非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型肝組織T淋巴細(xì)胞的特征分析

摘要：目的 采用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)揭示非酒精性脂肪肝炎（NASH）小鼠肝組織T淋巴細(xì)胞單細(xì)胞水平的異質(zhì)性和轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征，為研究T淋巴細(xì)胞在NASH中的作用機(jī)制提供新的依據(jù)。方法 6只C57BL/6雄性小鼠隨機(jī)分為普通飼料喂養(yǎng)的對(duì)照組和膽堿蛋氨酸缺乏飼料喂養(yǎng)的NASH組，每組各3只。造模6周后取小鼠肝組織進(jìn)行單細(xì)胞RNA測(cè)序。分析T淋巴細(xì)胞單細(xì)胞亞群的特異性差異表達(dá)基因，分別行降維聚類、細(xì)胞類型注釋、t分布隨機(jī)鄰域嵌入（t-SNE）、小提琴圖、基因本體（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）通路富集分析。利用免疫熒光染色觀察兩組小鼠肝臟中Tcrα（T淋巴細(xì)胞分子標(biāo)志）、Tcf7、Cxcr6（特征標(biāo)志基因）的表達(dá)情況。計(jì)量資料兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)。結(jié)果 小鼠肝臟中共鑒定出2個(gè)T淋巴細(xì)胞亞群：（1）第6簇T淋巴細(xì)胞占比從對(duì)照組的58.5%降低到NASH組的48.7%。前4位特異性基因包括Nsg2、Cd8b1、Cd8a和Tcf7。該簇65%的細(xì)胞表達(dá)Tcf7（第6簇特征標(biāo)志基因），定義為T(mén)cf7 + T淋巴細(xì)胞亞群。GO和KEGG富集分析顯示，它們參與調(diào)控T淋巴細(xì)胞活化、白細(xì)胞黏附、結(jié)合泛素樣蛋白連接酶，以及輔助性T淋巴細(xì)胞（Th）17、Th1、Th2細(xì)胞分化等信號(hào)通路。（2）第7簇T淋巴細(xì)胞占比從對(duì)照組的41.5%增高到NASH組的51.3%。前4位特異性基因包括Cd40lg、Tcrg-C1、Il2rα和Cxcr6。該簇90%的細(xì)胞表達(dá)Cxcr6，定義為Cxcr6 + T淋巴細(xì)胞亞群。GO和KEGG富集分析提示，該亞群參與調(diào)控T淋巴細(xì)胞活化、細(xì)胞因子產(chǎn)生，以及T淋巴細(xì)胞受體信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化與MAPK信號(hào)通路。

免疫熒光結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，NASH組小鼠肝臟中Tcf7蛋白和Tcrα蛋白共染陽(yáng)性區(qū)域減少（1.80%±0.67% vs 0.33%±0.13%，Plt;0.05），而Cxcr6蛋白和Tcrα蛋白共染陽(yáng)性區(qū)域增加（0.50%±0.09% vs 2.66%±0.33%，Plt;0.001）。結(jié)論 NASH小鼠肝臟中 Tcf7 + T淋巴細(xì)胞的占比降低，而 Cxcr6 + T淋巴細(xì)胞的占比增高，揭示了 NASH小鼠肝組織 T淋巴細(xì)胞的特征和差異。

關(guān)鍵詞：非酒精性脂肪性肝炎；T淋巴細(xì)胞；單細(xì)胞測(cè)序；小鼠，近交C57BL

基金項(xiàng)目：上海市浦東新區(qū)衛(wèi)生健康委員會(huì)醫(yī)學(xué)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（PWYgf2021-02）

Characteristics of T cells in the liver tissues of mice with nonalcoholic steatohepatitis

MAO Ting 1 ，XU Mingyi 1 ，WANG Jiayi 2

1. Department of Gastroenterology，Shanghai East Hospital，Tongji University，Shanghai 200120，China；2. Department of Gastroenterology，Shanghai General Hospital，Shanghai Jiao Tong University，Shanghai 200080，China

Corresponding author：WANG Jiayi，18017028830@163.com （ORCID：0009-0004-8097-5288）

Abstract：Objective To investigate the heterogeneity and transcriptomic characteristics of T-cell subsets in the liver of mice with nonalcoholic steatohepatitis （NASH） at the single-cell level using single-cell RNA sequencing （scRNA-seq），and to provide a reference for studying the mechanism of action of T cells in NASH. Methods Six male C57BL/6 mice were randomly divided into control group fed with regular diet and NASH group fed with methionine-choline-deficient （MCD） diet，with three mice in each group，and liver tissue was collected for scRNA-seq after 6 weeks of modeling. Specific differentially expressed genes were analyzed between T-cell subsets，and related analyses were performed，including dimension clustering，cell type annotation，t-distributed stochastic neighbor embedding （t-SNE），violin plot，gene ontology （GO） functional enrichment analysis，and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes （KEGG） pathway enrichment analysis. Immunofluorescent staining was used to observe the expression of the T cell marker Tcrα and the specific marker genes Tcf7 and Cxcr6 in the liver of mice in the two groups. The independent-samples t test was used for comparison of continuous data between two groups. Results Two T cell subsets were identified in the liver of mice，and the percentage of cluster 6 decreased from 58.5% in the control group to 48.7% in the NASH group. The top four specific genes were Nsg2，Cd8b1，Cd8a，and Tcf7. Tcf7，a characteristic marker gene for cluster 6，was expressed in 65% of cells in cluster 6，and therefore，cluster 6 was defined as Tcf7 + T cells. The GO and KEGG enrichment analyses showed that the differentially expressed genes of cluster 6 were involved in T cell activation，leukocyte adhesion，binding ubiquitin-like protein ligase，and the signaling pathways for Th17，Th1，and Th2 cell differentiation. The percentage of cluster 7 increased from 41.5% in the control group to 51.3% in the NASH group. The top four specific genes of cluster 7 were Cd40lg，Tcrg-C1，Il2rα，and Cxcr6. Cxcr6 was expressed in 90% of cells in cluster 7，and therefore，cluster 7 was defined as Cxcr6 + T cells. The GO and KEGG enrichment analyses showed that cluster 7 was involved in T cell activation，cytokine production，the T cell receptor signaling pathway，and the Th17 cell differentiation and MAPK signaling pathway. Immunofluorescence assay showed that compared with the control group，the NASH group showed a significant reduction in the area with positive co-expression of Tcf7 protein and Tcrα protein （1.80%±0.67% vs 0.33%±0.13%，Plt;0.05） and a significant increase in the area with positive co-expression of Cxcr6 protein and Tcrα protein （0.50%±0.09% vs 2.66%±0.33%，Plt;0.001）. Conclusion There is a reduction in the percentage of Tcf7 + T cells and an increase in the percentage of Cxcr6 +T cells in NASH mice，revealing the characteristics and differences of T cells in the liver of NASH mice.

Key words：Non-Alcoholic Steatohepatitis；T-Lymphocytes；Single-cell RNA Sequencing；Mice，Inbred C57BL

Research funding：Medical Discipline Construction Project of Pudong Health Committee of Shanghai （PWYgf2021-02）

非酒精性脂肪性肝炎（NASH）是非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）進(jìn)一步進(jìn)展為肝硬化和肝細(xì)胞癌的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。隨著肥胖和代謝綜合征的流行，NASH和NAFLD已成為全球慢性肝病的最主要病因，嚴(yán)重危害人民生命健康［1］。單細(xì)胞 RNA 測(cè)序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）是一種在單細(xì)胞水平上對(duì)轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序的新技術(shù)［2］。相比于傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，單細(xì)胞RNA測(cè)序?qū)α私飧闻K非實(shí)質(zhì)細(xì)胞，如炎癥細(xì)胞尤為有效［3］。Su等 ［4］通過(guò) scRNA-seq分析發(fā)現(xiàn)了健康和 NAFLD 小鼠肝臟中非實(shí)質(zhì)細(xì)胞的基因表達(dá)譜改變。T淋巴細(xì)胞是細(xì)胞免疫反應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞。近年來(lái)，人們逐漸認(rèn)識(shí)到T淋巴細(xì)胞在 NAFLD 發(fā)病過(guò)程中的重要作用。Koda 等［5］發(fā)現(xiàn)，CD69 + CD103 ? CD8 + T 淋巴細(xì)胞在高脂高膽固醇誘導(dǎo)的NASH小鼠肝臟中顯著富集。有研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD患者的外周血中炎癥因子IL-10、IL-17、IL-23及TGF-β1的水平和輔助性T淋巴細(xì)胞（Th）17的水平呈正相關(guān)［6］，且Th17細(xì)胞和IL-17的水平與NASH患者的病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［7］。但在單細(xì)胞水平上研究T淋巴細(xì)胞在NASH中的特征改變?nèi)允怯斜匾?。因此，本研究采用scRNA-seq技術(shù)對(duì)健康小鼠和NASH小鼠的肝組織內(nèi)T淋巴細(xì)胞進(jìn)行分群，旨在揭示NASH小鼠肝組織中不同T淋巴細(xì)胞亞群的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取8周齡C57BL/6雄性小鼠6只，隨機(jī)分為對(duì)照組和NASH組，每組各3只。對(duì)照組喂養(yǎng)普通飼料，NASH 組喂養(yǎng)膽堿蛋氨酸缺乏（methionine-choline-deficient，MCD）飼料，造模6周后處死小鼠，取肝組織進(jìn)行scRNA-seq以獲得基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)（上海鯨舟基因科技有限公司）［8］。

1.2 研究方法

1.2.1 scRNA-seq 使用 Seurat 3.0 軟件包讀取 scRNA-seq數(shù)據(jù)，并為每個(gè)數(shù)據(jù)創(chuàng)建一個(gè)Seurat對(duì)象。排除獨(dú)特分子標(biāo)志lt;200或gt;10 000的細(xì)胞及線粒體基因含量高于25%的細(xì)胞，并根據(jù)獨(dú)特分子標(biāo)志細(xì)胞總計(jì)數(shù)進(jìn)行對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化后，對(duì)前2 000個(gè)高可變基因使用主成分分析的降維算法進(jìn)行降維，隨后基于主成分分析降維結(jié)果以0.6的分辨率進(jìn)行聚類。

1.2.2 細(xì)胞注釋和分簇 使用Seurat 3.0中的FindAllMarkers函數(shù)篩選出所有細(xì)胞類群中的標(biāo)志基因，并使用 R 包Single R 1.4.1內(nèi)置的小鼠RNA測(cè)序數(shù)據(jù)庫(kù)作為參考數(shù)據(jù)集對(duì)細(xì)胞亞群進(jìn)行細(xì)胞類型注釋。通過(guò)白細(xì)胞分化抗原3α（the cluster of the differentiation 3α，Cd3α）、白細(xì)胞分化抗原8α（Cd8α）、白細(xì)胞分化抗原4（Cd4）和T淋巴細(xì)胞受體α（T cell receptor alpha，Tcrα）來(lái)鑒定T淋巴細(xì)胞。

1.2.3 特異性差異表達(dá)基因（以下簡(jiǎn)稱“特異性基因”）分析 使用 Seurat3.0 中的 FindMarkers 函數(shù)用于篩選scRNA-seq數(shù)據(jù)中的差異表達(dá)基因，設(shè)置log 2 （FC）gt;0.25為閾值，并對(duì)基因的顯著性P值進(jìn)行檢驗(yàn)矯正。隨后使用 t 分布隨機(jī)鄰域嵌入（t-distributed stochastic neighbor embedding，t-SNE）對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化，再通過(guò)小提琴圖來(lái)可視化每個(gè)聚類中表達(dá)的特異性基因。

1.2.4 功能富集分析 采用Cluster Profiler R軟件包對(duì)特異性基因集進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。GO數(shù)據(jù)庫(kù)是從生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分、分子功能3個(gè)方面對(duì)基因和基因產(chǎn)物進(jìn)行分類注釋。

1.2.5 免疫熒光染色 分別將對(duì)照組小鼠和 NASH 組小鼠肝臟切片進(jìn)行烤片、脫蠟、水化、抗原修復(fù)和血清封閉后，加入以下一抗：Tcrα（Abcam公司，貨號(hào)：ab288432）、Tcf7（Abcam公司，貨號(hào)：ab315392）和Cxcr6（Boster公司，貨號(hào)：BA3082），并置于 4 ℃冰箱中孵育過(guò)夜。次日滴加Alexa 488（Yeasen公司，貨號(hào)：34106ES60）、Alexa 594（Yeasen 公司，貨號(hào)：33112ES60）標(biāo)記的熒光二抗和DAPI染液后封片。抗體稀釋倍數(shù)均為1∶200。使用熒光顯微鏡拍照觀察，并用Image J1.8.0軟件進(jìn)行熒光面積占比測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 19.0、Graphpad prism 10和Image J軟件對(duì)熒光免疫結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和可視化處理。計(jì)量資料采用 x ˉ ±s表示，兩組間比較采用成組 t檢驗(yàn)。特異性基因分析中的P值用Seurat 3.0軟件包中的Wilcoxon秩和檢驗(yàn)和Bonferroni校正來(lái)檢驗(yàn)，富集分析通過(guò) ClusterProfiler 函數(shù)實(shí)現(xiàn)，并使用 Fisher 精確檢驗(yàn)和FDR矯正。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NASH小鼠肝組織T淋巴細(xì)胞亞群的分群和各亞群的變化 從 NASH組小鼠和對(duì)照組小鼠的肝臟中分離出單細(xì)胞，得到來(lái)自對(duì)照組的4 336個(gè)細(xì)胞和來(lái)自NASH組的3 893個(gè)細(xì)胞［8］。通過(guò)分析所有細(xì)胞中表達(dá)不同的基因，共鑒定出21個(gè)細(xì)胞簇。其中，第6、7簇被鑒定為T(mén)淋巴細(xì)胞（圖1a）。比較兩組T淋巴細(xì)胞亞群的占比情況發(fā)現(xiàn)，第6簇T淋巴細(xì)胞的比例從對(duì)照組的58.5%降低到NASH組的48.7%，而第7簇T淋巴細(xì)胞則從對(duì)照組的41.5%增高到NASH組的51.3%（圖1b）。熱圖顯示了第6、7簇T淋巴細(xì)胞前10位特異性基因（圖1c）。

2.2 第6簇T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征 為進(jìn)一步研究第6簇T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征，通過(guò)t-SNE分析顯示，第6簇T淋巴細(xì)胞的前10位特異性基因，包括神經(jīng)元特異性基因2（neuron-specific gene 2，Nsg2）、白細(xì)胞分化抗原8b1（the cluster of the differentiation 8 subunit beta 1，Cd8b1）、Cd8a、轉(zhuǎn)錄因子 7（transcription factor 7，Tcf7）（圖2a）和其他6個(gè)特異性基因（表1）。通過(guò)小提琴圖顯示第6簇前4位特異性基因（圖2b）。表1顯示，65%的第6簇T淋巴細(xì)胞表達(dá)Tcf7（pct_FC排名第4，但pct_FC前三的基因在第 6 簇 T 淋巴細(xì)胞中的表達(dá)率均低于50%）。因此Tcf7作為第6簇T淋巴細(xì)胞的特征標(biāo)志基因，定義為T(mén)cf7 + T淋巴細(xì)胞亞群。KEGG途徑富集分析顯示，第6簇T淋巴細(xì)胞參與T淋巴細(xì)胞受體、Th17細(xì)胞分化和Th1、Th2細(xì)胞分化等多個(gè)炎癥相關(guān)信號(hào)通路的調(diào)控（圖2c）。GO富集分析結(jié)果顯示，第6簇T淋巴細(xì)胞特異表達(dá)基因主要參與活化T淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞細(xì)胞間黏附、磷酸化的負(fù)調(diào)控的生物學(xué)過(guò)程，核糖體、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架、細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞組分，以及結(jié)合mRNA、結(jié)合泛素樣蛋白連接酶、結(jié)合鳥(niǎo)苷酸的分子功能（圖2d）。

2.3 第7簇T淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征 t-SNE分析發(fā)現(xiàn)，第7簇T淋巴細(xì)胞特異性表達(dá)白細(xì)胞分化抗原40配體基因（Cd40lg）、γ鏈T細(xì)胞受體抗原1（T-cell receptors gamma-chain 1，Tcrg-C1）、白細(xì)胞介素2受體α（interleukin-2receptor α，Il2rα）、CXC 趨化因子受體 6（C-X-C motif chemokine receptor 6，Cxcr6）（圖3a）和其他6個(gè)基因（表2）。通過(guò)小提琴圖顯示出第7簇前4位特異性基因（圖3b）。表 2 顯示，在第 7 簇中，90% 的 T 淋巴細(xì)胞表達(dá) Cxcr6（pct_FC排名第4，且pct_FC排名前3位的基因在第7簇T淋巴細(xì)胞中表達(dá)率均低于50%）。因此Cxcr6是第7簇T淋巴細(xì)胞的特征標(biāo)志基因，定義為Cxcr6 + T淋巴細(xì)胞亞群。KEGG途徑富集分析顯示，第7簇顯著富集的通路包括T淋巴細(xì)胞受體信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化和MAPK信號(hào)通路（圖3c）。GO富集分析顯示，第7簇的特異性基因主要參與T淋巴細(xì)胞活化、免疫效應(yīng)過(guò)程的調(diào)控、細(xì)胞因子產(chǎn)生的生物學(xué)過(guò)程，細(xì)胞質(zhì)、核糖體、神經(jīng)元間突觸的細(xì)胞組分，以及結(jié)合嘌呤核糖核苷、結(jié)合GTP、泛素樣蛋白連接酶的分子功能（圖3d）。

2.4 免疫熒光驗(yàn)證NASH小鼠肝組織中兩種T淋巴細(xì)胞的變化 免疫熒光染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，NASH組小鼠肝組織Tcf7蛋白和Tcrα蛋白共染陽(yáng)性區(qū)域顯著減少（1.80%±0.67% vs 0.33%±0.13%，Plt;0.05）（圖4a、b）；而Cxcr6蛋白和Tcrα蛋白共染陽(yáng)性區(qū)域顯著增加（0.50%±0.09% vs 2.66%±0.33%，Plt;0.001）（圖 4c、d）。以上免疫熒光結(jié)果均與單細(xì)胞測(cè)序的分析趨勢(shì)一致。

3 討論

NASH是NAFLD病情進(jìn)展的關(guān)鍵階段，以5%以上的肝細(xì)胞脂肪變、小葉內(nèi)炎癥、肝細(xì)胞氣球樣變?yōu)樘卣鳎?］，是一種影響了全球約1/4人口的慢性肝臟疾病，可發(fā)展為肝硬化和肝癌［10-11］，是當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一。但NASH發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚［12］。

T淋巴細(xì)胞作為適應(yīng)型免疫的重要組成成分，占肝臟內(nèi)淋巴細(xì)胞的50%以上。根據(jù)識(shí)別抗原提呈細(xì)胞上不同類型的主要組織相容性復(fù)合物，T淋巴細(xì)胞可以被劃分為CD4 + T淋巴細(xì)胞和CD8 + T淋巴細(xì)胞［13］。Wolf等 ［14］發(fā)現(xiàn)，在MCD飲食喂養(yǎng)的小鼠肝臟中，CD8 + T淋巴細(xì)胞數(shù)量增高且活性增強(qiáng)，并引發(fā)由該種飲食所誘導(dǎo)的肝損傷，但不會(huì)影響肝內(nèi)脂質(zhì)代謝。Her等［15］發(fā)現(xiàn)CD4 + T淋巴細(xì)胞可能通過(guò)釋放促炎因子IL-17A和干擾素γ促進(jìn)NAFLD有關(guān)的炎癥和脂肪變性向纖維化轉(zhuǎn)變過(guò)程。

相比于傳統(tǒng)細(xì)胞測(cè)序方法，單細(xì)胞測(cè)序不僅使獲得的遺傳信息更加精確，還能檢測(cè)微量的基因表達(dá)水平［16］。近年來(lái)，單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用促進(jìn)了人們對(duì)慢性肝臟疾病中 T淋巴細(xì)胞亞群復(fù)雜異質(zhì)性的了解。Li等［17］發(fā)現(xiàn)，與健康人群的肝臟相比，NAFLD患者肝臟內(nèi)的CD4 + T淋巴細(xì)胞數(shù)目增多，并發(fā)現(xiàn)了CD4 + T淋巴細(xì)胞內(nèi)4個(gè)差異表達(dá)基因（MIGI3、RCAN3、DOCK10和SAMD12）與NAFLD有關(guān)。Huang等［18］發(fā)現(xiàn)，在NAFLD斑馬魚(yú)肝臟內(nèi)，CD8 + T淋巴細(xì)胞可分為6個(gè)亞群（CD8-gzmk、CD8-rorc、CD8-ccl38.6、CD8-lta、CD8-mki67和CD8-mcm4），而CD4 + T淋巴細(xì)胞可分為4個(gè)亞群（CD4-foxp3a、CD4-cd28、CD4-cebpb和CD4-mki67）。

本研究通過(guò)對(duì)健康小鼠和MCD誘導(dǎo)的NASH小鼠的肝臟進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，重點(diǎn)研究篩選出的2個(gè)T淋巴細(xì)胞亞群：（1）第6簇T淋巴細(xì)胞在NASH小鼠肝臟中的占比從對(duì)照組的58.5%降低到NASH組的48.7%。65%的該簇T淋巴細(xì)胞表達(dá)Tcf7，因而作為該簇的標(biāo)志基因。功能富集分析發(fā)現(xiàn)，該T淋巴細(xì)胞亞群主要發(fā)揮活化T淋巴細(xì)胞、白細(xì)胞細(xì)胞間黏附、結(jié)合泛素樣蛋白連接酶等作用，并參與調(diào)控Th17、Th1、Th2細(xì)胞分化等多個(gè)炎癥相關(guān)信號(hào)通路。免疫熒光染色結(jié)果證實(shí)，NASH組小鼠肝組織中Tcf7 + T淋巴細(xì)胞較對(duì)照組減少。Tcf7基因編碼產(chǎn)生T淋巴細(xì)胞因子1（T cell factor-1，TCF1），并參與Wnt/β連環(huán)蛋白信號(hào)通路，在分化T淋巴細(xì)胞方面發(fā)揮重要作用。Yu等［19］發(fā)現(xiàn)，在Wnt/β連環(huán)蛋白信號(hào)通路的調(diào)節(jié)下，TCF1通過(guò)誘導(dǎo)Gata結(jié)合蛋白3的產(chǎn)生促進(jìn)Th2的分化。Th2細(xì)胞主要分泌細(xì)胞因子IL-4/5/6/10等，主要發(fā)揮抗炎作用［20］。過(guò)度表達(dá)的TCF1可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，并抑制凋亡［21］。Gui等 ［22］發(fā)現(xiàn)，與原發(fā)性肝癌和正常肝組織相比，Tcf7 + CD8 + 記憶T淋巴細(xì)胞特異性富集于轉(zhuǎn)移性肝癌中。（2）此外，還發(fā)現(xiàn)第7簇T淋巴細(xì)胞的比例從對(duì)照組的41.5%增高到NASH組的51.3%。90%的該簇T淋巴細(xì)胞表達(dá)Cxcr6基因（作為標(biāo)志基因）。GO富集分析提示，第7簇的特異性基因主要發(fā)揮T淋巴細(xì)胞活化和產(chǎn)生細(xì)胞因子的功能。KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，第7簇T淋巴細(xì)胞顯著富集的通路包括T淋巴細(xì)胞受體信號(hào)通路、Th17細(xì)胞分化和MAPK信號(hào)通路。同時(shí)，免疫熒光結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，NASH組小鼠肝組織中Cxcr6 + T淋巴細(xì)胞增加。Cxcr6最初被發(fā)現(xiàn)表達(dá)于人類記憶T淋巴細(xì)胞［23］，表達(dá)Cxcr6基因的CD8 + T淋巴細(xì)胞可依賴IL-15促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡［24］，激活Cxcr6通路可促進(jìn)肝內(nèi)自然殺傷T淋巴細(xì)胞聚集，進(jìn)而加重肝內(nèi)炎癥反應(yīng)并促進(jìn)肝纖維化［25］。但Tcf7 + T淋巴細(xì)胞和Cxcr6 + T淋巴細(xì)胞在NASH中的具體機(jī)制尚未有研究報(bào)道，有待進(jìn)一步地深入研究。

綜上所述，通過(guò) NASH小鼠肝臟的單細(xì)胞測(cè)序，在NASH中篩選出2個(gè)肝組織T淋巴細(xì)胞亞群：Tcf7 + T淋巴細(xì)胞的占比降低，推測(cè)其可能通過(guò)促進(jìn)Th2細(xì)胞的分化發(fā)揮抗炎作用；而Cxcr6 + T淋巴細(xì)胞的占比增高，推測(cè)其可能通過(guò)MAPK信號(hào)通路發(fā)揮促炎作用。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2022年3月1日經(jīng)由上海市東方醫(yī)院（同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院）醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：［2022］研預(yù)審第（054）號(hào)，符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：冒婷負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)整理分析，撰寫(xiě)論文；徐銘益負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)分析和撰寫(xiě)論文；王佳軼負(fù)責(zé)論文修改，對(duì)研究的思路和設(shè)計(jì)有關(guān)鍵貢獻(xiàn)。

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收稿日期：2024-07-24；錄用日期：2024-09-23

本文編輯：林姣

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