基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)探討金擔(dān)子素A 抗白色念珠菌的作用機制

[摘要] 目的 探究金擔(dān)子素A （AbA） 對白色念珠菌的抑菌活性及潛在作用機制，評估其未來作為新型抗真菌藥物的應(yīng)用潛力。方法 首先測定了AbA的最低抑菌濃度（MIC），并探究其對菌絲形成及細(xì)胞壁完整性的影響。隨后，利用轉(zhuǎn)錄組測序探討了白色念珠菌在AbA作用下的響應(yīng)機制。結(jié)果 體外實驗結(jié)果顯示AbA的MIC值為0.062 5 μg/mL，并能顯著抑制白色念珠菌的形態(tài)轉(zhuǎn)換、破壞其細(xì)胞壁完整性。通過轉(zhuǎn)錄組測序共篩選出700 個差異表達基因，其中上調(diào)基因465 個，下調(diào)基因235 個。京都基因（GO） 富集分析結(jié)果顯示：細(xì)胞外周、細(xì)胞質(zhì)膜、真菌型細(xì)胞壁及氧化還原酶活性相關(guān)的通路最為富集?；蚪M百科全書（KEGG） 富集分析結(jié)果表明代謝途徑通路的富集程度最高。結(jié)論 AbA對白色念珠菌具有較強的抑制作用，其潛在抗菌機制可能包括抑制菌絲形成、破壞細(xì)胞質(zhì)膜、降低免疫逃逸能力以及抑制代謝活動。明確以上機制能夠為制定更有效的抗真菌治療策略提供重要理論依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 白色念珠菌； 金擔(dān)子素A； 轉(zhuǎn)錄組測序； 基因組百科全書富集分析； 京都基因富集分析

[中圖分類號] R780.2 [文獻標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/gjkq.2025029

白色念珠菌（Candida albicans） 作為一種條件致病真菌，通過黏附和形態(tài)轉(zhuǎn)換入侵宿主體內(nèi)[1-2]。傳統(tǒng)抗真菌藥物僅局限于3類化合物，如唑類、多烯類及棘白霉素類[3-4]，這些藥物存在不良作用大、易產(chǎn)生耐藥性、抗菌譜狹窄等問題，這些因素嚴(yán)重制約了其治療效果[5]。此外，真菌能夠形成復(fù)雜的生物膜結(jié)構(gòu)，有效屏蔽藥物并減少其在細(xì)胞靶點處的有效濃度，進一步加劇了耐藥性的產(chǎn)生[6-7]。因此，開發(fā)新型抗真菌藥物并深入探究其潛在抗菌機制，成為目前防止真菌耐藥性產(chǎn)生的主要突破口。

微生物天然產(chǎn)物作為研發(fā)新型抗真菌藥物的重要來源之一，由于其優(yōu)異的生物相容性及可利用性已在抗真菌藥物的開發(fā)中展現(xiàn)出顯著的潛力[8]。金擔(dān)子素A （aureobasidin A，AbA） 是從絲狀真菌普魯蘭金桿菌（Aureobasidium pullulans）R106號中分離得到的環(huán)酯肽類抗生素。作為肌醇磷酸神經(jīng)酰胺（inositol phosphorylceramide，IPC）合成酶的天然分子抑制劑，這種靶向機制不僅賦予了AbA顯著抗真菌活性，而且揭示了其作為新型藥物的潛在價值[9]。前期研究顯示：AbA不僅能夠影響白色念珠菌的形態(tài)轉(zhuǎn)換，還能有效抑制其質(zhì)膜形成。為更深入探究其潛在的抗菌機制，本研究采用新一代轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)全面評估AbA處理后白色念珠菌轉(zhuǎn)錄水平變化。通過對比差異表達基因組和轉(zhuǎn)錄水平識別潛在的生物標(biāo)志物和新靶點，從而深入理解其抗菌機制[10-11]，為全面闡明AbA抗菌機制提供重要數(shù)據(jù)參考。

1 材料和方法

1.1 菌株和實驗材料

白色念珠菌SC5314 （北京百歐博偉生物技術(shù)有限公司，中國），AbA （甲醇溶液）（上海源葉生物科技有限公司，中國）。沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（sabouraud dextrose broth，SDB），酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose，YPD）。

1.2 實驗方法

1.2.1 AbA 體外抗菌能力檢測 采用CLSI-M27-A3 方法測定[12]。將100 μL 白色念珠菌懸浮液（2.5×103 CFU/mL） 與終濃度為0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1.0 μg/mL AbA在37 ℃下共同孵育24 h后記錄600 nm處的吸光度值（optical density，OD），以確定AbA的最低抑菌濃度。為觀察其菌絲形成情況使用蜘蛛菌絲（spider） 液體培養(yǎng)基稀釋菌液至1×106 CFU/mL并與上述濃度AbA共培養(yǎng)4 h后倒置顯微鏡（Olympus公司，日本） 下觀察。進一步采用掃描電子顯微鏡（scanningelectron microscope，SEM） 觀察AbA對白色念珠菌微觀結(jié)構(gòu)的影響，取過夜培養(yǎng)的白色念珠菌并加入100 μL濃度為8×最低抑菌濃度（minimum inhibitoryconcentration，MIC） AbA共培養(yǎng)12 h后使用磷酸鹽緩沖鹽水（phosphate-buffered saline，PBS） 清洗3次，3 000 r/min離心后去離子水重懸，將50 μL菌液滴在硅片上，干燥后加入2.5%戊二醛浸泡過夜，PBS清洗后使用乙醇梯度脫水（依次70%、80%、90%、100%） 各5 min，待其自然干燥后使用SEM觀察未處理組與藥物處理組之間微觀結(jié)構(gòu)差異。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組測序分析差異表達基因 1） 樣品制備。將6管樣品作不同處理后分為2組。①對照組：白色念珠菌懸液；②藥物處理組：AbA處理組。將過夜培養(yǎng)的白色念珠菌（1×108 CFU/mL） 使用沙氏液體培養(yǎng)基重懸后，分至6個試管中。藥物處理組中加入AbA使其終濃度為0.062 5 μg/mL。對照組中加入等體積的PBS，共培養(yǎng)12 h后使用PBS洗滌3次后收集菌體，放入液氮中迅速冷凍后轉(zhuǎn)入-80 ℃保存，以便進行后續(xù)實驗。

2） 差異表達基因分析。使用三氯醇異氯醇溶液（TRIzol） 提取RNA并質(zhì)檢合格后，對文庫的插入片段長度（insert size） 和有效濃度進行檢測，合格后不同文庫按照目標(biāo)測序數(shù)據(jù)量進行混合并上機測序。

測序完成后，使用RNA測序（RNA sequencing，RNA-seq） 對整體質(zhì)量進行評估。并利用主成分分析評估組間差異及組內(nèi)樣本生物學(xué)重復(fù)優(yōu)劣。使用DESeq2進行組間基因的差異表達分析，差異表達基因的默認(rèn)篩選閾值為：| log2FC|gt;1和Padjlt;0.05。

3） 差異表達基因富集分析。對差異表達基因進行京都基因（gene ontology，GO） 和基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG） 富集分析進而說明差異基因的功能富集情況，在基因功能水平闡明樣本間的差異。使用clusterProfiler R軟件包進行GO功能富集和KEGG通路富集分析，當(dāng)Plt;0.05時，認(rèn)為GO或者KEGG功能差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2.3 通過實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（realtimequantitative polymerase chain reaction， RTqPCR）驗證關(guān)鍵基因 首先對差異表達基因中的關(guān)鍵基因ALS3、HWP1、EFG1、EAP1、TUP1進行了體外RT-qPCR驗證。選用濃度為0×MIC （對照）、1×MIC、4×MIC、8×MIC的AbA分別與白色念珠菌共培養(yǎng)24 h后，提取各組菌體總RNA。以提取的總RNA為模板，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成互補DNA （complementary DNA，cDNA） 后進行RT-qPCR。目的基因及內(nèi)參基因（GSP1） 的引物序列如表1所示。

2 結(jié)果

2.1 AbA體外抗菌能力檢測

CLSI-M27-A3測定結(jié)果顯示：AbA的MIC值為0.062 5 μg/mL。菌絲形成實驗結(jié)果如圖1顯示：與未處理組對比不同濃度AbA處理后菌絲形成均被抑制，1×MIC AbA處理組僅觀察到酵母態(tài)細(xì)胞。SEM圖像（圖2） 結(jié)果進一步證實：細(xì)胞表面出現(xiàn)皺縮和破裂且菌絲態(tài)細(xì)胞減少，表明AbA有效抑制了兩相轉(zhuǎn)換并破壞了細(xì)胞壁完整性。

2.2 轉(zhuǎn)錄組差異基因分析

對照組及AbA處理組轉(zhuǎn)錄組差異表達基因結(jié)果顯示：共檢測到700個差異基因，包括465個上調(diào)基因和235個下調(diào)基因，并根據(jù)結(jié)果繪制了火山圖（圖3） 。

2.3 差異基因GO及KEGG富集分析

對差異表達基因結(jié)果進行了GO富集分析及KEGG富集分析，根據(jù)P值排序選取最為顯著的通路并繪制了富集氣泡圖。結(jié)果如圖4所示：GO富集分析生物過程主要涉及細(xì)胞外周、細(xì)胞質(zhì)膜、真菌型細(xì)胞壁及氧化還原酶活性。KEGG富集分析結(jié)果（圖5） 顯示：代謝途徑通路最為富集，還包括不同環(huán)境下的微生物代謝、次生代謝物的生物合成等、碳代謝及丙酮酸代謝。

2.4 關(guān)鍵基因RT-qPCR驗證結(jié)果

RT-qPCR 結(jié)果如圖6 所示： 目的基因經(jīng)1×MIC、4×MIC、8×MIC AbA處理后均呈濃度依賴性下調(diào)。這也進一步說明其抗菌機制可能通過抑制兩相性轉(zhuǎn)變、抑制黏附、降低免疫逃逸能力等發(fā)揮抗菌作用。

3 討論

3.1 探究AbA的體外抗菌能力

結(jié)果顯示：AbA顯著抑制了白色念珠菌的菌絲形成、兩相性轉(zhuǎn)變。SEM觀察到AbA導(dǎo)致白色念珠菌微觀結(jié)構(gòu)改變，破壞了細(xì)胞壁的完整性并最終導(dǎo)致真菌死亡。

3.2 轉(zhuǎn)錄組表達量差異分析

通過轉(zhuǎn)錄組測序共檢測出6 220個表達基因，其中700個基因存在差異表達，包括465個上調(diào)基因和235個下調(diào)基因。隨后，通過GO及KEGG富集分析并對關(guān)鍵基因進行了深入探討。

3.2.1 差異表達基因分析 經(jīng)AbA處理后的白色念珠菌與對照組基因表達差異顯著。其中表達差異倍數(shù)大于5的基因有20個，涉及菌絲形成、質(zhì)膜形成、黏附能力、氧化應(yīng)激、免疫逃逸等方面。

白色念珠菌的毒力關(guān)鍵因素是其黏附能力[13-14]。其強弱顯著依賴糖基磷脂酰肌醇錨定的細(xì)胞壁蛋白（glycosylphosphatidylinositol-anchored cell wallprotein，GPI-CWP） 家族的成員，包括HWP1和Eap1p[15]。HWP1是白色念珠菌菌絲相關(guān)黏附素，參與菌絲發(fā)育和細(xì)胞壁組裝[16]。此外，HWP1作為一種黏附素，能夠促進與上皮細(xì)胞的結(jié)合，從而實現(xiàn)定植的目的[17]。AbA處理組HWP1基因的顯著下調(diào)表明AbA抑制了菌絲黏附素的形成，從而抑制真菌與宿主細(xì)胞的結(jié)合，避免細(xì)胞受到真菌的損傷。

EAP1基因編碼的Eap1p對于黏附同樣至關(guān)重要[18]，EFG1/efg1無效突變體白色念珠菌已被證明可以將黏附水平恢復(fù)至野生型水平，其中EFG1、TUP1被認(rèn)為是誘導(dǎo)白色念珠菌菌絲形成的關(guān)鍵因子之一[19-20]。體外RT-qPCR結(jié)果顯示：AbA處理后白色念珠菌EAP1、HWP1及TUP1基因均下調(diào)。進一步說明AbA對GPI-CWP家族具有顯著的抑制作用，從而有效降低了真菌的黏附能力。

此外，白色念珠菌中的重要侵襲素 ALS3 能夠誘導(dǎo)真菌附著于上皮細(xì)胞并促進其細(xì)胞內(nèi)吞，從而提高其對宿主免疫系統(tǒng)的逃逸能力。這種機制不僅提升了真菌的黏附性，還幫助其更有效地逃避宿主的免疫[21-23]。本實驗結(jié)果顯示：ALS3基因在差異表達分析中表達量顯著下調(diào)與RT-qPCR結(jié)果相同且具有濃度依賴性。因此，上述結(jié)果揭示了AbA可能通過抑制白色念珠菌的黏附、質(zhì)膜形成、兩相性轉(zhuǎn)變、減弱免疫逃逸能力從而發(fā)揮抗真菌作用。

3.2.2 GO 富集分析基因表達差異 GO數(shù)據(jù)庫作為廣泛應(yīng)用于生物信息分析的統(tǒng)計學(xué)方法，能夠清晰反映基因集的富集情況[24]。通過GO富集分析發(fā)現(xiàn)基因差異主要富集在細(xì)胞組分與分子功能方面。細(xì)胞組分中富集于細(xì)胞外周、細(xì)胞質(zhì)膜、真菌型細(xì)胞壁，分子功能中則富集于氧化還原酶活性。這說明AbA可能通過破壞細(xì)胞壁完整性和抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)來發(fā)揮抗菌作用。

3.2.3 KEGG富集分析基因表達差異 KEGG數(shù)據(jù)庫作為了解差異表達基因的相關(guān)功能與作用通路的主要工具[25-26]。為進一步明確AbA作用后基因集的功能分布及生物學(xué)過程，本團隊進行了KEGG富集分析。其結(jié)果顯示：藥物處理組與對照組相比顯著富集的通路在于代謝途徑、不同環(huán)境中的微生物代謝、次生代謝物的生物合成、碳代謝及丙酮酸代謝。結(jié)果表明：AbA可能通過干擾白色念珠菌的能量代謝途徑，特別是丙酮酸和其他重要代謝產(chǎn)物的合成和利用，從而削弱其在宿主中的存活能力以達到抗菌作用[27]。

4 結(jié)論

本研究驗證了AbA能有效抑制白色念珠菌的生長、形態(tài)轉(zhuǎn)換、質(zhì)膜形成等發(fā)揮毒力的關(guān)鍵功能，并通過轉(zhuǎn)錄組測序全面分析了AbA對真菌代謝途徑和功能的具體影響。差異表達基因所涉及的生物過程與前述體外抗菌實驗以及RT-qPCR結(jié)果一致，初步闡釋了AbA的潛在抑菌機制。這些研究結(jié)果為理解AbA的抗真菌機制提供了重要參考，并為未來AbA抗真菌藥物的研發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。

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（ 本文編輯 王姝 ）