ARIP2在小鼠肝細胞中表達與調(diào)控的實驗研究

林瑞新，武家成，由廣強，王鐵龍，李 歡，楊淑莉

(吉林大學第二醫(yī)院 1.肝膽胰外科;2.婦產(chǎn)科，吉林 長春130041)

ARIP2在小鼠肝細胞中表達與調(diào)控的實驗研究

林瑞新1，武家成1，由廣強1，王鐵龍1，李 歡1，楊淑莉2*

(吉林大學第二醫(yī)院 1.肝膽胰外科;2.婦產(chǎn)科，吉林 長春130041)

目的 探討激活素受體相互作用蛋白2(ARIP2)在小鼠肝細胞中的表達與調(diào)控。方法 使用RT-PCR方法對ARIP2的mRNA轉(zhuǎn)錄水平及調(diào)控因素進行檢測。結(jié)果 Activin A能夠刺激小鼠肝細胞的ARIP2表達增加，其轉(zhuǎn)錄水平隨作用時間的增加而升高；Activin A，PMA及LPS均對小鼠肝細胞ARIP2 mRNA的轉(zhuǎn)錄具有促進作用，而A23187對小鼠肝細胞ARIP2 mRNA的轉(zhuǎn)錄具有抑制作用；ARIP2的過表達對Activin A誘導的小鼠肝細胞的ActRⅡA mRNA的轉(zhuǎn)錄具有抑制作用，而對ActRⅡB mRNA的轉(zhuǎn)錄無影響。結(jié)論 ARIP2的表達受到Activin A，A23187，PMA及LPS等多種因素的影響，ARIP2通過對小鼠肝細胞ActRⅡA表達的影響，參加激活素作用信號傳導的負反饋調(diào)控。

激活素受體相互作用蛋白2；小鼠肝細胞；表達；調(diào)控

(ChinJLabDiagn,2017,21:1422)

激活素(Activin)是一種具有多種功能的細胞因子，在肝癌組織中存在異常表達且對肝癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移有重要調(diào)節(jié)作用[1,2]。激活素受體相互作用蛋白2可通過調(diào)控激活素受體Ⅱ在膜上的表達量來調(diào)節(jié)激活素的信號，進而影響激活素對肝癌細胞的調(diào)節(jié)作用[3-5]。筆者通過對ARIPS2對肝癌細胞增殖的影響研究，進一步研究ARIPS2在肝組織及肝癌組織中的分布情況，闡明激活素受體相互作用蛋白2表達水平與肝癌發(fā)生相關(guān)性，以期為治療肝癌提供新途徑?，F(xiàn)將研究結(jié)果總結(jié)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞及質(zhì)粒

小鼠肝細胞株取自中國科學院上海細胞庫提供的小鼠肝癌細胞系(ATCC)，使用含10%胎牛血清(FCS)的DMED培養(yǎng)基進行培養(yǎng)； 質(zhì)粒選擇購于Invitrogen公司的pcDNA3質(zhì)粒和吉林大學基礎醫(yī)學院構(gòu)建的pcDNA3-ARIP2質(zhì)粒。

1.2 試劑

脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)、鈣離子載體A23187、佛波酯(PMA)購于美國Sigma公司；AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV Reverse Transcriptase)購于美國Promega公司；EX Taq 酶購于日本TaKaRa公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購于美國GIBCO公司； Trizol試劑和脂質(zhì)體2000(Lipofectamine 2000)購于美國Invitrogen公司；激活素A(Activin A)購于以色列ProSpec-Tany公司。

1.3 方法

取對數(shù)生長期的、培養(yǎng)中的小鼠肝細胞，以每孔2×105個細胞的濃度接種于12孔培養(yǎng)板中，置于37℃的培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。

Activin A對小鼠肝細胞ARIP2 mRNA轉(zhuǎn)錄的影響。取出過夜培養(yǎng)的細胞一份，將培養(yǎng)液更換為含有2%濃度的FCS的DMEM培養(yǎng)基，并以5 ng/ml的濃度加入Activin A，分別于培養(yǎng)第4 h、8 h、12 h和24 h收取細胞，然后使用Trizol試劑進行總RNA的提取。使用RT-PCR方法對ARIP2的mRNA轉(zhuǎn)錄水平進行檢測，內(nèi)參選擇GAPDH。

信號傳導激動劑對小鼠肝細胞ARIP2 mRNA轉(zhuǎn)錄的影響。取出過夜培養(yǎng)的細胞一份，將培養(yǎng)液更換為含有2%濃度的FCS的DMEM培養(yǎng)基，并以5 ng/ml的濃度加入Activin A，200 nmol/L的濃度加入A23187，20 nmol/L的濃度加入PMA，2.5 μg/ml的濃度加LPS，對照選擇單純使用DMEM培養(yǎng)的細胞，在溫度37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后收集細胞，使用Trizol試劑進行總RNA的提取，使用RT-PCR方法對ARIP2的mRNA轉(zhuǎn)錄水平進行檢測。

ARIP2過表達對小鼠肝細胞ActR mRNA轉(zhuǎn)錄的影響。取出過夜培養(yǎng)的細胞一份，首先使用不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)液對細胞進行1次洗滌，然后按說明書的操作要求，使用Lipofectamine 2000進行轉(zhuǎn)染，分別將0.3 μg的pcDNA3空質(zhì)粒，0.3 μg的pcDNA3-ARIP2表達質(zhì)粒，0.1 μg的pcDNA3-ARIP2+0.2 μg的pcDNA3轉(zhuǎn)染至小鼠肝細胞中，并加入終濃度為5 ng/ml的Activin A，培養(yǎng)24 h，然后收集細胞，使用Trizol試劑進行總RNA的提取，使用RT-PCR方法對ActRⅡA和ActRⅡB的mRNA轉(zhuǎn)錄水平進行檢測。

PCR條件設定為：循環(huán)前于95℃進行90s的預變性； 循環(huán)為94℃進行45s變性，54℃進行30 s退火，72℃延伸1 min，共循環(huán)30次；循環(huán)結(jié)束后再于72℃進行10 min的延伸。然后使用瓊脂糖凝膠電泳對PCR擴增產(chǎn)物進行檢測，并使用凝膠成像系統(tǒng)進行觀察和掃描。使用的引物序列具體情況見表1。

表1 PCR擴增時所用的引物序列

2 結(jié)果

2.1 Activin A對小鼠肝細胞ARIP2 mRNA轉(zhuǎn)錄的影響

Activin A能夠刺激小肝細胞的ARIP2表達增加，在作用早期，4 h時，ARIP2 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平無變化，隨后ARIP2 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平隨時間的增加而升高。見圖1。

2.2 ARIP2過表達對小鼠肝細胞ActRⅡ mRNA轉(zhuǎn)錄的影響

ARIP2的過表達對Activin A誘導的小鼠肝細胞的ActRⅡA mRNA的轉(zhuǎn)錄具有抑制作用，而對ActRⅡB mRNA的轉(zhuǎn)錄無影響。見圖2。

3 討論

Activin具有促進垂體細胞分泌卵泡刺激素的作用，還可以作為分泌因子作用于多種細胞，對細胞的增殖、分化、凋亡、胚胎的發(fā)育等進行調(diào)控，同時還是炎癥恢復和組織修復的調(diào)節(jié)因子，屬于多功能的生長、分化因子[6-9]。

近年來，許多研究發(fā)現(xiàn)，Activin A在肝細胞的再生修復、肝纖維的形成中具有重要的作用，對肝細胞的生長具有明顯的影響作用[10-12]。ARIP是一種激活素信息傳導調(diào)控蛋白，組織特異性十分明顯，是Activin組織特異性的決定因子，分為ARIP1和ARIP2兩種。ARIP1主要存在于大腦組織中，而ARIP2則存在于多種組織當中，在肝細胞中，ARIP2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平具有很高的表達[13-15]。

本組研究結(jié)果顯示，Activin A能夠刺激小肝細胞的ARIP2表達增加，其轉(zhuǎn)錄水平隨作用時間的增加而升高，說明Activin A能夠促進肝細胞的生長，這與文獻報道中的結(jié)果一致。ARIP2的過表達對Activin A誘導的小鼠肝細胞的ActRⅡA mRNA的轉(zhuǎn)錄具有抑制作用，提示ARIP2在肝細胞中，能夠起到激活信號傳導的負調(diào)節(jié)作用。

圖1 Activin A對小鼠肝細胞ARIP2 mRNA轉(zhuǎn)錄的影響

1：小鼠肝細胞+pcDNA3,2:小鼠肝細胞+Activin A+pcDNA3,3:小鼠肝細胞+Activin A+pcDNA3-ARIP2+pcDNA3，4：小鼠肝細胞+Activin A+pcDNA3-ARIP2

圖2 ARIP2過表達對小鼠肝細胞ActRⅡ mRNA轉(zhuǎn)錄的影響

因此，根據(jù)本組研究結(jié)果提示，如果能夠?qū)⒏渭毎麅?nèi)的ARIP2的表達水平進行上調(diào)，則可以通過其對激活信號傳導的負調(diào)節(jié)作用，抑制Activin在肝細胞中的誘導作用，對Activin誘導的肝病的進程進行阻斷，從而起到治療肝病的目的。

綜上所述，ARIP2的表達受到多種因素的影響，ARIP2通過對小鼠肝細胞ActRⅡA表達的影響，參加激活素作用信號傳導的負反饋調(diào)控，通過上調(diào)ARIP2在肝細胞上的表達，可能達到治療肝病的目的。

[1]崔雪玲，葛敬巖，李晨光，等.激活素受體相互作用蛋白1及2在小鼠巨噬細胞中的表達[J].中國生物制品學雜志，2012，25(2)：161.

[2]Liu ZH,Tsuchida K,Matsuzaki T，et al.Characterization of isoforms of activin receptor-interacting protein 2 that augment activin signaling [J].J Endocrinol，2006，189(2):409.

[3]謝佳男，劉 妍，趙 陽，等.激活互受體相互作用蛋白1，2在小鼠腦神經(jīng)細胞中的共表達[J].中國生物制品學雜志,2013，26(7)：912.

[4]寧亞媛，寧 靜，張 敏，等.激活素受體相互作用蛋白2在ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化斑塊中表達的研究[J].臨床薈萃，2011，26(7)：594.

[5]Qi Y,Ge JY,Wang YN， et al.Co-expression of activin receptor-interacting protein 1 and 2 in mouse nerve cells[J].Neurosci Lett，2013，(10):542.

[6]Liu HY,Wang YN,Ge JY,et al.Localisation and role of activin receptor-interacting protein 1 in mouse brain[J].J Neuroendocrinol,2013，25(1)：87.

[7]Liu HY,Chen FF,Ge JY,et al.Expression and localization of activin receptor-interacting protein 2 in mouse tissues[J].Gen Comp Endocrinol，2009，161(2)：276.

[8]Zhang HJ,Tai GX,Zhou J，et al.Regulation of activin receptor-interacting protein 2 expression in mouse hepatoma Hepa1-6 cells and its relationship with collagen type IV[J].World J Gastroenterol，2007，13(41):5501.

[9]Gao RF,Li ZD,Jiang J,et al.hARIP2 is a putative growth-promoting factor involved in human colon tumorigenesis[J].Asian Pac J Cancer Prev,2014，15(20)：8581.

[10]Jin Q,Zhong Y,Mulder KM.Requirement for protein kinase A in the phosphorylation of the TGFβ receptor-interacting protein km23-1 as a component of TGFβ downstream effects[J].Exp Cell Res，2013，319(6)：897.

[11]Nagashima S,Kodaka M,Iwasw H，et al.MAGI2/S-SCAM outside brain[J].J Biochem，2015，157(4):177.

[12]Li ZD,Wu Y,Bao YL,et al.Identification and characterization of human ARIP2 and its relation to breast cancer[J].Cytokine,2009，46(2)：251.

[13]Mahmoudabady M,Mathieu M,Dewachter L,et al.Activin-A,transforming growth factor-beta,and myostatin signaling pathway in experimental dilated cardiomyopathy[J].J Card Fail，2008，14(8)：703.

[14]Kurisaki A,Inoue I,Kurisaki K,et al.Activin induces long-lasting N-methyl-D-aspartate receptor activation via scaffolding PDZ protein activin receptor interacting protein 1[J].Neuroscience，2008，151(4):1225.

[15]Adams S,Pankow S,Werner S,et al.Regulation of NF-kappaB activity and keratinocyte differentiation by the RIP4 protein:implications for cutaneous wound repair[J].J Invest Dermatol,2007，127(3)：538.

Investigate the expression and regulation of Activin Receptor-interacting Protein 2 in mouse hepatic cells

LINRui-xin,WUJia-cheng,YOUGuang-qiang,etal.

(DepartmentofH.B.P,theSecondHospitalofJilinUniverrsity,Changchun130041,China)

Objective To investigate the expression and regulation of Activin Receptor-interacting Protein 2 in mouse hepatic cells.Methods The transcription level of ARIP2 mRNA in mouse hepatic cells was tested by RT-PCR and the factors regulating the expression were explored.Results Time-dependent increase of transcription level of ARIP2 in mouse hepatic cells was stimulated by Activin A.The transcription level of ARIP2 was increased significantly by the stimulation of Activin A，PMA and LPS,was decreased significantly by the stimulation of A23187.The transcription level of ActRⅡA was inhibited by the over expression of ARIP2,and the transcription level of ActRⅡB was not influenced.Conclusion The expression ARIP2 can be influenced by various factors,like Activin A，A23187，PMA and LPS.ARIP2 can participate in the negative feedback regulation of signal transduction by affecting the expression of ActRⅡA.

Activin Receptor-interacting Protein 2; mouse hepatic cells; expression; regulation

吉林省衛(wèi)生廳項目(2011Z087)

1007-4287(2017)08-1422-03

Q786

A

2017-04-12)

*通訊作者