重組畢赤酵母表達(dá)雜合抗菌肽HsSP-TtT1

摘" 要：構(gòu)建重組畢赤酵母pPICZαA-HsSP-TtT1/X33，表達(dá)雜合抗菌肽HsSP-TtT1。基于生物信息學(xué)分析和畢赤酵母密碼子偏好性，設(shè)計雜合抗菌肽HsSP-TtT1的核酸序列，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPICZαA-HsSP-TtT1，轉(zhuǎn)化畢赤酵母X33，利用博來霉素抗性YPD平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)甲醇誘導(dǎo)后，SDS-PAGE凝膠電泳驗證。成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pPICZαA-HsSP-TtT1，并成功篩選出1株能夠有效表達(dá)目標(biāo)蛋白的重組畢赤酵母X33/pPICZαA-HsSP-TtT1菌株。該研究可為雜合抗菌肽HsSP-TtT1的高效制備提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：雜合抗菌肽；畢赤酵母；重組表達(dá)；HsSP；TtT1

中圖分類號：Q816" " " 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A" " " "文章編號：2095-2945（2025）09-0060-05

Abstract： To construct a recombinant Pichia pastoris pPICZαA-HsSP TtT1/X33 and express the hybrid antibacterial peptide HsSP TtT1. Based on bioinformatics analysis and the codon preference of Pichia pastoris， the nucleic acid sequence of the hybrid antimicrobial peptide HsSP TtT1 was designed， the recombinant plasmid pPICZ α A-HsSP TtT1 was constructed， and Pichia pastoris X33 was transformed. The positive transformants were screened using the bleomycin resistant YPD plate. After methanol induction， they were verified by SDS-PAGE gel electrophoresis. The recombinant plasmid pPICZαA-HsSP-TtT1 were successfully constructed， and a recombinant strain of Pichia pastoris X33/pPICZαA-HsSP-TtT1 which could effectively express the target protein was successfully screened. This study provides a material basis for the efficient preparation of the hybrid antimicrobial peptide HsSP-TtT1.

Keywords： hybrid antibacterial peptide; pichia pastoris; recombinant expression; HsSP; TtT1

近年來，由于抗生素的濫用引發(fā)細(xì)菌耐藥性危機(jī)，導(dǎo)致人類健康面臨重大威脅，正在逐漸走向后抗生素時代。采用抗菌肽替代成為解決上述問題的一種可能方案[1]?？咕氖且活悘V泛存在于生物體內(nèi)（動物、植物、微生物和細(xì)菌等）的具有抗菌功能的小分子多肽[2]。與傳統(tǒng)抗生素相比，大部分抗菌肽作用于細(xì)菌的細(xì)胞膜作用靶點較為多樣，所以抗菌肽產(chǎn)生耐藥性的概率較低[3]。因此，抗菌肽被廣泛使用在食品或飼料的貯藏保鮮、農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量提升、新型藥物的研發(fā)等方面，并取得了巨大的進(jìn)展[4-5]。

HsSP是富含脯氨酸的人腸源抗菌肽，可在腸道菌群誘導(dǎo)下，經(jīng)TLR-Myd88通路由潘氏細(xì)胞和杯狀細(xì)胞表達(dá)分泌[6]。Hu等[7]研究發(fā)現(xiàn)HsSP在體外選擇性地殺死革蘭氏陽性菌，而難以殺傷革蘭氏陰性菌。TtT1是中國鱟源的一種陽離子抗菌肽，具有廣譜、強(qiáng)效的抗菌活性[8]。TtT1不僅可以抑殺革蘭氏陰性、陽性細(xì)菌和真菌，并且可與其他抗菌肽、抗生素發(fā)揮協(xié)同作用[9]。Cirioni等[10]研究發(fā)現(xiàn)TtT1與克拉霉素聯(lián)合使用對大腸桿菌的殺滅效果大于二者單獨使用。然而，TtT1的長期暴露會誘導(dǎo)銅綠假單胞菌產(chǎn)生耐藥性[11]。此外，鱟作為珍貴的海洋生物數(shù)量稀少，從鱟血細(xì)胞中直接提取不能滿足大量制備的需求，而利用化學(xué)方法固相合成產(chǎn)物純度可得到保障但價格極其昂貴無法滿足工業(yè)化應(yīng)用[12]。因此，本研究擬將二者雜合為一條新型抗菌肽，以彌補(bǔ)各自缺陷、提升性能。

應(yīng)用重組表達(dá)系統(tǒng)是實現(xiàn)雜合抗菌肽HsSP-TtT1大量生產(chǎn)的方法之一，其中最常見的是大腸桿菌重組表達(dá)系統(tǒng)和畢赤酵母重組表達(dá)系統(tǒng)。相較于大腸桿菌，畢赤酵母能夠執(zhí)行更多復(fù)雜的翻譯后修飾，并且具有高效的分泌表達(dá)系統(tǒng)，可將重組蛋白直接分泌至細(xì)胞外，從而簡化了蛋白的分離純化流程，減少了內(nèi)源性蛋白的污染，同時減輕了高表達(dá)蛋白對細(xì)胞的毒性影響[13]。因此，本研究擬選用畢赤酵母重組表達(dá)篩選能有效表達(dá)雜合抗菌肽HsSP-TtT1的菌株，以期為雜合抗菌肽HsSP-TtT1的高效制備提供參考。

1" 材料與方法

1.1" 試劑

5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液、Tris-Tricine-SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）；X33畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞（北京興華越洋生物科技有限公司）；PAGE預(yù)制膠Tris-Gly15%（上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司）；YNB培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基、考馬斯亮藍(lán)染色液、博來霉素、彩虹180廣譜蛋白Marker和蛋白上樣緩沖液（北京索萊寶科技有限公司）；BM基礎(chǔ)培養(yǎng)基（上海瑞楚生物科技有限公司）；技術(shù)瓊脂粉、LB肉湯（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；二甲基亞砜、甲醇（西隴科學(xué)股份有限公司）；瓊脂糖（上海貝晶生物技術(shù)有限公司）；高純質(zhì)粒小量快速提取試劑盒（北京艾德萊生物科技有限公司）；限制性快切酶Sac Ⅰ（寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司），其他常規(guī)化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2" 儀器

垂直電泳儀（北京六一生物科技有限公司）、渦旋振蕩器（艾卡（廣州）儀器設(shè)備有限公司）、恒溫震蕩搖床（上海蘇坤實業(yè)有限公司）、生化培養(yǎng)箱（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）、超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）和凝膠成像分析儀（伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司）。

1.3" 實驗方法

1.3.1" 重組質(zhì)粒pPICZαA-HsSP-TtT1的構(gòu)建

訪問NCBI數(shù)據(jù)庫獲得HsSP和TtT1的核酸序列，用特定的柔性linker（GSGGSG）相連，根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性優(yōu)化，構(gòu)建雜合抗菌肽HsSP-TtT1，并利用ProtParam工具，分析HsSP-TtT1的理化參數(shù)，利用ProtScale工具以“Hphob./Kyteamp;Doolittle”為標(biāo)度對雜合抗菌肽HsSP-TtT1的氨基酸序列進(jìn)行親疏水性分析。

交由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行全基因合成，經(jīng)EcoR Ⅰ和Not Ⅰ雙酶切后與pPICZαA連接，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，用含有博來霉素的LB固體平板進(jìn)行陽性克隆子篩選，構(gòu)建方案如圖1所示。

1.3.2" 畢赤酵母的化學(xué)轉(zhuǎn)化與陽性篩選

使用Sac I對重組質(zhì)粒酶切線性化，依次加入預(yù)冷的線性質(zhì)粒，Carrier DNA，感受態(tài)細(xì)胞X33，畢赤酵母轉(zhuǎn)化液，翻混合轉(zhuǎn)6～8次；30 ℃水浴30 min，每10 min翻轉(zhuǎn)一次；加入DMSO，42 ℃水浴15 min，每5 min翻轉(zhuǎn)一次；12 000 r/min瞬時離心棄上清，加入YPD于30 ℃復(fù)蘇1h；12 000 r/min瞬時離心棄上清，用0.9% NaCl重懸，涂布至含博來霉素的YPD固體平板，30 ℃培養(yǎng)48～96 h單菌落長出后，挑取陽性轉(zhuǎn)化子用YPD液體培養(yǎng)基培養(yǎng)活化。

1.3.3" 雜合抗菌肽HsSP-TtT1的誘導(dǎo)表達(dá)篩選

上述活化菌株轉(zhuǎn)接到BMGY液體培養(yǎng)基，30 ℃，250 r/min，培養(yǎng)48 h；離心棄上清，加入BMMY液體培養(yǎng)基混勻，誘導(dǎo)表達(dá)4 d，每24 h補(bǔ)加甲醇至終濃度1%；誘導(dǎo)結(jié)束后離心收集上清，用Tricine-SDS-PAGE電泳觀察并分析結(jié)果。用含pPICZαA空載體的酵母轉(zhuǎn)化子同上處理作為陰性對照。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 雜合抗菌肽HsSP-TtT1的設(shè)計與優(yōu)化

融合蛋白設(shè)計中，linker的選擇對于保持或優(yōu)化融合蛋白的結(jié)構(gòu)與功能至關(guān)重要。張澤瑾等[14]利用柔性linker（GGGS）成功構(gòu)建出具有高抗銅綠假單胞菌和中和內(nèi)毒素雙重功效的雜合抗菌肽LLM。鄭佳等[15]使用柔性linker（GSGGSG）設(shè)計EgG1Y162-2（4）重組蛋白疫苗，更好地保留原始蛋白的表位，確保相鄰蛋白質(zhì)正常表達(dá)，防止其免疫原性降低。因此本文選擇用柔性linker（GSGGSG），將人腸源抗菌肽HsSP和鱟抗菌肽TtT1連接，命名為HsSP-TtT1，其核酸序列與對應(yīng)的氨基酸序列如圖2所示。

2.2" 雜合抗菌肽HsSP-TtT1的生物信息學(xué)分析

雜合抗菌肽HsSP-TtT1的理化性質(zhì)分析見表1，結(jié)果表明其在酵母體內(nèi)的半衰期大于20 h，適用于在畢赤酵母中表達(dá)。氨基酸親疏水性預(yù)測分析如圖3所示，最大親疏水性值（1.071）位于第87位，最小親疏水性值（-2.700）位于第7位，整體呈現(xiàn)較好的親水性。研究表明，通過增加原肽的正電荷數(shù)或者疏水性等結(jié)構(gòu)優(yōu)化的方式，可以增加穩(wěn)定性和提高抗菌活性[16]。Zhou等[17]利用疏水殘基和帶正電荷的氨基酸替換原肽的氨基酸，使新肽在正電荷的數(shù)量和疏水性值上都有所增加，優(yōu)化后的肽對大腸桿菌表現(xiàn)出明顯抑菌作用的同時，抗菌譜也更廣。本文設(shè)計的HsSP-TtT1通過雜合也增加了序列的正電荷，或能更有效地通過靜電作用與細(xì)菌膜結(jié)合，從而加劇破壞膜的完整性，增強(qiáng)殺傷作用。

2.3" 雜合抗菌肽HsSP-TtT1的畢赤酵母密碼子偏好性優(yōu)化

基于畢赤酵母密碼子偏好性對雜合抗菌肽HsSP-TtT1的核酸序列進(jìn)行優(yōu)化，如圖4所示。李富強(qiáng)等[18]和顧莉莉等[19]根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性分別對目的基因進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計，使重組蛋白的表達(dá)量和活力得到較大提升。

2.4" 雜合抗菌肽HsSP-TtT1的誘導(dǎo)表達(dá)篩選

采用含有博來霉素的LB固體平板篩選陽性克隆子，并挑選8個疑似陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后用Tricine-SDS-PAGE鑒定，如圖5所示。結(jié)果表明，7號陽性轉(zhuǎn)化子在11 kDa處有較為明顯的條帶，且與目標(biāo)蛋白預(yù)計大小相符合，而陰性對照的泳道則無此條帶，預(yù)示該株重組酵母可誘導(dǎo)表達(dá)出雜合抗菌肽HsSP-TtT1。

3" 結(jié)論

抗菌肽是一類廣泛存在于自然界、具有多種生物活性的多肽類物質(zhì)，但天然抗菌肽還存在活性低、穩(wěn)定性差，無法達(dá)到量產(chǎn)等問題，因此對其進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計是目前的一個研究熱點[20]。本研究基于HsSP和TtT1理化性質(zhì)的生物信息學(xué)分析，引入一種含二硫鍵的柔性linker加以連接；考慮到畢赤酵母作為表達(dá)宿主的特性，進(jìn)行密碼子偏好性優(yōu)化后，形成雜合抗菌肽HsSP-TtT1的設(shè)計；并通過重組質(zhì)粒構(gòu)建、重組轉(zhuǎn)化和誘導(dǎo)表達(dá)，成功篩選到1株能表達(dá)目標(biāo)蛋白的重組畢赤酵母X33/pPICZαA-HsSP-TtT1，為雜合抗菌肽HsSP-TtT1的高效制備提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] JANGIR P， OGUNLANA L， MACLEAN R. Evolutionary constraints on the acquisition of antimicrobial peptide resistance in bacterial pathogens[J].Trends Microbiol，2021，29（12）：1058-1061.

[2] 謝雄杰，陳曦，劉宇，等.抗菌肽cp1對蠟樣芽孢桿菌的抑菌作用及在巴氏殺菌乳中的應(yīng)用[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2023，14（21）：89-96.

[3] MORETTA A， SCIEUZO C， PETRONE A， et al. Antimicrobial peptides： A new hope in biomedical and pharmaceutical fields[J].Front Cell Infect Microbiol，2021，11：668632.

[4] 孟宇鵬，劉紅，項閆顏，等.抗菌肽的作用機(jī)制、緩釋研究及改良策略[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)報，2023，20（6）：37-41.

[5] 張婕，王法才.飼料中添加抗菌肽對肉牛免疫機(jī)能的影響[J].養(yǎng)殖與飼料，2024，23（1）：34-36.

[6] KONG X， WANG D， SUN W， et al. Small proline-rich protein 2A and 2D are regulated by the RBM38-p73 axis and associated with p73-dependent suppression of chronic inflammation[J]. Cancers （Basel），2021，13（11）：2829.

[7] HU Z， ZHANG C， SIFUENTES-DOMINGUEZ L， et al. Small proline-rich protein 2A is a gut bactericidal protein deployed during helminth infection[J].Science，2021，374（6568）：6723.

[8] YU R， WANG J， SO LY， et al. Enhanced activity against multidrug-resistant bacteria through coapplication of an analogue of tachyplesin i and an inhibitor of the QseC/B signaling pathway[J]. Journal of medicinal chemistry，2020，63（7）：3475-3484.

[9] 李寒梅，唐勇軍，王順啟，等.抗菌肽鱟素的研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)研究，2018，22（4）：338-344.

[10] CIRIONI O， GHISELLI R， SILVESTRI C， et al. Efficacy of tachyplesin III， colistin， and imipenem against a multiresistant Pseudomonas aeruginosa strain[J]. Antimicrob Agents Chemother，2007，51（6）：2005-2010.

[11] HONG J， LI X， JIANG M， et al. Co-expression mechanism analysis of different Tachyplesin I-resistant strains in pseudomonas aeruginosa based on transcriptome sequencing[J]. Front Microbiol，2022（13）：871290.

[12] 王若誠，辛瑜，張梁.鱟素TachyplesinⅠ在大腸桿菌中的重組表達(dá)及其抑菌活性[J].食品工業(yè)科技，2020，41（19）：94-98.

[13] DALY R， HEARN M. Expression of heterologous proteins in Pichia pastoris： a useful experimental tool in protein engineering and production[J]. Journal of Molecular Recognition， 2005，18（2）：119-138.

[14] 張澤瑾，姚宏紀(jì)，薛兆毅，等.新型抗銅綠假單胞菌雙功能雜合抗菌肽LLM的設(shè)計及特性研究[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2022，28（21）：1627-1633.

[15] 鄭佳，張東軍，趙商岐，等.基于接頭序列“GSGGSG“的細(xì)粒棘球蚴病重組多表位疫苗EgG1Y162-2（4）的制備及鑒定[J].中國血吸蟲病防治雜志，2022，34（4）：378-382.

[16] LIU Y， SHEN T， CHEN L， et al. Analogs of the cathelicidin-derived antimicrobial peptide PMAP-23 exhibit improved stability and antibacterial activity[J]. Probiotics Antimicrob Proteins，2021，13（1）：273-286.

[17] ZHOU J， LIU Y， SHEN T， et al. Antimicrobial activity of the antibacterial peptide PMAP-36 and its analogues[J]. Microb Pathog，2019，136：103712.

[18] 李富強(qiáng)，王利麗，田向?qū)W，等.重組豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)及免疫原性研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2020（10）：66-69.

[19] 顧莉莉，周楠迪，田亞平.球毛殼菌α-葡聚糖酶的異源表達(dá)、純化及特性表征[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2021，40（11）：30-38.

[20] LV X， ZHANG Y， WANG L， et al. Expression and antimicrobial activity of the recombinant bovine lactoferricin in Pichia pastoris[J]. Synth Syst Biotechnol. 2023，9（1）：26-32.