超高效液相色譜法測定陳皮藿香湯中4種成分的含量

莊澤榮，梁詠倩，秦楠，宋粉云（廣東藥科大學藥學院，廣東廣州510006）

超高效液相色譜法測定陳皮藿香湯中4種成分的含量

莊澤榮，梁詠倩，秦楠，宋粉云
（廣東藥科大學藥學院，廣東廣州510006）

目的建立超高效液相色譜法測定陳皮藿香湯中維采寧-2、橙皮苷、川陳皮素、桔紅素4種成分質(zhì)量濃度的方法。方法 以Endeavorsil C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm，Dikma）柱為分離柱，流動相為甲醇（A）-0.2%（體積分數(shù)）甲酸（B），梯度洗脫。流速為0.3 mL/min，柱溫為25℃，進樣量為5 μL，檢測波長為300 nm。結(jié)果維采寧-2在4.20～12.6 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關系（r=0.999 2），平均回收率為97.4%，RSD為2.38%（n=6）；橙皮苷在9.52～78.4 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關系（r=0.999 9），平均回收率為98.9%，RSD為1.09%（n=6）；川陳皮素在4.00～12.0 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關系（r=0.999 7），平均回收率為100.3%，RSD為1.71%（n=6）；桔紅素在1.76～3.96 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關系（r=0.999 3），平均回收率為103.5%，RSD為1.22%（n=6）。結(jié)論本法操作簡單、重復性好，測定結(jié)果準確，可用于陳皮藿香湯的質(zhì)量控制，也可為含有該藥對的中藥成方制劑的質(zhì)量控制提供參考。關鍵詞：陳皮藿香湯；維采寧-2；橙皮苷；川陳皮素；桔紅素；超高效液相色譜法

陳皮藿香湯始載于《醫(yī)學從眾錄》第6卷，處方為陳皮5錢、藿香5錢，上用土澄清水2杯，煎1杯服之。以二藥治霍亂吐瀉，傷暑急暴［1］。陳皮藿香湯是將陳皮、廣藿香作為藥對配伍使用的開端，陳皮、廣藿香作為藥對配伍使用還有其他相關報道［2］。2015年版《中國藥典》中有24個成方制劑應用此藥對［3］，在《中藥成方制劑》中亦有78個方劑包含此藥對，然而有關該藥對中成分質(zhì)量分數(shù)測定的研究尚未見文獻報道。陳皮主要包含了揮發(fā)油、黃酮類和部分人體所需的微量元素等多種類別的化學成分［4］；廣藿香的成分主要分為揮發(fā)性成分與非揮發(fā)性成分2類［5-6］，其中廣藿香油成分分析一直是研究者們關注的研究熱點。而2015年版《中國藥典》中分別以橙皮苷和廣藿香醇作為陳皮和廣藿香質(zhì)量控制的指標性成分。本研究前期工作基礎顯示，維采寧-2為陳皮、廣藿香2味藥材的共有成分，橙皮苷、川陳皮素以及桔紅素則來源于陳皮［7-8］。本文以陳皮藿香湯為研究對象，建立了陳皮藿香湯中維采寧-2、橙皮苷、川陳皮素和桔紅素4種成分質(zhì)量濃度測定的超高效液相色譜法（UPLC法），可為陳皮藿香湯的質(zhì)量控制提供依據(jù)，也為含有該藥對中藥成方制劑的質(zhì)量控制提供參考。

1　儀器與試藥

ACQUITY UPLC-TUV系統(tǒng)（美國Waters公司），二元高壓泵、在線脫氣裝置、自動進樣器、柱溫箱；KQ5200型醫(yī)用超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，頻率25 kHz，功率100 W）；島津AY120型托盤電子分析天平（日本島津SHIMADZU）；TC-15恒溫電熱套（海寧市華星儀器廠）；中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；藥典檢驗篩（浙江飛達金屬砂篩廠）。

對照品橙皮苷（批號:110721-200512）購于中國食品藥品檢定研究院，維采寧-2（批號:16011122）購于上海同田生物科技有限公司，川陳皮素（批號: MUST-14060310）、桔紅素（批號:MUST-141124410）購于四川成都曼斯特生物科技有限公司，經(jīng)HPLC面積歸一化法測定質(zhì)量分數(shù)均大于98%，符合質(zhì)量分數(shù)測定要求。甲醇為色譜純（德國Merck公司），水為自制超純?nèi)ルx子水，其他試劑均為分析純。

12批陳皮藥材采集于不同時間、來源于不同產(chǎn)地，具體見表1；廣藿香于2013年11月購于廣東省湛江市遂溪縣，經(jīng)廣東藥科大學中藥學院中藥資源系劉基柱副教授鑒定，均符合2015年版《中國藥典》一部標準。

表1　12批陳皮藥材的批號、產(chǎn)地及采集時間Table 1 　The origins of 12 samples of Citri Reticulatae Pericarpium stored for different years

陳皮藿香湯為自制。制備方法:分別稱取陳皮、廣藿香藥材各5.0 g，加去離子水100 mL煎煮至約30 mL左右，過濾到50 mL容量瓶中。洗滌藥渣至無色，冷卻，用去離子水定容至刻度，即得。將表1中不同產(chǎn)地及采收時間陳皮、廣藿香按上述方法分別制備成12個批次的陳皮藿香湯，備用。

2　方法與結(jié)果

2.1溶液的制備

2.1.1對照品溶液的制備 分別取維采寧-2、川陳皮素和桔紅素對照品適量，精密稱定，分別置于25 mL容量瓶中，各加入70%（體積分數(shù)，下同）甲醇，制成每1 mL分別含維采寧-2 210 μg、川陳皮素200 μg、桔紅素220 μg的對照品儲備液。精密稱取橙皮苷適量，置于25 mL容量瓶中，加甲醇制成每1 mL含橙皮苷280 μg的橙皮苷對照品儲備液。分別精密量取維采寧-2、橙皮苷、川陳皮素、桔紅素對照品儲備液0.13、0.46、0.26、0.05 mL于5 mL容量瓶中，并用甲醇定容至刻度，制得維采寧-2、橙皮苷、川陳皮素、桔紅素質(zhì)量濃度分別為5.46、25.8、10.4、2.20 μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.2供試品溶液的制備 精密量取陳皮藿香湯5 mL至25 mL容量瓶中，加15 mL 70%甲醇超聲15 min，冷卻，70%甲醇定容至刻度，濾過，取續(xù)濾液，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱:Endeavorsil C18（2.1 mm×50 mm，1.8 μm，Dikma）柱；流動相:甲醇（A）-0.2%（體積分數(shù)，下同）甲酸（B）梯度洗脫，洗脫程序 0～6 min，10%A；6～8 min，10%A→15%A；8～15 min，15%A；15～25 min，25%A；25～35 min，40%A；35～38 min，80%A；38～40 min，90%A；40～45 min，10%A。進樣量:5 μL；流速:0.3 mL/min；檢測波長:300 nm；柱溫:25℃。分別精密吸取混合對照品、供試品溶液各5 μL，按照上述色譜條件進行測定，理論塔板數(shù)以維采寧-2峰計算應不低于5 000，維采寧-2、橙皮苷、川陳皮素、桔紅素峰的拖尾因子分別為0.88、1.15、1.14、1.14，保留時間分別約為15.1、22.5、31.5、32.6 min，4種成分峰與其他組分峰的分離度均大于1.5。色譜圖見圖1。

圖1　混合對照品（A）、供試品（B）溶液的UPLC色譜圖Figure 1 UPLC Chromatograms of reference substances（A）and samples（B）

2.3方法學考察

2.3.1陳皮藿香湯中4種成分線性關系、檢測限及定量限的考察 分別精密吸取維采寧-2對照品儲備液0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL，橙皮苷對照品儲備液0.85、2.25、4.00、5.00、7.00 mL，川陳皮素對照品儲備液0.50、0.75、1.00、1.25、1.50 mL，桔紅素對照品儲備液0.20、0.25、0.30、0.35、0.40 mL，置于25 mL容量瓶加甲醇定容，制備成5份不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。其中維采寧-2質(zhì)量濃度分別為4.20、6.30、8.40、10.5、12.6 μg/mL，橙皮苷質(zhì)量濃度分別為9.52、25.2、44.8、56.0、78.4 μg/mL，川陳皮素質(zhì)量濃度分別為4.00、6.00、8.00、10.0、12.0 μg/mL，桔紅素質(zhì)量濃度分別為1.76、2.20、2.64、3.08、3.96 μg/mL。分別精密吸取上述混合對照品溶液5 μL注入液相色譜儀，按“2.2”項下色譜條件測定。以各成分峰面積（A）對對照品質(zhì)量濃度（ρ）進行線性回歸，得各成分回歸方程。以S/N=3時的質(zhì)量濃度計為檢測限，以S/N=10時的質(zhì)量濃度計為定量限，結(jié)果見表2。

2.3.2精密度試驗 精密吸取維采寧-2、橙皮苷、川陳皮素、桔紅素質(zhì)量濃度為5.46、25.8、10.4、2.10 μg/mL的對照品溶液5 μL，按照“2.2”項下色譜條件分別連續(xù)測定6次，結(jié)果維采寧-2、橙皮苷、川陳皮素、桔紅素峰面積平均值的RSD值分別為2.97%、0.15%、0.25%、2.31%，表明儀器精密度良好。

2.3.3穩(wěn)定性試驗 取同一份陳皮藿香湯（編號1）5 mL，按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，分別于0、3、6、9、12 h按照“2.2”項下色譜條件進樣分析，記錄供試品溶液中4種成分的峰面積，結(jié)果維采寧-2、橙皮苷、川陳皮素、桔紅素峰面積平均值的RSD值分別為1.34%、1.40%、0.62%、0.83%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4重復性試驗 取同一批陳皮藿香湯（編號1）6份，分別按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.2”項下色譜條件進樣分析，測定供試品中4種化學成分的質(zhì)量濃度，結(jié)果維采寧-2、橙皮苷、川陳皮素、桔紅素的平均質(zhì)量濃度分別為0.033 9、0.193 3、0.022 8、0.009 9 mg/mL，RSD分別為2.96%、0.70%、0.63%、0.64%，表明本法重復性良好。

2.3.5加樣回收率試驗 分別精密量取已知質(zhì)量濃度（維采寧-2、橙皮苷、川陳皮素、桔紅素質(zhì)量濃度分別為0.034 2、0.195 2、0.021 9、0.009 9 mg/mL）的陳皮藿香湯（編號1）6份，每份2.5 mL，分別精密加入維采寧-2、橙皮苷、川陳皮素、桔紅素質(zhì)量濃度分別為210、400、200、220 μg/mL的對照品溶液0.04、1.25、0.30、0.10 mL，分別按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.2”項下色譜條件測定，計算加樣回收率。結(jié)果見表3。維采寧-2平均回收率為97.4%，RSD值為2.38%；橙皮苷平均回收率為98.9%，RSD值為1.09%；川陳皮素平均回收率為100.3%，RSD值為1.71%；桔紅素平均回收率為 103.5%，RSD值為1.22%。結(jié)果表明本方法準確可靠。見表3。

2.4樣品的測定

分別取表1中12批不同產(chǎn)地的陳皮藥材和廣藿香藥材適量，按“1”項下方法制備12批陳皮藿香湯，分別量取5 mL，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.2”項下色譜條件測定，以標準曲線法計算各批次陳皮藿香湯中4種成分的質(zhì)量濃度，結(jié)果見表4。

表2　陳皮藿香湯中4種成分的回歸方程、相關系數(shù)、線性范圍、檢測限及定量限Table 2 Calibration curves，correlation coefficients，linearity range，LOD and LOQ of 4 components from Chenpi Huoxiang decoction

表3　陳皮藿香湯中4種成分的回收率試驗結(jié)果Table 3 Recovery results of 4 components from Chenpi Huoxiang decoction（n=6）

表4　12批陳皮藿香湯中4種待測成分的質(zhì)量濃度Table 4 Contents of 4 components from 12 batches of Chenpi Huoxiang decoction（n=3）

3　討論

3.1供試品溶液制備方法的選擇

考察了不同體積分數(shù)甲醇對提取液所得各測定組分質(zhì)量濃度的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用70%甲醇為溶劑時，提取效果較好；以70%甲醇為溶劑，考察了不同超聲時間的提取效果，結(jié)果表明超聲15 min后可以認為各成分已經(jīng)提取完全。最終確定的提取方法為70%甲醇超聲提取15 min。

3.2流動相的選擇

嘗試了多種不同比例的甲醇-0.2%甲酸流動相后發(fā)現(xiàn)，在15～25 min內(nèi)，只有較緩的梯度比例，才可以更好地分離橙皮苷和其他相鄰色譜峰。采用梯度洗脫法，經(jīng)反復試驗調(diào)整得到本文的流動相洗脫程序，在此色譜條件下各成分分離度和保留時間均符合要求。

3.3檢測波長的選擇

根據(jù)文獻［7-8］報道，將對照品維采寧-2、橙皮苷、川陳皮素和桔紅素配制成一定質(zhì)量濃度的溶液，在200～450 nm波長范圍內(nèi)進行紫外掃描，得到維采寧-2、橙皮苷、川陳皮素和桔紅素最大吸收波長分別為320、285、332、316 nm。在此基礎上，出于檢測時各色譜峰的響應值要求以及降低干擾因素對質(zhì)量濃度測定的影響進行綜合考慮，選擇300 nm為檢測波長。

本試驗將不同產(chǎn)地、不同采收時間的12批陳皮與廣藿香配伍，自制成陳皮藿香湯，采用UPLC法測定陳皮藿香湯中4種成分的質(zhì)量濃度。由于受到環(huán)境等外界因素影響，不同產(chǎn)地的陳皮質(zhì)量不一，各成分質(zhì)量濃度存在很大的差異，無法根據(jù)所測定的成分質(zhì)量濃度判斷不同產(chǎn)地陳皮的質(zhì)量優(yōu)劣。但是，根據(jù)結(jié)果顯示，同一產(chǎn)地的陳皮與廣藿香配伍制成的陳皮藿香湯，所測定成分質(zhì)量濃度隨藥材儲存時間的增加多數(shù)有上升趨勢，其中橙皮苷質(zhì)量濃度的上升趨勢最為明顯，這與文獻［9-10］報道的相一致。

本試驗首次建立了同時測定陳皮藿香湯中4種組分質(zhì)量濃度的UPLC法，測得的各組分之間具有良好的分離度，且在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關系良好，精密度高、重復性及回收率好，可為陳皮藿香湯及含有陳皮-廣藿香藥對的中藥成方制劑的質(zhì)量控制研究提供可靠參考。

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［9］林林，林子夏，莫云燕，等.不同年份新會陳皮總黃酮及橙皮苷含量動態(tài)分析［J］.時珍國醫(yī)國藥，2008，19（6）: 1432-1433.

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（責任編輯：劉曉涵）

Simultaneous determination of four components from Chenpi Huoxiang decoction by UPLC

ZHUANG Zerong，LIANG Yongqian，QIN Nan，SONG Fenyun
（School of Pharmacy，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China）

Objective To develop an ultra high performance liquid chromatographic（UPLC）method for the simultaneous determination of vicenin-2，hesperidin，nobiletin and tangeretin from Chenpi Huoxiang decoction.Methods The separation was performed on Endeavorsil C18column with methanol（A）and 0.2% formic acid（B）as the mobile phase of gradient elution at a flow rate of 0.3 mL/min.The column temperature was 25℃.The sample volume was 5 μL and the detection wavelength was set at 300 nm. Results The linear range of vicenin-2 was 4.20-12.6 μg/mL（r=0.999 2）.Its average recovery was 97.4% with RSD of 2.38%（n=6）.The linear range of hesperidin was 9.52-78.4 μg/mL（r=0.999 9），and its average recovery was 98.9%with RSD of 1.09% （n=6）.The linear range of nobiletin was 4.00-12.0 μg/mL（r=0.999 7），and its average recovery was 100.3%with RSD of 1.71%（n=6）.The linear range of tangeretin was 1.76-3.96 μg/mL（r=0.999 3），and its average recovery for tangeretin was 103.5%with RSD of 1.22% （n=6）.Conclusion The method is simple，accurate，reproducible，and suitable for the quality control of Chenpi Huoxiang decoction.

Chenpi Huoxiang decoction；vicenin-2；hesperidin；nobiletin；tangeretin；UPLC

R284.1

A

1006-8783（2016）04-0439-05

10.16809/j.cnki.1006-8783.2016060602

2016-06-06

上海市藥物（中藥）代謝產(chǎn)物研究重點實驗室開放課題（2015SHDX1001）；國家大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目（201510573001）

莊澤榮（1993—），男，2013級本科生，Email:1091318015@qq.com；通信作者:宋粉云（1965—），女，教授，從事現(xiàn)代分析方法在中藥質(zhì)量控制中的應用研究，電話:020-39352136，Email:songfenyun2011@163.com。

網(wǎng)絡出版時間:2016-07-06 10:44 網(wǎng)絡出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160706.1044.004.html