• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    翹嘴鱖miR-146a在胚胎發(fā)育過程中的表達及溫度對其表達的影響

    2015-12-24 01:37:39汪建華張建社褚武英
    湖南師范大學自然科學學報 2015年5期
    關鍵詞:水溫胚胎時期

    朱 鑫,易 潭,陳 琳,吳 萍,汪建華,陳 韜,張建社,褚武英

    (1. 長沙學院生物與環(huán)境工程系,中國 長沙 410003;2.湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,中國 長沙 410128)

    ?

    翹嘴鱖miR-146a在胚胎發(fā)育過程中的表達及溫度對其表達的影響

    朱鑫1, 2#,易潭1,2#,陳琳1,吳萍1,汪建華1,陳韜2,張建社1,褚武英1

    (1. 長沙學院生物與環(huán)境工程系,中國 長沙410003;2.湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,中國 長沙410128)

    摘要為了解翹嘴鱖胚胎發(fā)育中miR-146a的表達規(guī)律以及溫度對miR-146a表達的影響,將翹嘴鱖受精卵分別在22 ℃和25 ℃水溫下孵化,并利用實時熒光定量方法檢測miR-146a在各個發(fā)育階段的表達.結果顯示,在22 ℃孵化時,miR-146a的表達在原腸期前處于較高水平且各時期表達沒有顯著性差異(P>0.05),在尾芽期后出現(xiàn)顯著性降低(P<0.05),并在出膜時達到最低值;在25 ℃孵化時,miR-146a的表達直到神經(jīng)胚期仍處于較高水平且各時期表達沒有顯著性差異(P>0.05),發(fā)育進入尾芽期后表達顯著降低(P<0.05),在肌效期達到最低值;miR-146a在25 ℃水溫孵化時的表達較22 ℃孵化同時期的表達都出現(xiàn)顯著降低(P<0.05).研究表明,miR-146a可能主要在胚胎發(fā)育后期起到調控胚胎發(fā)育的作用,在尾芽期后通過下調表達來促進胚胎的發(fā)育;并且溫度能影響miR-146a的表達,溫度升高會降低miR-146a在胚胎發(fā)育各個時期的表達,將有利于胚胎的發(fā)育.

    關鍵詞翹嘴鱖;miR-146a;發(fā)育性表達;胚胎發(fā)育;溫度調節(jié)

    ExpressionAnalysisofSiniperca ChuatsiMiR-146aDuringEmbryonic

    上世紀80年代,隨著鱖魚人工繁殖獲得成功,我國開始大規(guī)模推廣鱖魚養(yǎng)殖,使之成為我國主要名貴養(yǎng)殖魚類之一.翹嘴鱖因其肉質細嫩而鮮美,無小刺,且富含蛋白質,現(xiàn)已成為水產(chǎn)品市場的緊俏商品和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的重要品種[1].深入探索翹嘴鱖的發(fā)育機制能夠為魚類發(fā)育生物學研究和水產(chǎn)養(yǎng)殖提供一些有價值的參考資料.

    microRNA(miRNA) 是真核生物中一類進化上保守的參與調控基因表達的非編碼小分子RNA.它通過與靶基因3′端非翻譯區(qū)互補配對來促進靶mRNA降解或翻譯抑制,在基因表達中起著負調控作用[2-3].miRNA在胚胎發(fā)育、細胞增殖與分化、腫瘤發(fā)生和新成代謝等一系列生物過程中發(fā)揮重要的作用[4-5],但是有關miRNA在胚胎的表達特性及其在魚類早期發(fā)育中的功能研究還很少.早期的研究表明miRNA對胚胎發(fā)育起到重要作用.鼠和人的胚胎干細胞在發(fā)育形成胚胎小體時,胚胎干細胞中一些特定的miRNA的表達會下調[6-7],缺失miRNA的鼠和斑馬魚胚胎在原腸胚形成、神經(jīng)發(fā)育、體節(jié)形成時出現(xiàn)發(fā)育畸形甚至停滯[8-9].Kuang等[10]發(fā)現(xiàn)miR-146a能夠與Numb基因的3′端非翻譯區(qū)互補配對,并且驗證了miR-146a能夠抑制Numb的表達,而Numb調控的靶基因Notch參與一系列胚胎發(fā)育和形態(tài)形成過程,如成肌細胞的增殖、神經(jīng)發(fā)育和體節(jié)形成[11],因此可以推斷miR-146a很可能參與調控胚胎的發(fā)育.

    水溫可以改變胚胎發(fā)育所需時間,較高的孵化溫度能加速魚類胚胎的發(fā)育速率,縮短孵化所需的時間[12].何利君[13]的研究顯示,翹嘴鱖胚胎發(fā)育在21,25和27 ℃下,分別經(jīng)過74.05,56.73和48.37h孵育后出膜.在適宜溫度范圍內,適當升溫可以加快胚胎發(fā)育的進程,但miRNA是否參與到水溫影響翹嘴鱖胚胎發(fā)育的分子機制中尚不明確.在本研究中,我們分別在22和25℃水溫下孵化翹嘴鱖的受精卵,并利用實時熒光定量的方法檢測miR-146a在幾個重要發(fā)育階段的表達,以此了解miR-146a在胚胎發(fā)育進程中的表達模式及水溫對miR-146a表達的影響.

    1材料與方法

    1.1實驗魚

    實驗用親魚為湖南省水產(chǎn)科學研究所無病無傷、體格健壯、性腺成熟度好的翹嘴鱖,雌性個體為體質量1.0kg以上的2~4齡魚,雄性個體為體質量0.75kg以上的2~4齡魚.

    1.2方法

    1.2.1不同溫度下胚胎的孵化和取樣使用寧波市激素制品有限公司生產(chǎn)的絨毛膜促性腺激素(HCG)、促黃體生成素釋放激素類似物和鯉鯽魚腦垂體(PG)對親魚進行人工催產(chǎn),操作方法參考劉希良[14]等文獻報導.將受精卵置于直徑15cm的玻璃培養(yǎng)皿中,每個培養(yǎng)皿放200~300顆,分別在22 ℃和25 ℃的水溫中孵化.期間,每半小時更換一次曝氣水以保證溶氧充足.自受精后定時將翹嘴鱖魚卵置于顯微鏡下觀察翹嘴鱖胚胎的發(fā)育進程,當所有魚卵半數(shù)以上達到某個時期時確定為到達該時期.當受精卵進入二細胞、囊胚、原腸、神經(jīng)、尾芽、肌效、心搏、出膜期時,分別取適量受精卵置于裝有Trizol的2mL離心管中,每個時期取5管平行樣,置于-20 ℃冰箱保存.

    1.2.2總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成保存于Trizol中的受精卵用破口槍頭吸打數(shù)次,直至胚胎全部破碎,然后置于裝有1mLTrizol的離心管中.總RNA提取流程參照TrizolReagent(Invitrogen)說明書操作.所有總RNA樣品分別取1μL作為模板,按照OneStepPrimeScriptmiRNAcDNAsynthesisKit試劑盒(寶生物公司,大連)的說明進行逆轉錄,合成的cDNA第一鏈,于4 ℃冰箱保存待用.

    1.2.3實時熒光定量檢測miR-146a的表達根據(jù)Chu等[15]建立的鱖魚miRNA文庫,設計miR-146a特異性的上游引物,以管家基因β-actin作為胚胎發(fā)育階段樣品的內參基因[16].用Primer5.0軟件設計熒光定量PCR的引物,引物由上海鉑尚生物公司合成 (見表1).取2μL逆轉錄好的cDNA為模板,加入12.5μLSYBRPremixExTaqⅡ (寶生物公司, 大連),1μL特異性的上游引物和1μL通用下游引物(Uni-miRqPCRPrimer, 10μmol/L, 寶生物公司), 8.5μL的無菌水,總體積25μL,擴增反應在Bio-RadCFX96system(USA)上進行.擴增條件為:(1)95 ℃預變性60s;(2)擴增和定量,95 ℃變性5s,60 ℃退火和延伸25s,重復40個循環(huán).(3) 繪制融解曲線(65~95 ℃,每0.1 ℃檢測一次熒光值).

    表1 熒光定量檢測用引物

    注:miR-146a定量所使用的下游引物為通用引物,序列未公布,購自寶生物工程(大連)有限公司(濃度:10μmol/L).

    1.2.4數(shù)據(jù)處理相對表達結果計算公式為R=2-ΔΔCt,其中Ct值為PCR反應循環(huán)閾值,ΔΔCt的計算公式為:ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct內參基因)實驗組-(Ct目的基因-Ct內參基因)對照組.采用SPSS12.0軟件對所得相對表達豐度數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-wayANOVA),并采用最小顯著差數(shù)法(LSD)進行多重比較(P<0.05表示顯著性差異,P<0.01表示差異極顯著),結果以平均值±標準誤差(Mean±SE,n=5)表示.

    2結果與分析

    2.1miR-146a在胚胎發(fā)育性表達

    有文獻報道m(xù)iRNA在不同的細胞和不同的發(fā)育階段有差異性的表達,并且它們參與細胞的生長、分化以及凋亡等過程[17-18].目前miRNA在魚類胚胎發(fā)育階段的表達研究還較少,且暫未有文獻報道m(xù)iR-146a在魚類胚胎的發(fā)育性表達.圖1結果顯示,胚胎在22 ℃水溫孵化下,miR-146a的表達在發(fā)育早期處于較高水平,其中原腸期前的各時期表達沒有顯著性差異,進入尾芽期后顯著性地降低,并持續(xù)降低,在出膜期時達到最低水平.而在25 ℃孵化時,miR-146a的表達在神經(jīng)期前處于較高水平且各時期都沒有顯著性差異,在尾芽期顯著性地降低,在肌效期達到最低值,心搏期和出膜期處于較低水平并且之間沒有顯著性差異(圖1).

    圖1 miR-146a在翹嘴鱖受精卵不同發(fā)育時期的相對表達情況.A和B分別為miR-146a在22 ℃和25 ℃水溫孵化下不同時期的發(fā)育性表達.相對表達值為平均值±標準誤差(n=5).不同的字母代表存在顯著性差異(P<0.05)Fig.1 Detection of miR-146a expression at different embryonic developmental stages. A, B represent miR-146a expressed at different embryonic developmental stages when incubation under 22 ℃and 25 ℃ water temperature, respectively. Values are the mean ±SE, n=5. The different letters indicate significant differences between columns (P<0.05)

    2.2miR-146a在不同溫度孵化下的差異性表達

    圖1的結果顯示溫度影響了miRNA在胚胎發(fā)育中的表達.當比較胚胎發(fā)育同一時期在22 ℃和25 ℃水溫孵化下miR-146a的表達時發(fā)現(xiàn),miR-146a在25 ℃水溫孵化時的表達較22 ℃孵化下同時期的表達都出現(xiàn)顯著性地降低,其中除出膜期外,其他時期的表達差異極顯著(P<0.01)(圖2).

    圖2 miR-146a在翹嘴鱖受精卵不同水溫孵化下,同一時期的差異性表達.每個時期均以22 ℃孵化下的表達值作為對照,*代表顯著性差異(P<0.05),**代表差異極顯著(P<0.01)Fig.2 The contrastive expression of miR-146a incubated under different water temperature. The data was expressed as the relative change compared with the expression level of each stage incubated under 22 ℃, asterisk (*) indicates significant difference (P<0.05), double asterisk (**) indicates significance at P<0.01

    3討論

    miR-146a最初被發(fā)現(xiàn)在miRNA中參與天然免疫應答,當單核細胞受到細菌內毒素侵襲時,miR-146a的表達顯著上調[19].近年來許多文獻報道,miR-146a調節(jié)的許多靶基因參與了細胞分化的作用,但這些研究主要集中在分析miR-146a對造血細胞的分化作用,而miR-146a對胚胎發(fā)育的作用暫未見到相關報道.Kuang等[10]的研究驗證了miR-146a能夠抑制Numb的表達.Numb是一種進化保守蛋白,其作為內源性細胞命運決定因子,對細胞分裂的命運起決定作用.Numb對胚胎早期神經(jīng)和肌肉的發(fā)育作用也已經(jīng)被證明[20-21].Numb作為一個重要的細胞命運決定蛋白,參與Notch的負性調控,兩者的平衡決定了細胞分化的方向[22].Notch信號轉導通路作為生物發(fā)育分化中高度保守的通路,通過與配體的相互作用產(chǎn)生級聯(lián)瀑布效應,參與細胞發(fā)育過程中分化方向的選擇,并對細胞的增殖及凋亡也起著重要的作用[23-24].Notch信號通路在胚胎發(fā)育中起到調節(jié)細胞增殖和決定細胞命運的作用[25].激活Notch信號能夠促進肌原細胞的增殖,并降低MyoD和myogenin的表達來延遲成肌細胞的分化[26].miR-146a及其靶基因的研究為進一步了解miR-146a在胚胎發(fā)育中潛在的作用提供了一些重要的理論依據(jù).

    翹嘴鱖miR-146a胚胎發(fā)育性表達結果顯示,在22 ℃和25 ℃水溫孵化下,miR-146a表達規(guī)律趨勢總體相似,但在不同溫度下,miR-146a的表達在幾個時期經(jīng)歷了微調,說明溫度確實影響了miR-146a的表達.本文結果顯示在胚胎發(fā)育早期(二細胞到神經(jīng)胚期)miR-146a的表達趨于穩(wěn)定且處于較高水平(除22 ℃神經(jīng)胚期有顯著性上升),在進入尾芽期后表達都顯著性地降低.Giraldez等[27]的研究表明miRNA的作用并不是在發(fā)育早期決定細胞的命運而是影響發(fā)育后期組織的發(fā)育和形成,而在神經(jīng)胚期前胚胎的大部分組織器官還未開始分化,本文結果與Giraldez等的結論相符.胚胎發(fā)育經(jīng)過神經(jīng)胚期后,是器官形成的主要階段,而本文結果顯示miR-146a的表達在尾芽期顯著降低,表明miR-146a的靶基因在這個階段后受到其抑制作用將明顯降低,并推測miR-146a的靶基因的作用可能是促進胚胎發(fā)育的.Kuang等[10]的研究發(fā)現(xiàn)Numb是miR-146a的靶基因,Numb能夠促進胚胎早期神經(jīng)和肌肉的發(fā)育[20-21],Numb參與調節(jié)的Notch信號通路也對胚胎的發(fā)育起到重要的作用.

    溫度是影響魚類胚胎發(fā)育的一個主要的外在因子.大量研究表明,在適宜溫度下,隨著水溫的升高,胚胎的發(fā)育進程加快,孵化所需時間縮短[28-29],但是miRNA的表達是否受到溫度的影響還未見相關報道.從圖2可以看出,在25 ℃孵化時,miR-146a在不同階段的表達都比22 ℃時出現(xiàn)顯著性降低.這一結果表明溫度升高能降低miR-146a的表達,從而調節(jié)胚胎的發(fā)育.有研究表明肌纖維增生和增粗的速率在較高的水溫孵化時都會升高,但是溫度對肌纖維的增粗效果強于增生[5].在25 ℃孵化時,miR-146a的表達顯著性降低能增強Numb對Notch信號通路的抑制作用,促進成肌細胞的分化,從而有利于胚胎中肌肉組織形成.這一結果表明了miR-146a在參與水溫調節(jié)胚胎發(fā)育的過程中是通過下調來促進發(fā)育的.

    4結論

    研究表明,miR-146a在胚胎發(fā)育早期(神經(jīng)期前)的作用不明顯.在胚胎發(fā)育后期(尾芽期至出膜),miR-146a通過下調其表達來促進胚胎的發(fā)育.而水溫升高能顯著降低miR-146a在胚胎發(fā)育每個時期的表達,減少其對靶基因Numb的抑制,發(fā)揮促進細胞分化的作用,從而有利于胚胎發(fā)育的進程.

    參考文獻:

    [1]李玉瓏,農(nóng)小獻,李虹輝,等. 鱖魚生肌調節(jié)因子MyoD的克隆及其發(fā)育表達分析[J].湖南師范大學自然科學學報, 2013,36(4):63-68.

    [2]LIUJ.ControlofproteinsynthesisandmRNAdegradationbymicroRNAs[J].CurrOpinCellBiol, 2008,20(2):214-221.

    [3]XIEX,LUJ,KULBOKASEJ, et al.Systematicdiscoveryofregulatorymotifsinhumanpromotersand3′UTRsbycomparisonofseveralmammals[J].Nature, 2005,434(7031):338-345.

    [4]FUY,SHIZ,WUM, et al.IdentificationanddifferentialexpressionofmicroRNAsduringmetamorphosisoftheJapaneseflounder(Paralichthys olivaceus)[J].PLoSOne, 2011,6(7):e22957.

    [5]SONGL,TUANRS.MicroRNAsandcelldifferentiationinmammaliandevelopment[J].BirthDefectsResCEmbryoToday, 2006,78(2):140-149.

    [6]HOUBAVIYHB,MURRAYMF,SHARPPA.Embryonicstemcell-specificmicroRNAs[J].DevCell, 2003,5(2):351-358.

    [7]SUHMR,LEEY,KIMJY, et al.HumanembryonicstemcellsexpressauniquesetofmicroRNAs[J].DevBiol, 2004,270(2):488-498.

    [8]BERNSTEINE,KIMSY,CARMELLMA, et al.Dicerisessentialformousedevelopment[J].NatGenet, 2003,35(3):215-217.

    [9]GIRALDEZAJ,CINALLIRM,GLASNERME, et al.MicroRNAsregulatebrainmorphogenesisinzebrafish[J].Science, 2005,308(5723):833-838.

    [10]KUANGW,TANJ,DUANY, et al.CyclicstretchinducedmiR-146aupregulationdelaysC2C12myogenicdifferentiationthroughinhibitionofNumb[J].BiochemBiophysResCommun, 2009,378(2):259-263.

    [11]CONBOYIM,RANDOTA.TheregulationofNotchsignalingcontrolssatellitecellactivationandcellfatedeterminationinpostnatalmyogenesis[J].DevCell, 2002,3(3):397-409.

    [12]KINNEO,KINNEEM.Ratesofdevelopmentinembryosofacyprinodontfishexposedtodifferenttemperature-salinity-oxygencombinations[J].CanJZool, 1962,40(2):231-253.

    [13]何利君. 溫度對鱖魚胚胎發(fā)育的影響[J]. 四川畜牧獸醫(yī)學院學報, 1999,13(4):19-22.

    [14]劉希良,賓石玉,王開卓,等. 翹嘴鱖的人工繁殖與胚胎發(fā)育觀察[J].廣西師范大學學報:自然科學版, 2013,31(2):100-106.

    [15]CHUWY,LIULS,LIYL, et al.SystematicidentificationanddifferentialexpressionprofilingofmicroRNAsfromwhiteandredmusclesofSiniperca chuatsi[J].CurrMolMed, 2013,13(8):1397-1407.

    [16]ZHOURX,MENGT,MENGHB, et al.SelectionofreferencegenesintranscriptionanalysisofgeneexpressionoftheMandarinfish, Siniperca chuasti[J].ZoolRes, 2010,31(2):141-146.

    [17]NEILSONJR,ZHENGGX,BURGECB, et al.DynamicregulationofmiRNAexpressioninorderedstagesofcellulardevelopment[J].GenesDev, 2007,21(5):578-589.

    [18]MCCARTHYJJ,ESSERKA.MicroRNA-1andmicroRNA-133aexpressionaredecreasedduringskeletalmusclehypertrophy[J].JApplPhysiol, 2007,102(1):306-313.

    [19]TAGANOVKD,BOLDINMP,CHANGKJ, et al.NF-kappaB-dependentinductionofmicroRNAmiR-146,aninhibitortargetedtosignalingproteinsofinnateimmuneresponses[J].ProcNatlAcadSciUSA, 2006, 103(33):12481-12486.

    [20]PETERSENPH,ZOUK,HWANGJK, et al.Progenitorcellmaintenancerequiresnumbandnumblikeduringmouseneurogenesis[J].Nature, 2002,419(6910):929-934.

    [21]CONBOYIM,RANDOTA.TheregulationofNotchsignalingcontrolssatellitecellactivationandcellfatedeterminationinpostnatalmyogenesis[J].DevCell, 2002,3(3):397-409.

    [22]LIUXH,YAOS,QIAORF, et al.NandrolonereducesactivationofNotchsignalingindenervatedmuscleassociatedwithincreasedNumbCX-pression[J].BiochemBiophysResCommun, 2011,414(1):165-169.

    [23]LEONGKG,KARSANA.RecentinsishtsintotheroleofNotchsignalingintumorigenesis[J].Blood, 2006,107(6):2223-2233.

    [24]NICOLASM,WOLFERA,RAJK, et al.Notchlfunctionsasatumorsuppressorinmouseskin[J].Natgenet, 2003,33(3):416-421.

    [25]ARTAVANIS-TSAKONASS,RANDMD,LAKERJ.Notchsignaling:cellfatecontrolandsignalintegrationindevelopment[J].Science, 1999,284(5415):770-776.

    [26]NOFZIGERD,MIYAMOTOA,LYONSKM, et al.NotchsignalingimposestwodistinctblocksinthedifferentiationofC2C12myoblasts[J].Development, 1999,126(8):1689-1702.

    [27]GIRALDEZAJ,CINALLIRM,GLASNERME, et al.MicroRNAsregulatebrainmorphogenesisinzebrafish[J].Science, 2005,308(5723):833-838.

    [28]胡振禧,黃洪貴,吳妹英,等. 溫度對斑鱖胚胎發(fā)育的影響[J]. 淡水漁業(yè), 2014,44(3):104-107.

    [29]陳昆慈,朱新平,杜合軍,等. 溫度和鹽度對寶石鱸胚胎發(fā)育的影響[J].中國水產(chǎn)科學, 2007,14(6):1032-1037.

    (編輯王健)

    DevelopmentandEffectofTemperatureonMiR-146aExpression

    ZHU Xin1,2#, YI Tan1,2#, CHEN Lin1,WUPing1,WANGJian-hua1,

    CHEN Tao2,ZHANGJian-she1, CHU Wu-ying1*

    (1.DepartmentofBiologicalandEnvironmentalEngineering,ChangshaUniversity,Changsha410003,China;

    2.CollegeofVeterinaryMedicine,HunanAgricultureUniversity,Changsha410128,China)

    AbstractTo investigate the expression pattern of miR-146a in embryonic developmental stage and the effect of temperature on the expression of miR-146a in Siniperca chuatsi, the embryos were incubated under different temperatures and the expression of miR-146a during embryonic developmental stage was detected by RT-qPCR. The results showed that the expressions of miR-146a were at a higher level and there is no significant difference before gastrula stage when the embryos incubated under 22 ℃ (P>0.05). And then the expressions of miR-146a decreased after tail-bud stage and decreased to the lowest level at larval stage (P<0.05). When the embryos incubated under 25 ℃, the expressions of miR-146a were at a higher level and there is no significant difference till neurula stage (P>0.05). Once at tail-bud stage, the expression of miR-146a significantly decreased (P<0.05) and to the lowest level at muscular effect stage. It was interesting that the expressions of miR-146a were significantly decreased at each developmental stage incubated under 25 ℃ when compared with 22 ℃ incubation (P<0.05). The results indicated that miR-146a mainly involved in regulating embryonic development during later embryonic developmental stages and promoted embryonic development by down regulation its expression. In addition, the expressions of miR-146a could decrease when the incubation temperature increased, and miR-146a might involve in the effect of temperature on embryonic development of Siniperca chuatsi.

    Key wordsSiniperca chuatsi; miR-146a; developmental expression; embryonic development; temperature regulation

    中圖分類號Q752; S917.4

    文獻標識碼A

    文章編號1000-2537(2015)05-0021-06

    通訊作者*,E-mail:chuwuying18@sina.com

    基金項目:#本文同等貢獻作者.

    收稿日期:2014-12-15

    DOI:10.7612/j.issn.1000-2537.2015.05.004

    猜你喜歡
    水溫胚胎時期
    母親肥胖竟然能導致胚胎缺陷
    文藝復興時期的發(fā)明家
    基于PLC的水溫控制系統(tǒng)設計
    電子制作(2019年7期)2019-04-25 13:18:10
    開心一刻
    母親肥胖竟然能導致胚胎缺陷
    基于DS18B20水溫控制系統(tǒng)設計
    電子制作(2018年17期)2018-09-28 01:56:38
    新時期的向善向上
    商周刊(2017年22期)2017-11-09 05:08:34
    “十三五”時期的國企改革
    DiI 在已固定人胚胎周圍神經(jīng)的示蹤研究
    大聯(lián)大:最先感知“水溫”變化
    2021天堂中文幕一二区在线观| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | or卡值多少钱| 久久欧美精品欧美久久欧美| 久久久久久九九精品二区国产 | 精品久久久久久久末码| 男人的好看免费观看在线视频 | 中文字幕av在线有码专区| 国产精品久久电影中文字幕| 欧美色视频一区免费| 男人的好看免费观看在线视频 | 男男h啪啪无遮挡| 99久久99久久久精品蜜桃| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 黑人操中国人逼视频| 亚洲成av人片在线播放无| 亚洲成av人片在线播放无| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 国产三级中文精品| 美女大奶头视频| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 日韩欧美国产一区二区入口| 欧美大码av| 久久这里只有精品19| 成年女人毛片免费观看观看9| www.精华液| 窝窝影院91人妻| 国产乱人伦免费视频| 国产爱豆传媒在线观看 | 高清毛片免费观看视频网站| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 精品一区二区三区四区五区乱码| 亚洲成人久久爱视频| 国产真实乱freesex| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲第一电影网av| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 久久精品91蜜桃| 在线a可以看的网站| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 亚洲成人久久性| 亚洲专区中文字幕在线| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 国产高清激情床上av| 国产成年人精品一区二区| 国产精品九九99| 我要搜黄色片| 在线观看午夜福利视频| 国产成人av教育| 校园春色视频在线观看| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 999久久久精品免费观看国产| 制服诱惑二区| 久久人人精品亚洲av| 亚洲精品一区av在线观看| 国产免费av片在线观看野外av| 十八禁网站免费在线| 波多野结衣高清作品| 国产一区二区激情短视频| 国产精品久久久久久精品电影| www.精华液| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 精品无人区乱码1区二区| 黄色片一级片一级黄色片| 成人国语在线视频| 99久久综合精品五月天人人| 黑人欧美特级aaaaaa片| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 婷婷亚洲欧美| 白带黄色成豆腐渣| 丁香六月欧美| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产99白浆流出| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产免费av片在线观看野外av| 久久精品影院6| 99国产精品一区二区蜜桃av| 黄片大片在线免费观看| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 99热这里只有精品一区 | 黄色视频不卡| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 免费在线观看完整版高清| 国产精品av久久久久免费| 一夜夜www| 国产真实乱freesex| www国产在线视频色| 正在播放国产对白刺激| 窝窝影院91人妻| 麻豆一二三区av精品| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲av片天天在线观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产精品爽爽va在线观看网站| 黄频高清免费视频| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| а√天堂www在线а√下载| 欧美日韩福利视频一区二区| 成人18禁在线播放| 日本三级黄在线观看| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产1区2区3区精品| 白带黄色成豆腐渣| 色老头精品视频在线观看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 国产精品亚洲一级av第二区| netflix在线观看网站| 国产精品国产高清国产av| 999久久久精品免费观看国产| 99国产精品一区二区三区| 久久人妻福利社区极品人妻图片| av视频在线观看入口| 亚洲人成电影免费在线| 观看免费一级毛片| 免费观看人在逋| 高清毛片免费观看视频网站| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲成人久久爱视频| 国产成年人精品一区二区| 精品人妻1区二区| 五月伊人婷婷丁香| 日本 av在线| 国产精品一及| 久久久久久久午夜电影| av视频在线观看入口| 99久久综合精品五月天人人| 黄色毛片三级朝国网站| 一级黄色大片毛片| 午夜影院日韩av| 亚洲中文av在线| 1024视频免费在线观看| 老司机午夜福利在线观看视频| 国产人伦9x9x在线观看| 9191精品国产免费久久| 午夜两性在线视频| 日韩欧美精品v在线| 欧美黑人欧美精品刺激| 一级片免费观看大全| 免费在线观看亚洲国产| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 全区人妻精品视频| 日本 av在线| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 高清毛片免费观看视频网站| 国产成人欧美在线观看| 一级毛片高清免费大全| 亚洲熟女毛片儿| 国产真人三级小视频在线观看| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 在线观看免费日韩欧美大片| 久久久久国产一级毛片高清牌| 黄色 视频免费看| 女同久久另类99精品国产91| 久热爱精品视频在线9| 在线a可以看的网站| 精品人妻1区二区| 欧美一区二区国产精品久久精品 | 亚洲精品中文字幕一二三四区| 91国产中文字幕| 亚洲avbb在线观看| 中文字幕高清在线视频| 久久婷婷成人综合色麻豆| 久久久久久久久久黄片| 中文字幕熟女人妻在线| 麻豆国产av国片精品| 精品久久久久久久久久久久久| 国产精品亚洲美女久久久| 日韩精品青青久久久久久| 国产成年人精品一区二区| 久久久久国内视频| 99热这里只有精品一区 | 久久性视频一级片| 精品午夜福利视频在线观看一区| 久久 成人 亚洲| 久久香蕉精品热| 久久亚洲精品不卡| 俄罗斯特黄特色一大片| 麻豆成人午夜福利视频| 九色国产91popny在线| 日韩精品中文字幕看吧| 精品久久久久久,| 香蕉丝袜av| 免费在线观看成人毛片| 天堂av国产一区二区熟女人妻 | 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 老鸭窝网址在线观看| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 99久久精品热视频| 日韩欧美免费精品| 麻豆成人午夜福利视频| 国产精品永久免费网站| 国产精品乱码一区二三区的特点| 亚洲专区中文字幕在线| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 色精品久久人妻99蜜桃| 亚洲avbb在线观看| 搞女人的毛片| 精品人妻1区二区| 精品久久久久久久毛片微露脸| 亚洲人与动物交配视频| 黑人欧美特级aaaaaa片| 女同久久另类99精品国产91| 国产av一区二区精品久久| 岛国在线免费视频观看| 午夜老司机福利片| 国产高清videossex| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 男女午夜视频在线观看| 久久香蕉国产精品| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 午夜久久久久精精品| www日本在线高清视频| 亚洲精品在线观看二区| 露出奶头的视频| 国产成人影院久久av| 国产熟女午夜一区二区三区| 看免费av毛片| ponron亚洲| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产成人aa在线观看| 国产激情偷乱视频一区二区| 免费在线观看影片大全网站| 久久香蕉国产精品| 女警被强在线播放| 9191精品国产免费久久| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 嫩草影院精品99| 久久久国产成人免费| 天堂av国产一区二区熟女人妻 | 18禁国产床啪视频网站| 日韩av在线大香蕉| 国产片内射在线| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 免费在线观看完整版高清| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 久久国产精品人妻蜜桃| 久久国产精品影院| 精品国产美女av久久久久小说| 一级片免费观看大全| 日本一本二区三区精品| 国产99白浆流出| 国产av不卡久久| 久久这里只有精品19| 欧美乱码精品一区二区三区| 亚洲精品在线观看二区| 亚洲av电影在线进入| 欧美丝袜亚洲另类 | 黄色片一级片一级黄色片| 亚洲人成网站高清观看| 国产一区二区三区视频了| 久久精品国产清高在天天线| 嫁个100分男人电影在线观看| 国产久久久一区二区三区| 国语自产精品视频在线第100页| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 免费看美女性在线毛片视频| 久久久国产成人精品二区| 757午夜福利合集在线观看| 国产av一区二区精品久久| 国产亚洲av嫩草精品影院| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲欧美日韩无卡精品| 日韩欧美免费精品| 欧美一级毛片孕妇| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 啦啦啦免费观看视频1| 母亲3免费完整高清在线观看| 日本在线视频免费播放| 日本黄色视频三级网站网址| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 九九热线精品视视频播放| 亚洲欧美激情综合另类| 一级毛片高清免费大全| 村上凉子中文字幕在线| 久久亚洲真实| 久久久久久久久免费视频了| 12—13女人毛片做爰片一| 午夜福利免费观看在线| 亚洲欧美精品综合久久99| 国产激情偷乱视频一区二区| 美女免费视频网站| a级毛片a级免费在线| 国内精品久久久久久久电影| 午夜激情av网站| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲黑人精品在线| 亚洲国产精品久久男人天堂| 人妻夜夜爽99麻豆av| 极品教师在线免费播放| 亚洲精品国产一区二区精华液| 婷婷亚洲欧美| 亚洲男人天堂网一区| 在线观看免费午夜福利视频| 午夜日韩欧美国产| www日本黄色视频网| 日韩高清综合在线| xxx96com| 麻豆久久精品国产亚洲av| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 亚洲成人久久爱视频| 一区二区三区国产精品乱码| 欧美黑人精品巨大| 日本一二三区视频观看| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 午夜福利18| 久久亚洲真实| 精品久久久久久久久久免费视频| 精品人妻1区二区| www.www免费av| 中文字幕高清在线视频| 精华霜和精华液先用哪个| 俺也久久电影网| 久久久久免费精品人妻一区二区| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 99国产精品一区二区三区| 两个人免费观看高清视频| 99久久国产精品久久久| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲精品色激情综合| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲熟女毛片儿| 天天添夜夜摸| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产一区二区在线观看日韩 | 日日干狠狠操夜夜爽| 亚洲人成网站高清观看| av天堂在线播放| 高清毛片免费观看视频网站| 日本熟妇午夜| 国产欧美日韩精品亚洲av| 老司机午夜福利在线观看视频| 一区二区三区高清视频在线| 人成视频在线观看免费观看| 91在线观看av| 99热只有精品国产| 成人亚洲精品av一区二区| 亚洲全国av大片| av视频在线观看入口| 国产高清videossex| 少妇粗大呻吟视频| 日本a在线网址| 黄色丝袜av网址大全| 9191精品国产免费久久| 婷婷精品国产亚洲av在线| 久久性视频一级片| 韩国av一区二区三区四区| 久久久国产欧美日韩av| 欧美一区二区国产精品久久精品 | 国产亚洲欧美98| 久久午夜综合久久蜜桃| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 久久中文字幕一级| 最近最新中文字幕大全电影3| 久久欧美精品欧美久久欧美| 狠狠狠狠99中文字幕| 欧美中文日本在线观看视频| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 成人av一区二区三区在线看| 在线免费观看的www视频| 最近在线观看免费完整版| 免费一级毛片在线播放高清视频| 国产一区二区三区视频了| 免费电影在线观看免费观看| 嫁个100分男人电影在线观看| 一级毛片高清免费大全| 日本免费一区二区三区高清不卡| av在线播放免费不卡| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 久久久久精品国产欧美久久久| 又黄又爽又免费观看的视频| 日韩欧美三级三区| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲成av人片在线播放无| 久久天堂一区二区三区四区| 美女 人体艺术 gogo| 国产精品免费视频内射| 90打野战视频偷拍视频| 国产成人欧美在线观看| 欧美最黄视频在线播放免费| 精品久久久久久久久久免费视频| 在线观看66精品国产| 免费看美女性在线毛片视频| 欧美国产日韩亚洲一区| 91字幕亚洲| av超薄肉色丝袜交足视频| 精品第一国产精品| 村上凉子中文字幕在线| 91av网站免费观看| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 亚洲国产高清在线一区二区三| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 亚洲国产欧美人成| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 午夜福利视频1000在线观看| 欧美性长视频在线观看| 国产精品av视频在线免费观看| 亚洲成av人片免费观看| 亚洲av成人一区二区三| 男人舔女人下体高潮全视频| 亚洲七黄色美女视频| 一夜夜www| 亚洲精品av麻豆狂野| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 桃红色精品国产亚洲av| 成人永久免费在线观看视频| 变态另类丝袜制服| 真人一进一出gif抽搐免费| 香蕉国产在线看| 欧美日韩国产亚洲二区| 一区福利在线观看| 成人av在线播放网站| 国产精品亚洲一级av第二区| 精品免费久久久久久久清纯| 精品高清国产在线一区| 午夜免费观看网址| 国产成人av教育| 日韩中文字幕欧美一区二区| 亚洲一码二码三码区别大吗| 亚洲国产欧美网| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 国产成人系列免费观看| x7x7x7水蜜桃| 久久精品91蜜桃| 99久久无色码亚洲精品果冻| 在线观看舔阴道视频| 久久久国产精品麻豆| 国产探花在线观看一区二区| 99热只有精品国产| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 三级国产精品欧美在线观看 | 色综合亚洲欧美另类图片| 久久中文字幕一级| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 国产av不卡久久| 国产精品 欧美亚洲| 久久伊人香网站| 国产成+人综合+亚洲专区| 色综合站精品国产| 亚洲 欧美一区二区三区| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产欧美日韩一区二区三| 人妻久久中文字幕网| 欧美av亚洲av综合av国产av| 黄色片一级片一级黄色片| 999久久久精品免费观看国产| 久久久久国内视频| 一级黄色大片毛片| 亚洲国产欧美一区二区综合| 超碰成人久久| 欧美性猛交黑人性爽| 一级毛片高清免费大全| 国产一区二区激情短视频| 日韩欧美国产在线观看| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产成人欧美在线观看| 久久久久久九九精品二区国产 | 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 欧美日韩国产亚洲二区| 亚洲中文av在线| 日本一本二区三区精品| 在线免费观看的www视频| 中文在线观看免费www的网站 | 久久久久性生活片| 午夜激情av网站| 国产精品亚洲美女久久久| 无遮挡黄片免费观看| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 曰老女人黄片| 欧美zozozo另类| 国产免费男女视频| 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲第一电影网av| 丰满的人妻完整版| 成人18禁在线播放| 亚洲激情在线av| 国产在线精品亚洲第一网站| 亚洲av美国av| 高潮久久久久久久久久久不卡| 男女床上黄色一级片免费看| 一本精品99久久精品77| 岛国视频午夜一区免费看| 制服人妻中文乱码| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 精品久久久久久久久久免费视频| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 国产精品免费一区二区三区在线| 色尼玛亚洲综合影院| 男女午夜视频在线观看| 午夜免费激情av| 亚洲国产高清在线一区二区三| 欧美zozozo另类| 日韩欧美国产在线观看| 国产av一区在线观看免费| 亚洲欧美日韩无卡精品| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲国产欧美一区二区综合| 亚洲熟女毛片儿| 1024手机看黄色片| 日韩免费av在线播放| 99热6这里只有精品| 亚洲自拍偷在线| 欧美极品一区二区三区四区| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 正在播放国产对白刺激| 免费在线观看完整版高清| 一级毛片女人18水好多| 老汉色av国产亚洲站长工具| 麻豆一二三区av精品| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲一区二区三区不卡视频| а√天堂www在线а√下载| 婷婷精品国产亚洲av| 俺也久久电影网| 悠悠久久av| tocl精华| 一进一出抽搐gif免费好疼| 一本一本综合久久| 国产午夜福利久久久久久| 两性夫妻黄色片| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 亚洲熟妇熟女久久| 国产探花在线观看一区二区| 亚洲av成人av| 中文字幕久久专区| 哪里可以看免费的av片| 免费观看精品视频网站| 欧美一区二区国产精品久久精品 | 成人av一区二区三区在线看| 久久久久性生活片| 国产成人系列免费观看| 欧美国产日韩亚洲一区| 男女床上黄色一级片免费看| 久久久久久久久免费视频了| 哪里可以看免费的av片| 久久 成人 亚洲| 国产精品爽爽va在线观看网站| 亚洲国产欧美网| 极品教师在线免费播放| 韩国av一区二区三区四区| 99精品久久久久人妻精品| 成人国产一区最新在线观看| 久久久国产成人免费| 黄色 视频免费看| 黄片大片在线免费观看| 国产精品一区二区精品视频观看| 狠狠狠狠99中文字幕| 成人永久免费在线观看视频| 露出奶头的视频| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 国产黄片美女视频| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 两人在一起打扑克的视频| 国产野战对白在线观看| 亚洲免费av在线视频| 欧美+亚洲+日韩+国产| 99精品久久久久人妻精品| 少妇粗大呻吟视频| 国产麻豆成人av免费视频| 亚洲 国产 在线| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 国产一区二区三区视频了| 久久久久九九精品影院| 小说图片视频综合网站| 最近最新免费中文字幕在线| 国产成+人综合+亚洲专区| 51午夜福利影视在线观看| 欧美高清成人免费视频www| 九九热线精品视视频播放| 可以在线观看毛片的网站| 亚洲一区中文字幕在线| 日韩欧美精品v在线| 国产麻豆成人av免费视频| 999久久久精品免费观看国产| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 免费观看人在逋| av免费在线观看网站| 国产亚洲av嫩草精品影院| 亚洲精品中文字幕在线视频| 久9热在线精品视频| 男人舔女人的私密视频| 成年免费大片在线观看| 2021天堂中文幕一二区在线观| 日本一二三区视频观看| 一二三四在线观看免费中文在| 男女视频在线观看网站免费 | 国产午夜福利久久久久久| av超薄肉色丝袜交足视频| 欧美不卡视频在线免费观看 | 一本精品99久久精品77| 男人舔女人下体高潮全视频| 免费在线观看成人毛片| 日本免费一区二区三区高清不卡| 久久午夜亚洲精品久久| 熟女电影av网| 啪啪无遮挡十八禁网站| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产精品爽爽va在线观看网站| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 日本五十路高清| 久久精品国产综合久久久| av国产免费在线观看| 黄色片一级片一级黄色片| 一进一出抽搐gif免费好疼|