過(guò)改變細(xì)胞壁表面N-聚糖結(jié)構(gòu)來(lái)延緩果實(shí)的成熟與軟化過(guò)程[20]。研究表明隨著植物果實(shí)的成熟與軟化，α-甘露糖苷酶活性不斷增強(qiáng)，α-甘露糖苷酶基因的表達(dá)也不斷升高[21-22]。目前對(duì)于植物中α-甘露糖苷酶基因的相關(guān)研究在番茄[21]、辣椒[23]、芒果[24]、草莓[25] 、甜瓜[26]等物種中都有報(bào)道。Meli等利用RNAi干擾技術(shù)抑制番茄中Ⅱ類α-甘露糖苷酶基因的表達(dá)，在轉(zhuǎn)基因果實(shí)中α-甘露糖苷酶活性、N-糖蛋白的降解、果實(shí)軟化速率都受到了抑制，果實(shí)硬度提高了2.5倍，番茄貨架期延長(zhǎng)了 30 d，而超表達(dá)該基因的番茄果實(shí)軟化時(shí)間提前，軟化速率加快[21]。前期在Phytozome木薯數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，分析到5個(gè)編碼Ⅰ類α-甘露糖苷酶的基因，同時(shí)克隆并分析其表達(dá)模式[27]，在木薯中還存在1個(gè)編碼Ⅱ類 α-甘露糖苷酶的基因，但關(guān)于α-甘露糖苷酶與木薯塊根PPD發(fā)生的關(guān)系仍需進(jìn)一步確定。

本研究將開(kāi)展α-甘露糖苷酶與木薯PPD發(fā)生之間的關(guān)系研究，對(duì)6個(gè)編碼基因在食用木薯品種SC9完整薯塊儲(chǔ)存過(guò)程（0、1、3、5、7、9 d）中的表達(dá)及酶活性進(jìn)行分析，結(jié)合α-甘露糖苷酶抑制劑-幾夫堿處理塊根切片，最終明確兩者的關(guān)系，旨在為有效控制木薯塊根PPD的發(fā)生提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

木薯華南9號(hào)（SC9），來(lái)自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所國(guó)家木薯種質(zhì)資源圃，于種植后10個(gè)月選取完好的木薯塊根進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 木薯塊根PPD觀察

10個(gè)月后收獲其塊根，將完整薯塊置于26? ℃培養(yǎng)箱儲(chǔ)存0、1、3、5、7、9 d，觀察塊根PPD情況并收集樣品。塊根采后切片（創(chuàng)傷）處理后噴施20 μmol/L的α-甘露糖苷酶抑制劑——幾夫堿（Kif）后0、12、24、36、48、72 h觀察PPD發(fā)生情況。

1.2.2 ELISA檢測(cè)α-甘露糖苷酶活性

用純化的植物α-甘露糖苷酶抗體包被微孔板，依次加入α-甘露糖苷酶，與辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的 α-甘露糖苷酶抗體結(jié)合，徹底清洗后加入底物四甲基習(xí)苯胺（TMB）進(jìn)行顯色，測(cè)定450 nm波長(zhǎng)下的吸光度（D值），利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品中 α-甘露糖苷酶活性。

1.2.3 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

將研缽、研磨棒和勺子在300 ℃馬弗爐中烘6 h，將樣品研磨后稱取約0.1 g粉末，參照多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒（TIANGEN，DP441）提取總RNA;反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒cDNA第1鏈試劑盒（TRAN，AT311-03）。

1.2.4 引物設(shè)計(jì)和RT-PCR分析

合成α-甘露糖苷酶基因的定量PCR引物，以MeActin為內(nèi)參基因（表1）。利用合成的cDNA稀釋5倍為模板，用HiScript Ⅲ RT SuperMix （Vazyme，R323-01）進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系10.0 μL：cDNA 1.0 μL，上下游引物各0.4 μL，HiScript Ⅲ RT SuperMix? 5.0 μL，超純水3.2 μL。采用2-ΔΔCT計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)樣品測(cè)定3次。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2013和DPS v7.05統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，差異顯著性標(biāo)準(zhǔn)采用Duncan’s新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 SC9塊根PPD觀察

取SC9完整薯塊置于26℃培養(yǎng)箱中，分別儲(chǔ)存0、1、3、5、7、9 d取樣觀察，如圖1所示。收獲時(shí)木薯塊根橫切后呈淡黃色，塊根水分含量充足有光澤，沒(méi)有PPD現(xiàn)象;儲(chǔ)存5 d，塊根出現(xiàn)輕微變質(zhì)，橫切面外圍出現(xiàn)了黑色斑塊;儲(chǔ)存7 d，塊根出現(xiàn)了較大面積變質(zhì)，橫切面內(nèi)圍也出現(xiàn)了PPD現(xiàn)象，面積約占橫切面的1/3;儲(chǔ)存9 d，塊根整個(gè)橫切面大部分出現(xiàn)PPD現(xiàn)象，塊根出現(xiàn)裂縫。

取SC9完整薯塊切片后噴施20 μmol/L α-甘露糖苷酶抑制劑——幾夫堿，分別在噴施0、12、24、36、48、72 h后觀察PPD發(fā)生情況。從圖2可以發(fā)現(xiàn)，木薯切片12 h后周邊開(kāi)始出現(xiàn)輕微的PPD現(xiàn)象，橫切面外圍出現(xiàn)褐化，隨后PPD現(xiàn)象逐漸加重，48 h后切片大部分出現(xiàn)裂縫，PPD現(xiàn)象嚴(yán)重。與對(duì)照相比，噴施抑制劑幾夫堿后，明顯延緩了木薯PPD現(xiàn)象，在噴施抑制劑36 h后才出現(xiàn)明顯的PPD現(xiàn)象，且在48 h和72 h后，切片的變質(zhì)面積明顯小于對(duì)照。

2.2 SC9塊根PPD發(fā)生過(guò)程中α-甘露糖苷酶活性變化

利用植物α-甘露糖苷酶的ELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定SC9采后不同時(shí)間（0、1、3、5、7、9 d）塊根中 α-甘露糖苷酶活性，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示隨著采后時(shí)間的推移，木薯塊根PPD程度加重，α-甘露糖苷酶活性也隨之增高。在收獲后9 d，塊根中α-甘露糖苷酶活性達(dá)到最高326.24 U/L。

2.3 SC9塊根PPD發(fā)生過(guò)程中α-甘露糖苷酶基因表達(dá)變化

采用RT-PCR技術(shù)對(duì)上述時(shí)間點(diǎn)中6個(gè)編碼α-甘露糖苷酶基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4所示。隨著木薯塊根貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，PPD程度的加深，MeMNS1、MeMNS4、MeGMII的表達(dá)逐步增強(qiáng)，采后9 d SC9塊根中MeMNS1、MeMNS4、MeGMII的表達(dá)量分別達(dá)到對(duì)照的1.62、1.89、28.05倍。MeMNS3-1、MeMNS5在木薯塊根PPD發(fā)生過(guò)程中的表達(dá)呈先上升后下降再上升的趨勢(shì)，而MeMNS3-2呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在木薯塊根PPD發(fā)生過(guò)程中，6個(gè)編碼α-甘露糖苷酶基因的表達(dá)均有不同程度變化，其中MeGMII表達(dá)變化最明顯。因此我們推測(cè)，α-甘露糖苷酶參與塊根PPD發(fā)生過(guò)程，其中MeGMII是參與此過(guò)程的關(guān)鍵基因。

3 討論與結(jié)論

PPD的發(fā)生涉及活性氧清除、細(xì)胞程序性死亡以及細(xì)胞壁修復(fù)、苯丙烷合成、淀粉降解、脂肪酸-氧化等途徑[28]。細(xì)胞壁是植物阻擋外界傷害的第1道屏障，植物細(xì)胞壁含有大量的糖蛋白，其結(jié)構(gòu)的改變關(guān)系到果實(shí)的成熟與軟化。研究表明，植物果實(shí)的成熟過(guò)程伴隨著細(xì)胞壁糖蛋白的降解，在此過(guò)程中α-甘露糖苷酶活性不斷增強(qiáng)，基因表達(dá)也不斷升高[29-30]。本研究木薯塊根PPD過(guò)程中，α-甘露糖苷酶活性不斷增強(qiáng)，部分基因表達(dá)也不斷升高，且通過(guò)噴施α-甘露糖苷酶抑制劑——幾夫堿，顯著延緩了木薯PPD的發(fā)生，說(shuō)明α-甘露糖苷酶參與塊根PPD的調(diào)控過(guò)程。Ghosh等發(fā)現(xiàn)，抑制 α-甘露糖苷酶的表達(dá)可以延長(zhǎng)辣椒的儲(chǔ)藏時(shí)間[23]。通過(guò)抑制番茄GH38家族基因的表達(dá)，番茄細(xì)胞壁細(xì)胞排列更加緊湊，儲(chǔ)藏時(shí)間顯著延長(zhǎng)[21]。α-甘露糖苷酶對(duì)果實(shí)成熟及儲(chǔ)藏產(chǎn)生影響，是由于其改變了細(xì)胞壁表面N-聚糖結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變化，從而影響果實(shí)的生理狀態(tài)[31]。研究顯示，木薯塊根PPD的過(guò)程受到蛋白質(zhì)N-糖基化修飾調(diào)控[27，32]，關(guān)于α-甘露糖苷酶與果實(shí)儲(chǔ)藏的關(guān)系研究大多集中于GH38家族，對(duì)于GH47家族研究很少。在木薯塊根PPD過(guò)程中發(fā)生顯著變化的 α-甘露糖苷酶基因是MeGMII。采后9 d SC9塊根中MeGMII的表達(dá)量達(dá)到對(duì)照的28.05倍，推測(cè)MeGMII是參與此過(guò)程的關(guān)鍵基因，該基因?qū)儆贕H38家族。其他5個(gè)屬于GH47家族的基因在PPD過(guò)程中也發(fā)生了變化，MeMNS1、MeMNS4的表達(dá)逐步增強(qiáng)，表明GH47家族基因與木薯PPD發(fā)生也存在一定關(guān)系，這與An等的研究結(jié)果[27]一致。

由于木薯固有的易腐爛性，改進(jìn)其儲(chǔ)藏技術(shù)只能部分抑制塊根PPD的發(fā)生，因此依靠傳統(tǒng)育種和轉(zhuǎn)基因培育耐PPD木薯是解決木薯PPD發(fā)生的有效方法[33-34]。自然界中存在耐PPD的木薯種質(zhì)，且通過(guò)雜交也可獲得[35]。過(guò)表達(dá)清除活性氧的代謝酶（線粒體交替氧化酶、過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶）或淬滅活性氧的物質(zhì)（β-胡蘿卜素）均可提高木薯塊根的耐PPD能力[2，36-38]。本研究結(jié)果推測(cè)MeGMII是參與木薯塊根PPD過(guò)程的關(guān)鍵基因，目前已構(gòu)建了MeGMII的過(guò)表達(dá)及Crispr載體，可通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化平臺(tái)在基因水平上改良該基因，有望獲得一系列耐PPD的株系，從而減少因木薯PPD帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失。

20 μmol/L幾夫堿噴施木薯塊根切片可明顯延緩PPD現(xiàn)象的發(fā)生。隨著PPD程度的加重，α-甘露糖苷酶活性逐漸增高，MeMNS1、MeMNS4、MeGMII的表達(dá)逐步增強(qiáng)，且MeGMII的表達(dá)變化最明顯。α-甘露糖苷酶參與木薯塊根PPD發(fā)生的過(guò)程，且 α-甘露糖苷酶活性與PPD的程度呈正相關(guān)，其中MeGMII可能是參與此過(guò)程的關(guān)鍵基因。

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