五倍子酸對肝癌HepG2細胞索拉非尼化療增敏作用

摘要：目的觀察五倍子酸（GA）聯(lián)合索拉非尼（Sora）對HepG2細胞的化療增敏作用，并探討其作用機制。方法將肝癌HepG2細胞分為對照組、GA組、Sora組和GA+Sora組。CCK8法檢測細胞活力，CompuSyn軟件分析聯(lián)合用藥指數(shù)（CI值）；平板克隆形成實驗檢測細胞克隆形成能力；流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡；細胞劃痕和Transwell小室侵襲實驗檢測細胞遷移和侵襲能力；Western Blot法檢測基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）2、MMP-9和凋亡相關(guān)蛋白表達。肝癌HepG2細胞接種于裸鼠背部右下方，植瘤6 d后分為4組：對照組（Control）、GA組、Sora組和GA+Sora組，每周測量1次腫瘤大小和質(zhì)量，藥物干預(yù)21 d，處死裸鼠，取腫瘤稱重。計量資料多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。結(jié)果GA和Sora作用HepG2細胞48 h的IC50值分別為（123.47±5.16）μmol/L和（9.87±0.98）μmol/L，Sora與70μmol/L GA（IC30）聯(lián)用后，IC50降至（2.06±0.35）μmol/L，不同濃度Sora與70μmol/L GA聯(lián)合用藥CI值均lt;1；各組細胞克隆形成數(shù)分別為234.0±20.4、147.0±12.1、129.3±13.3、73.0±7.6，GA+Sora組細胞克隆數(shù)明顯低于對照組、GA組和Sora組（P值均lt;0.05）；處理48 h后，各組細胞凋亡率分別為（1.98±0.29）%、（15.17±1.56）%、（18.65±1.48）%和（34.60±5.36）%，GA+Sora組細胞凋亡率明顯高于對照組、GA組和Sora組（P值均lt;0.05）；處理24 h后，各組細胞遷移率分別為（55.59±5.08）%、（29.34±4.36）%、（21.80±5.16）%和（6.47±2.75）%，GA+Sora組細胞遷移率明顯低于對照組、GA組和Sora組（P值均lt;0.05）；處理48 h后，各組穿膜細胞數(shù)分別為223.7±13.0、168.3±10.9、155.3±29.1和62.7±19.7，GA+Sora組穿膜細胞數(shù)低于對照組、GA組和Sora組（P值均lt;0.05）；與對照組比較，GA組、Sora組和GA+Sora組細胞中MMP-2、MMP-9、B淋巴細胞瘤2（Bcl-2）蛋白表達水平均明顯降低（P值均lt;0.05），Bcl-2關(guān)聯(lián)X蛋白（Bax）、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Cleaved caspase-3）蛋白表達水平均明顯升高（P值均lt;0.05）。GA組、Sora組和GA+Sora腫瘤體積和瘤重均比對照組減?。≒值均lt;0.05）；與Sora組比較，GA+Sora組裸鼠腫瘤的體積和質(zhì)量均明顯減少（P值均lt;0.05）。結(jié)論GA對Sora化療有增敏作用，其機制可能與GA和Sora聯(lián)用后促進HepG2細胞凋亡及抑制細胞遷移、侵襲有關(guān)。

關(guān)鍵詞：癌，肝細胞；索拉非尼；五倍子酸

基金項目：吉林省衛(wèi)生與健康技術(shù)創(chuàng)新項目（2020J082）

Effect of gallic acid in increasing the chemosensitivity of hepatocellular carcinoma HepG2 cells to sorafenib

LIU Baikun，WANG Zhiru，ZHAO Wenjing

Central Laboratory of Hepatobiliary Hospital of Jilin，Changchun 130062，China

Corresponding author：ZHAO Wenjing，xingyuewj@163.com（ORCID：0000-0002-0841-9632）

Abstract：Objective To investigate the chemosensitization effect of gallic acid（GA）combined with sorafenib（Sora）on hepatocellular carcinoma HepG2 cells and related mechanisms.Methods HepG2 cells were randomly divided into control group，GA group，Sora group，and GA+Sora group.CCK8 assay was used to measure cell viability；CompuSyn software was used to analyze combination index（CI）；colony formation assay was used to evaluate the colony formation ability of cells；flow cytometry was used to measure cell apoptosis；wound healing assay and Transwell chamber assay were used to observe the migration and invasion abilities of cells；Western Blot was used to measure the expression matrix metalloproteinase 2（MMP-2），matrix metalloproteinase 9（MMP-9），and apoptosis-related proteins.HepG2 cells were subcutaneously inoculated into the lower right back of mice，and 6 days later，the mice were divided into control group，GA group，Sora group，and GA+Sora group.Tumor size and body weight were measured once a week，and drug intervention was performed for 21 days.Then the nude mice were sacrificed，and tumor weight was measured.A one-way analysis of variance was used for comparison between multiple groups，and the least significant difference t-test was used for further comparison between two groups.Results The mean IC50 values of GA and Sora for the treatment of HepG2 cells for 48 hours were 123.47±5.16μmol/L and 9.87±0.98μmol/L，respectively，and when Sora was combined with 70μmol/L GA（IC30），IC50 decreased to 2.06±0.35μmol/L；the CI value waslt;1 for Sora at different concentrations combined with 70μmol/L GA.The number of cell colonies was 234.0±20.4，147.0±12.1，129.3±13.3，and 73.0±7.6，respectively，in the four groups，and the GA+Sora group had a significantly lower number of cell colonies than the control group，the GA group，and the Sora group（all Plt;0.05）.After 48 hours of treatment，the cell apoptosis rate was 1.98%±0.29%，15.17%±1.56%，18.65%±1.48%，and 34.60%±5.36%，respectively，in the four groups，and the GA+Sora group had a significantly higher cell apoptosis rate than the control group，the GA group，and the Sora group（all Plt;0.05）.After 24 hours of treatment，the cell migration rate was 55.59%±5.08%，29.34%±4.36%，21.80%±5.16%，and 6.47%±2.75%，respectively，in the four groups，and the GA+Sora group had a significantly lower cell migration rate than the control group，the GA group，and the Sora group（all Plt;0.05）.After 48 hours of treatment，the number of transmembrane cells was 223.7±13.0，168.3±10.9，155.3±29.1，and 62.7±19.7，respectively，in the four groups，and the GA+Sora group had asignificantly lower number of transmembrane cells than the control group，the GA group，and the Sora group（all Plt;0.05）.Compared with the control group，the GA group，the Sora group，and the GA+Sora group had significant reductions in the protein expression levels of MMP-2，MMP-9，and Bcl-2（all Plt;0.05）and significant increases in the protein expression levels of Bax and cleaved caspase-3（all Plt;0.05）.Compared with the control group，the GA，Sora，and GA+Sora groups had significant reductions in tumor volume and weight（all Plt;0.05），and compared with the Sora group，the GA+Sora group had significant reductions in tumor volume and weight in nude mice（both Plt;0.05）.Conclusion GA can increase the sensitivity of HepG2 cells to Sora chemotherapy，possibly by promoting cell apoptosis and inhibiting cell migration and invasion after combination with Sora.

Key words：Carcinoma，Hepatocellular；Sorafenib；Gallic Acid

Research funding：Health Science and Health Technology Innovation Project of Jilin Province（2020J082）

原發(fā)性肝癌是源于肝細胞或肝內(nèi)膽管細胞的惡性腫瘤，75%～85%以上的原發(fā)性肝癌的病理類型為肝細胞癌（以下簡稱肝癌）［1-2］。2023年我國肝癌新發(fā)病例38.9萬，位列惡性腫瘤第四位，年死亡病例33.6萬，位居惡性腫瘤第二位［3］。根治性手術(shù)切除是肝癌治療的主要手段，由于肝癌發(fā)病隱匿，70%的患者在確診時已是中晚期，喪失根治性手術(shù)切除機會［4］。對于腫瘤體積較大、肝內(nèi)多發(fā)、已發(fā)生血管、淋巴結(jié)或遠處轉(zhuǎn)移的晚期肝癌患者，分子靶向藥物治療是標準治療策略［5］。索拉非尼（Sorafenib，Sora）是治療晚期肝癌的一線分子靶向藥物［6］，研究表明Sora可有效延長肝癌患者的總體生存時間，改善生存質(zhì)量［7］，但耐藥的發(fā)生限制了Sora的臨床療效。從藥用植物中尋找具有抗腫瘤活性的化合物，將其與抗腫瘤藥物聯(lián)合應(yīng)用，是抗腫瘤治療研究的熱點［8］。五倍子酸（gallic acid，GA）是一種存在于山茱萸、五倍子、牡丹皮、掌葉大黃等植物中的天然多酚酸，許多研究表明GA對多種癌細胞具有抗癌活性，包括直腸癌［9］、肺癌［10］、乳腺癌［11］、子宮內(nèi)膜癌［12］等。本課題組前期研究顯示，GA能顯著抑制肝癌細胞生長、遷移和侵襲，促進肝癌細胞凋亡和周期阻滯［13］。本研究擬通過體外實驗觀察GA與Sora聯(lián)合應(yīng)用對人肝癌HepG2細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響，體內(nèi)構(gòu)建裸鼠肝癌模型，探究GA和Sora聯(lián)合使用是否具有協(xié)同增效作用，為提高Sora治療肝癌的效果提供參考。

1材料與方法

1.1細胞、主要試劑和儀器人肝癌HepG2細胞株購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，Sora、GA購于美國MCE公司，高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司，兔抗人B淋巴細胞瘤2原癌基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體、兔抗人Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2-associated X，Bax）抗體、兔抗人裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Cleaved caspase-3）抗體、小鼠抗人基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）抗體、兔抗人MMP-9抗體購自美國Abcam公司，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗和辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠二抗購自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司，CCK8試劑盒、細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Transwell細胞培養(yǎng)板、基質(zhì)膠購自美國Corning公司。CO2細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司，倒置顯微鏡購自日本Olympus公司，流式細胞儀購自美國Beckman Coulter公司，酶標儀和SDS-PAGE蛋白電泳儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)人肝癌HepG2細胞置于含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，放于恒溫培養(yǎng)箱（5%CO2，37℃）中常規(guī)傳代培養(yǎng)，維持細胞處于對數(shù)生長期。

1.2.2 CCK8法檢測細胞活力5×103個/孔HepG2細胞接種于96孔板，培養(yǎng)24 h更換100μL含有不同藥物的培養(yǎng)基。GA組以0、25、50、100、150、200、300μmol/L的濃度梯度干預(yù)，Sora組以0、1、2、5、10、20、40μmol/L的濃度梯度干預(yù)，聯(lián)合應(yīng)用組以70μmol/L GA（IC30）［14］+Sora（1、2、5、10、20、40μmol/L）聯(lián)合使用，設(shè)置等量不含藥物和細胞的培養(yǎng)基作為空白對照組，每組設(shè)5個復(fù)孔，藥物干預(yù)48 h后酶標儀450 nm處檢測吸光度值（OD），計算細胞增殖抑制率。CompuSyn軟件計算聯(lián)合指數(shù)（combination index，CI）。

1.2.3克隆形成實驗檢測細胞增殖能力1×103個/孔HepG2細胞接種于6孔板，分為4組：對照組（Control）、GA組（70μmol/L GA）、Sora組（2μmol/L Sora）、GA+Sora組（70μmol/L GA+2μmol/L Sora）。置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)14 d，4%多聚甲醛溶液固定，PBS緩沖液洗滌3次，結(jié)晶紫染色，鏡下計數(shù)gt;10個細胞的集落數(shù)。實驗重復(fù)3次。

1.2.4 Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡細胞分組方法同1.2.3節(jié)。2×105個/孔HepG2細胞接種于6孔板，不同藥物干預(yù)48 h后收集細胞，嚴格按照試劑盒染色說明書對細胞染色，流式細胞儀檢測并計算細胞凋亡率。細胞凋亡率=（早期凋亡細胞數(shù)+晚期凋亡細胞數(shù)）/細胞總數(shù)×100%。實驗重復(fù)3次。

1.2.5細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力細胞分組方法同1.2.3節(jié)。1×106個/孔HepG2細胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h后200μL無菌槍頭垂直6孔板底部劃痕并加藥處理，加藥0 h和24 h后倒置顯微鏡下觀察、拍照。Image J軟件對劃痕距離進行分析，計算細胞遷移率。細胞遷移率=（0 h劃痕間距－24 h劃痕間距）/0 h劃痕間距×100%。實驗重復(fù)3次。

1.2.6 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力細胞分組方法同1.2.3節(jié)。取不同藥物干預(yù)48 h的HepG2細胞接種于上室，下室加入含20%胎牛血清的完全培養(yǎng)基600μL，24 h取出小室，4%多聚甲醛固定15 min，結(jié)晶紫染色液染色5 min，棉簽擦去上室細胞，待小室干燥后鏡下觀察，計數(shù)穿膜細胞數(shù)。

1.2.7 Western Blot法檢測HepG2細胞凋亡相關(guān)蛋白、MMP-2和MMP-9蛋白表達水平細胞分組方法同1.2.3節(jié)。藥物干預(yù)48h后收集細胞，根據(jù)細胞沉淀數(shù)量分別加入一定體積的RIPA裂解液（含1%PMSF），冰上裂解30 min，4℃、12 000 r/min離心15 min，收集上清液，BCA蛋白定量檢測試劑盒法檢測蛋白濃度。取30μg蛋白進行SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%BSA封閉4h，按照抗體說明書配置一抗4℃孵育過夜。TBST緩沖液洗膜3次加入1∶1 000稀釋二抗，室溫孵育2 h，洗膜3次化學(xué)發(fā)光試劑顯影并拍照。Image J軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值比值表示目的蛋白的相對表達水平。實驗重復(fù)3次。

1.2.8裸鼠異種移植瘤模型SPF級雄性裸鼠30只（6周齡，體質(zhì)量18～22 g）購自長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司，實驗動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK（吉）2020-0002，實驗動物使用許可證編號：SYXK（吉）2021-0020。收集HepG2細胞，磷酸緩沖鹽溶液制備成細胞懸液，皮下注射0.2 mL（含5×106 HepG2細胞）細胞懸液到裸鼠背部右下方。植瘤6 d后按照腫瘤大小順序蛇形均衡分為4組：對照組（Control）、GA組、Sora組和GA+Sora組，每組7只。GA和Sora的體內(nèi)給藥劑量和方式參考文獻［15］和［16］，按照GA組（80 mg/kg GA）、Sora組（20 mg/kg Sora）、GA+Sora組（80 mg/kg GA+20 mg/kg Sora）的濃度給藥。按照上述藥物濃度隔天給藥1次（灌胃體積按照0.1 mL/10 g標準計算），對照組給予生理鹽水。監(jiān)測裸鼠活動及一般狀態(tài)，每周測量1次腫瘤大小和質(zhì)量，根據(jù)公式腫瘤體積=長徑×短徑2/2，估算腫瘤體積。藥物干預(yù)21 d，處死裸鼠，取腫瘤稱重。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法Graphpad Prism 7.0軟件計算藥物30%細胞生長抑制濃度（30%inhibition concentration，IC30）和半數(shù)抑制濃度（50%inhibition concentration，IC50）。采用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 GA與Sora聯(lián)用對HepG2細胞增殖抑制作用不同濃度GA、Sora，以及兩藥聯(lián)合對HepG2細胞增殖均有抑制作用，且具有濃度依賴性。GA和Sora作用HepG2細胞48 h的IC50值分別為（123.47±5.16）μmol/L和（9.87±0.98）μmol/L，Sora與70μmol/L GA（IC30）聯(lián)用后，IC50降至（2.06±0.35）μmol/L。利用CompuSyn軟件計算CI值，不同濃度Sora與70μmol/L GA聯(lián)合用藥CI值均lt;1，說明GA與Sora聯(lián)合使用具有協(xié)同作用（表1）。根據(jù)藥物聯(lián)用選擇原則［17］（CIgt;1拮抗，CI=1疊加，0.6lt;CIlt;1協(xié)同，CIlt;0.6強協(xié)同）確定70μmol/L GA與2μmol/L Sora為后續(xù)實驗聯(lián)合用藥組藥物濃度，作用時間48 h。

2.2 GA與Sora聯(lián)用對HepG2細胞增殖能力的影響加藥處理后各組細胞培養(yǎng)14 d，GA+Sora組細胞克隆數(shù)（73.0±7.6）明顯低于對照組（234.0±20.4）、GA組（147.0±12.1）和Sora組（129.3±13.3）（P值均lt;0.05）（圖1）。

2.3 GA與Sora聯(lián)用對HepG2細胞凋亡的影響Annexin V-FITC/PI雙染實驗結(jié)果（圖2）顯示，對照組、GA組、Sora組和GA+Sora組細胞凋亡率分別為（1.98±0.29）%、（15.17±1.56）%、（18.65±1.48）%和（34.60±5.36）%。與對照組比較，GA組、Sora組、GA+Sora組細胞凋亡率均明顯升高（P值均lt;0.05）；與GA組、Sora組比較，GA+Sora組細胞凋亡率顯著升高（P值均lt;0.05）。

2.4 GA和Sora聯(lián)用對HepG2細胞遷移能力的影響加藥處理24 h后，對照組、GA組、Sora組和GA+Sora組細胞遷移率分別為（55.59±5.08）%、（29.34±4.36）%、（21.80±5.16）%和（6.47±2.75）%。與對照組比較，GA組、Sora組和GA+Sora組細胞遷移率均降低（P值均lt;0.05）；GA組與Sora組細胞遷移率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05）；與GA組、Sora組比較，GA+Sora組細胞遷移率降低（P值均lt;0.05）（圖3）。

2.5 GA與Sora聯(lián)用對HepG2細胞侵襲能力的影響Transwell實驗24 h后，對照組、GA組、Sora組和GA+Sora組HepG2細胞穿膜細胞數(shù)分別為223.7±13.0、168.3±10.9、155.3±29.1和62.7±19.7，與對照組比較，GA組、Sora組和GA+Sora組穿膜細胞數(shù)均降低（P值均lt;0.05）；與GA組、Sora組比較，GA+Sora組穿膜細胞數(shù)明顯降低（P值均lt;0.05）（圖4）。

2.6 GA與Sora聯(lián)用對HepG2細胞MMP-2、MMP-9和凋亡相關(guān)蛋白表達的影響與對照組比較，GA組、Sora組和GA+Sora組細胞中MMP-2和MMP-9表達水平均降低（P值均lt;0.05），凋亡相關(guān)蛋白Bax和Cleaved caspase-3蛋白表達均增加（P值均lt;0.05），Bcl-2蛋白表達降低（P值均lt;0.05）；與GA組和Sora組比較，GA+Sora組細胞中MMP-2和MMP-9表達水平均明顯降低（P值均lt;0.05），凋亡相關(guān)蛋白Bax和Cleaved caspase-3蛋白表達均增加（P值均lt;0.05），Bcl-2蛋白表達降低（P值均lt;0.05）（圖5，表2）。

2.7 GA與Sora聯(lián)用對裸鼠腫瘤生長的影響4組裸鼠在喂養(yǎng)過程中，精神、飲食及排便均比較正常，體質(zhì)量在喂養(yǎng)過程中增加，其中GA組和GA+Sora組體質(zhì)量增加較多，其次為Sora組，Sora組與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Pgt;0.05）。與對照組比較，GA組、Sora組及GA+Sora組均顯著抑制裸鼠腫瘤的生長和腫瘤大小（P值均lt;0.05）；與Sora組比較，GA+Sora組裸鼠腫瘤的體積和質(zhì)量明顯減少（P值均lt;0.05）（圖6）。

3討論

肝癌是我國常見的惡性實體腫瘤［18］。Sora是治療晚期肝癌的一線靶向藥物，具有抑制腫瘤細胞增殖及阻斷腫瘤血管生成的雙重抗腫瘤作用［19］。多項國際性臨床試驗結(jié)果表明Sora可延長晚期肝癌患者生存期、提高生存質(zhì)量，但耐藥性和毒副作用限制了其臨床應(yīng)用。據(jù)報道，許多從中草藥提取的小分子與化療藥物聯(lián)合使用時表現(xiàn)出了增強的臨床療效［20-21］。GA具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗菌、抗糖尿病等多種藥理活性。張仲衛(wèi)等［22］研究結(jié)果表明，GA聯(lián)合順鉑在體內(nèi)外均具有協(xié)同抗食管癌的作用。楊勤龍［23］使用含有GA成分的中藥大黃墊蟲丸治療食管癌患者，患者病情逐漸好轉(zhuǎn)。本研究前期結(jié)果顯示，GA對肝癌細胞的生長、遷移和侵襲均具有顯著的抑制作用，并通過線粒體途徑促進肝癌細胞凋亡［13］。這些結(jié)果提示，GA可與其他化療藥物聯(lián)合應(yīng)用于腫瘤治療。本實驗首先觀察GA聯(lián)合Sora抑制HepG2細胞增殖的協(xié)同抑制作用，結(jié)果顯示，GA與Sora對肝癌HepG2細胞增殖均具有抑制作用，兩藥聯(lián)合對HepG2細胞抑制作用更明顯。Sora作用HepG2細胞48 h的IC50值為（9.87±0.98）μmol/L，與70μmol/L GA（IC30）聯(lián)合用藥后，IC50降至（2.06±0.35）μmol/L，且不同濃度Sora與70μmol/L GA聯(lián)合用藥CI值均lt;1。為進一步證實GA與Sora聯(lián)合體內(nèi)協(xié)同抗肝癌作用，本研究在裸鼠肝癌移植瘤模型中測定了GA單藥組（80 mg/kg）、Sora單藥（20 mg/kg）組及GA（80 mg/kg）和Sora（20 mg/kg）聯(lián)用組的腫瘤生長情況，結(jié)果顯示，與對照組、GA或Sora單藥組相比，聯(lián)用組則腫瘤體積明顯減少，GA與Sora聯(lián)合應(yīng)用抗腫瘤效果最佳。體外、體內(nèi)實驗結(jié)果均提示GA聯(lián)合Sora有協(xié)同抗肝癌作用，可降低Sora劑量，減少不良反應(yīng)，這對于臨床用藥有重要的指導(dǎo)意義。

Sora是一種多靶點抗腫瘤藥，其藥理機制之一是通過抑制Raf/Mek/Erk信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制腫瘤生長，促進細胞凋亡。本研究從細胞凋亡角度觀察GA化療增敏作用及可能機制，結(jié)果顯示，GA與Sora聯(lián)用可顯著增加HepG2細胞凋亡比例。Bcl-2蛋白家族是線粒體途徑凋亡的主要調(diào)控因子，家族中的Bcl-2是一個主要的抑凋亡蛋白，通過阻止線粒體細胞色素C的釋放發(fā)揮抗凋亡作用，Bax是主要的促凋亡蛋白，通過增加線粒體膜通透性，釋放細胞色素C而引起凋亡發(fā)生［24］。Bax蛋白的高表達、Bcl-2蛋白的低表達作用于線粒體，導(dǎo)致線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔開放，細胞色素C、Smac等凋亡相關(guān)因子釋放入胞漿，進而激活Caspase-3，引起細胞凋亡［25］。本研究發(fā)現(xiàn)GA對Sora化療增敏的作用機制與升高促凋亡蛋白Bax表達、降低抑凋亡蛋白Bcl-2表達，增加凋亡蛋白Caspase-3的活化有關(guān)。

腫瘤細胞轉(zhuǎn)移是癌癥死亡的主要原因，肝癌的高死亡率與肝癌細胞的高轉(zhuǎn)移和高侵襲力密切相關(guān)［26］。本研究劃痕抑制和Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示，GA和Sora單藥對HepG2細胞遷移和侵襲能力的抑制作用較弱，聯(lián)用后可顯著降低HepG2細胞凋亡遷移和侵襲能力。細胞外基質(zhì)降解和穿透基底膜是腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，MMP能夠降解基底膜和細胞外基質(zhì)中的Ⅳ型膠原、層粘連蛋白和彈性蛋白等成分，從而促進癌細胞對鄰近和遠端組織的遷移和侵襲［26］。研究顯示MMP-2和MMP-9與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)［27］。Western Blot分析結(jié)果顯示聯(lián)合用藥組MMP-2和MMP-9表達水平顯著降低，GA與Sora聯(lián)用可通過降低MMP-2和MMP-9蛋白的表達，抑制肝癌細胞的遷移和侵襲。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)GA與Sora在體內(nèi)、體外抗肝癌作用上均發(fā)揮協(xié)同作用，這種協(xié)同作用可能與促進肝癌細胞凋亡、抑制遷移和侵襲有關(guān)。這些結(jié)果提示將GA與Sora聯(lián)合使用可能是一個有前景的肝癌臨床治療策略。課題組后續(xù)將從細胞遷移、侵襲信號通路及動物實驗等角度進一步深入探索GA對Sora化療增敏的作用機制，以期為臨床提高肝癌治療效果提供實驗依據(jù)。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2024年1月6日經(jīng)由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會審批，批號：2024年研審第17號。符合實驗室動物管理與使用準則。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：劉百坤負責(zé)課題設(shè)計，資料分析，撰寫論文；王志茹參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；趙文靜負責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。

參考文獻：

[1]ZHOU J，SUN HC，WANG Z，et al.Guidelines for the diagnosis and treatment of primary liver cancer（2022 edition）[J].Liver Cancer，2023，12（5）：405-444.DOI：10.1159/000530495.

[2]CHEN W，ZHENG R，BAADE PD，et al.Cancer statistics in China，2015[J].CA Cancer J Clin，2016，66（2）：115-132.DOI：10.3322/caac.21338.

[3]YANG XL，XUE JH，CHEN TY，et al.Effect of atractylone on the vi?ability and apoptosis of hepatoma HepG2 cells and related mecha?nism[J].J Clin Hepatol，2021，37（11）：2589-2594.DOI：10.3969/j.issn.1001-5256.2021.11.020.

楊雪麗，薛建華，陳天陽，等.蒼術(shù)酮對肝癌HepG2細胞活性、凋亡的影響及其相關(guān)機制[J].臨床肝膽病雜志，2021，37（11）：2589-2594.DOI：10.3969/j.issn.1001-5256.2021.11.020.

[4]LI Z，LIU JK.The mechanism of p53 signaling pathway regulating ferroptosis in hepatocellular carcinoma[J].J Clin Hepatol，2023，39（4）：956-960.DOI：10.3969/j.issn.1001-5256.2023.04.032.

李震，劉江凱.p53信號通路調(diào)控鐵死亡在肝細胞癌中的作用機制[J].臨床肝膽病雜志，2023，39（4）：956-960.DOI：10.3969/j.issn.1001-5256.2023.04.032.

[5]General Office of National Health Commission.Standard for diagno?sis and treatment of primary liver cancer（2022 edition）[J].J Clin Hepatol，2022，38（2）：288-303.DOI：10.3969/j.issn.1001-5256.2022.02.009.

國家衛(wèi)生健康委辦公廳.原發(fā)性肝癌診療指南（2022年版）[J].臨床肝膽病雜志，2022，38（2）：288-303.DOI：10.3969/j.issn.1001-5256.2022.02.009.

[6]BENSON AB，D’ANGELICA MI，ABBOTT DE，et al.Guidelines in?sights：Hepatobiliary cancers，version 2.2019[J].J Natl Compr Canc Netw，2019，17（4）：302-310.DOI：10.6004/jnccn.2019.0019.

[7]XIAN LF，ZHAO P，CHEN X，et al.Heterogeneity，inherent and ac?quired drug resistance in patient-derived organoid models of pri?mary liver cancer[J].Cell Oncol（Dordr），2022，45（5）：1019-1036.DOI：10.1007/s13402-022-00707-3.

[8]AI XY，HOU XF，F(xiàn)ENG NP.Combination of shikonin and gefitinib re?verses drug resistance in human non-small cell lung cancer and its mechanism[J].China J Chin Mater Med，2024，49（1）：175-184.DOI：10.19540/j.cnki.cjcmm.20230810.401.

艾鑫儀，侯雪峰，馮年平.紫草素與吉非替尼聯(lián)用逆轉(zhuǎn)人非小細胞肺癌耐藥及其機制研究[J].中國中藥雜志，2024，49（1）：175-184.DOI：10.19540/j.cnki.cjcmm.20230810.401.

[9]HONG ZC，TANG PL，LIU B，et al.Erratum for ferroptosis-ralated genes for overall survival prediction in patients with colorectal can?cer can be inhibited by gallic acid[J].Int J Biol Sci，2022，18（4）：1398-1399.DOI：10.7150/ijbs.69081.

[10]KO EB，JANG YG，KIM CW，et al.Gallic acid hindered lung cancer progression by inducing cell cycle arrest and apoptosis in A549 lung cancer cells via PI3K/Akt pathway[J].Biomol Ther（Seoul），2022，30（2）：151-161.DOI：10.4062/biomolther.2021.074.

[11]ABOREHAB NM，ELNAGAR MR，WALY NE.Gallic acid potentiates the apoptotic effect of paclitaxel and carboplatin via overexpression of Bax and P53 on the MCF-7 human breast cancer cell line[J].J Biochem Mol Toxicol，2021，35（2）：e22638.DOI：10.1002/jbt.22638.

[12]BULBUL MV，KARABULUT S，KALENDER M，et al.Effects of gallic acid on endometrial cancer cells in two and three dimensional cellculture models[J].Asian Pac J Cancer Prev，2021，22（6）：1745-1751.DOI：10.31557/APJCP.2021.22.6.1745.

[13]SUN GJ，ZHANG SQ，XIE YR，et al.Gallic acid as a selective anti?cancer agent that induces apoptosis in SMMC-7721 human hepato?cellular carcinoma cells[J].Oncol Lett，2016，11（1）：150-158.DOI：10.3892/ol.2015.3845.

[14]XU WB，XIE SD，CHEN X，et al.Effects of quercetin on the efficacy of various chemotherapeutic drugs in cervical cancer cells[J].Drug Des Devel Ther，2021，15：577-588.DOI：10.2147/DDDT.S291865.

[15]SHI CJ，ZHENG YB，PAN FF，et al.Gallic acid suppressed tumori?genesis by an lncRNA MALAT1-Wnt/β-catenin axis in hepatocellular carcinoma[J].Front Pharmacol，2021，12：708967.DOI：10.3389/fphar.2021.708967.

[16]LI ZJ，DAI HQ，HUANG XW，et al.Artesunate synergizes with sorafenib to induce ferroptosis in hepatocellular carcinoma[J].Acta Pharmacol Sin，2021，42（2）：301-310.DOI：10.1038/s41401-020-0478-3.

[17]CHOU TC.Theoretical basis，experimental design，and computer?ized simulation of synergism and antagonism in drug combination studies[J].Pharmacol Rev，2006，58（3）：621-681.DOI：10.1124/pr.58.3.10.

[18]CHEN H，NING L，CAI L，et al.Synergistic antitumor effect of evodi?amine combined with sorafenib on hepatocellular carcinoma HepG2 cells[J].J Hubei Univ Sci Technol Med Sci，2023，37（6）：461-464，480.DOI：10.16751/j.cnki.2095-4646.2023.06.0461.

陳慧，寧琳，蔡麗，等.索拉非尼聯(lián)合吳茱萸堿對肝癌HepG2細胞的協(xié)同抗腫瘤作用[J].湖北科技學(xué)院學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2023，37（6）：461-464，480.DOI：10.16751/j.cnki.2095-4646.2023.06.0461.

[19]CHEN C，XU HL，WANG P，et al.Inhibition effect of sorafenib com?bined with the Saponin fraction from Gleditsia sinensis on HepG2 cells[J].J Clin Exp Med，2019，18（2）：143-146.DOI：10.3969/j.issn.1671-4695.2019.02.009.

陳成，許漢林，王平，等.豬牙皂皂苷與索拉非尼聯(lián)用對肝癌HepG2細胞的抑制作用及其機制[J].臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志，2019，18（2）：143-146.DOI：10.3969/j.issn.1671-4695.2019.02.009.

[20]TANG MX，YANG MJ，HE KY，et al.Glycyrrhetinic acid remodels the tumor microenvironment and synergizes with doxorubicin for breast cancer treatment in a murine model[J].Nanotechnology，2021，32（18）：185702.DOI：10.1088/1361-6528/abe076.

[21]WANG XQ，LI QF，CHEN L，et al.Inhibitory effect of curcumin on sorafenib resistance in hepatocellular carcinoma and its regulatory mechanism[J/OL].Chin J Hepat Surg（Electronic Edition），2024，13（5）：729-735.DOI：10.3877/cma.j.issn.2095-3232.2024.05.023.

王向前，李清峰，陳磊，等.姜黃素抑制肝細胞癌索拉非尼耐藥作用及其調(diào)控機制[J/OL].中華肝臟外科手術(shù)學(xué)電子雜志，2024，13（5）：729-735.DOI：10.3877/cma.j.issn.2095-3232.2024.05.023.

[22]ZHANG ZW，LI ZG，LI CX.Combination of gallic acid and cisplatin inhibits esophageal cancer by downregulating COX-2[J].Chin J Surg Integr Tradit West Med，2024，30（4）：562-567.DOI：10.3969/j.issn.1007-6948.2024.04.025.

張仲衛(wèi)，李志剛，李彩霞.沒食子酸聯(lián)合順鉑通過下調(diào)環(huán)氧化酶-2抑制食管癌的實驗研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合外科雜志，2024，30（4）：562-567.DOI：10.3969/j.issn.1007-6948.2024.04.025.

[23]YANG QL.Treating advanced malignancies mainly with DahuangZhechong pill[J].Clin J Chin Med，2013，5（19）：16-17.DOI：10.3969/j.issn.1674-7860.2013.19.008.

楊勤龍.大黃蟄蟲丸為主治療晚期惡性腫瘤[J].中醫(yī)臨床研究，2013，5（19）：16-17.DOI：10.3969/j.issn.1674-7860.2013.19.008.

[24]YUAN CL，CHEN GP，JING CB，et al.Eriocitrin，a dietary flavonoid suppressed cell proliferation，induced apoptosis through modulation of JAK2/STAT3 and JNK/p38 MAPKs signaling pathway in MCF-7 cells[J].J Biochem Mol Toxicol，2022，36（1）：e22943.DOI：10.1002/jbt.22943.

[25]WANG ZY，ZHANG H，ZHOU JH，et al.Eriocitrin from lemon sup?presses the proliferation of human hepatocellular carcinoma cells through inducing apoptosis and arresting cell cycle[J].Cancer Chemother Pharmacol，2016，78（6）：1143-1150.DOI：10.1007/s00280-016-3171-y.

[26]HAN QQ，YE MR，JIN QL.Demethylzeylasteral inhibits proliferation，migration and invasion and promotes apoptosis of non-small cell lung cancer cells by inhibiting the AKT/CREB signaling pathway[J].J South Med Univ，2024，44（2）：280-288.DOI：10.12122/j.issn.1673-4254.2024.02.10.

韓齊齊，葉夢然，金齊力.去甲澤拉木醛通過抑制AKT/CREB信號通路抑制非小細胞肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2024，44（2）：280-288.DOI：10.12122/j.issn.1673-4254.2024.02.10.

[27]XU GS，JIANG HB，PAN Q，et al.Inhibitory effects of betulinic acidon migration and invasion of gastric cancer MGC-803 cells and their mechanisms[J].J Jilin Univ Med Ed，2022，48（1）：122-128.DOI：10.13481/j.1671-587X.20220115.

許廣松，蔣海兵，盤箐，等.樺木酸對胃癌MGC-803細胞遷移和侵襲的抑制作用及其機制[J].吉林大學(xué)學(xué)報（醫(yī)學(xué)版），2022，48（1）：122-128.DOI：10.13481/j.1671-587X.20220115.

收稿日期：2024-07-09；錄用日期：2024-09-18

本文編輯：王亞南