大豆擴(kuò)展蛋白基因GmEXLA1 在莢果發(fā)育中的功能鑒定

摘要：擴(kuò)展蛋白是一類通過(guò)松弛細(xì)胞壁釋放胞內(nèi)膨脹壓力使植物細(xì)胞得以擴(kuò)張的蛋白，在植物生長(zhǎng)發(fā)育以及抵御各種逆境脅迫中發(fā)揮重要功能。然而，有關(guān)擴(kuò)展蛋白在莢果發(fā)育中的作用尚不明確，鑒于此，克隆大豆擴(kuò)展蛋白基因GmEXLA1，并研究其在莢果發(fā)育中的功能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GmEXLA1 在大豆莢粒中優(yōu)勢(shì)表達(dá)，開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度780 bp，編碼259個(gè)氨基酸，其中第1～19位氨基酸屬于信號(hào)肽序列，具有擴(kuò)展蛋白發(fā)揮其生物學(xué)功能所必需的2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域；煙草葉片亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，編碼蛋白GmEXLA1位于植物細(xì)胞壁；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，GmEXLA1 超表達(dá)極顯著增加轉(zhuǎn)基因擬南芥的果莢長(zhǎng)度、寬度和種子重量，其中種子重量的增加幅度為61.2%～80.6%；而GmEXLA1 突變則顯著降低大豆的莢長(zhǎng)、粒長(zhǎng)、粒寬和粒重等性狀，其中粒長(zhǎng)、粒寬和粒重的降低幅度分別為13.5%、7.0%和25.6%，說(shuō)明GmEXLA1 在植物莢果發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。另外，分析不同大豆品種資源GmEXLA1 等位變異發(fā)現(xiàn)15個(gè)SNPs，其中位于上游的SNP（A/G）在野生大豆與栽培大豆中的分布頻率（A85% vs A38%；G15% vs G62%）存在極顯著差異。研究結(jié)果為通過(guò)生物育種手段改良大豆產(chǎn)量性狀提供了重要的擴(kuò)展蛋白基因。

關(guān)鍵詞：大豆；擴(kuò)展蛋白；細(xì)胞壁；莢果發(fā)育；等位變異

doi：10.13304/j.nykjdb.2024.0111

中圖分類號(hào)：S565.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：10080864（2025）03004911

大豆作為重要的糧食和油料作物，為全球提供1/2以上的食用油和1/4以上的植物蛋白[1]。然而，大豆由于籽粒油分和蛋白質(zhì)含量高、光呼吸高、營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)與生殖生長(zhǎng)并進(jìn)時(shí)間較長(zhǎng)、源庫(kù)關(guān)系復(fù)雜等特點(diǎn)，使得其單產(chǎn)水平與其他主要農(nóng)作物相比相對(duì)較低，亟需進(jìn)一步提高產(chǎn)量以滿足日益增長(zhǎng)的需求。

擴(kuò)展蛋白是一類通過(guò)松弛植物細(xì)胞壁使細(xì)胞得以擴(kuò)張的蛋白，被認(rèn)為是目前能夠在體外使熱失活的細(xì)胞壁恢復(fù)伸展的唯一一種細(xì)胞壁松弛蛋白，在植物生長(zhǎng)發(fā)育及抵御外界逆境脅迫中發(fā)揮重要功能[2-5]。根據(jù)序列同源性，可將擴(kuò)展蛋白分為α、β、LA和LB亞家族[67]。擴(kuò)展蛋白具有2個(gè)必需功能域，即催化功能域和結(jié)合功能域，以確保其能夠結(jié)合細(xì)胞壁并催化松弛細(xì)胞壁，進(jìn)而釋放胞內(nèi)壓力[8]。擴(kuò)展蛋白對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育具有重要意義，其不僅促進(jìn)根系生長(zhǎng)、節(jié)間伸長(zhǎng)和葉片生長(zhǎng)[9-11]，而且與種子萌發(fā)、葉柄脫落、花粉管伸長(zhǎng)、棉纖維發(fā)育、果實(shí)軟化成熟以及豆科植物結(jié)瘤固氮等過(guò)程有關(guān)[12-15]。擴(kuò)展蛋白還具有增大植物庫(kù)容量、增加籽粒大小和重量的作用，在提高植物產(chǎn)量方面具有較大潛力[16-18]。Sun等[16]發(fā)現(xiàn)，玉米擴(kuò)展蛋白基因ZmEXPB15 在珠心組織特異表達(dá)，并通過(guò)促進(jìn)珠心組織消除來(lái)增加玉米籽粒大小和重量。Calderini 等[17]發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)TaExpA6 可顯著增加小麥籽粒大小和重量，且不減少籽粒的數(shù)量，說(shuō)明該基因能夠協(xié)調(diào)籽粒大小和數(shù)量間的負(fù)相關(guān)，具有提高籽粒產(chǎn)量的潛能。

目前，有關(guān)大豆擴(kuò)展蛋白基因的研究主要集中在根系和根瘤生長(zhǎng)發(fā)育中。Guo 等[19]分析發(fā)現(xiàn)， GmEXPB2 基因超表達(dá)可影響轉(zhuǎn)基因擬南芥根系細(xì)胞伸長(zhǎng)，進(jìn)而促進(jìn)根系生長(zhǎng)和磷素吸收。Li等[15]分析GmEXPB2 在根瘤中的功能發(fā)現(xiàn)，該基因超表達(dá)可增加根瘤數(shù)量、重量以及固氮酶活性，進(jìn)而提高植株氮含量和生物重。Yang等[20]發(fā)現(xiàn)，β-亞家族擴(kuò)展蛋白基因GmINS1 可增加根瘤大小、侵染細(xì)胞數(shù)量、固氮酶活性以及植株氮含量和生物重。孫麗[21]研究表明，GmEXPA4 基因超表達(dá)可影響擬南芥的節(jié)間長(zhǎng)度以及葉片大小、長(zhǎng)度和數(shù)量。Lee等[22]發(fā)現(xiàn)，GmEXP1 基因主要在大豆初生根和次生根的根尖部位表達(dá)，超表達(dá)該基因可促進(jìn)轉(zhuǎn)基因煙草在酸性條件下的根系生長(zhǎng)。Kong等[23]發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)GmEXLB1 可增加擬南芥?zhèn)雀鶖?shù)量和長(zhǎng)度，改變根系構(gòu)型，進(jìn)而提高其磷素利用效率。目前，有關(guān)大豆擴(kuò)展蛋白基因在莢粒發(fā)育中的功能研究甚少，挖掘和利用大豆擴(kuò)展蛋白基因?qū)μ岣叽蠖箚萎a(chǎn)水平具有重要意義。

鑒于此，本研究前期從大豆莢果發(fā)育不同時(shí)期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中篩選出擴(kuò)展蛋白基因GmEXLA1（Glyma.11G096700），在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析GmEXLA1 時(shí)空表達(dá)、亞細(xì)胞定位以及其在超表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥和大豆突變體莢果發(fā)育中的功能，并且分析GmEXLA1 在不同類型大豆品種中的等位變異及其分布頻率，探討其與大豆籽粒大小和重量之間的關(guān)系，為進(jìn)一步提升大豆產(chǎn)量水平提供重要的功能基因。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試大豆優(yōu)異種質(zhì)C813（大莢、大粒）和擬南芥Columbia 生態(tài)型由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆遺傳育種課題組提供；大豆品種Williams82的gmexla1 突變體（提前終止類型）由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院宋慶鑫教授饋贈(zèng)[24]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 GmEXLA1 克隆 利用在線網(wǎng)站JustBio（https：//justbio.com/）設(shè)計(jì)擴(kuò)展蛋白基因GmEXLA1（Glyma.11G096700）開(kāi)放閱讀框引物（表1），利用C813 豆莢快速發(fā)育時(shí)期cDNA 為模板，擴(kuò)增GmEXLA1。擴(kuò)增體系為cDNA 1 μL，引物GmEXLA1-F和GmEXLA1-R 各1 μL，Prime STAR?Max 10 μL，ddH2O 7 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?8 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s，59 ℃ 10 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min，4 ℃保溫。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和DNA測(cè)序，獲得GmEXLA1 開(kāi)放閱讀框序列。

1.2.2 GmEXLA1 生信分析 利用SignalIP-5.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）分析擴(kuò)展蛋白GmEXLA1信號(hào)肽序列，利用InterPro（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/text/）分析GmEXLA1 保守結(jié)構(gòu)域，利用BioXM2.7.1 軟件對(duì)GmEXLA1 及其他物種的LA 亞家族擴(kuò)展蛋白進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.2.3 GmEXLA1亞細(xì)胞定位分析 利用SalⅠ和BamHⅠ酶切GmEXLA1 擴(kuò)增產(chǎn)物及表達(dá)載體pCamE：：GFP，回收目的片段，T4連接酶16 ℃連接16 h，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)構(gòu)建融合表達(dá)載體pCamE-GmEXLA1：：GFP；通過(guò)菌液PCR、酶切及DNA 測(cè)序驗(yàn)證陽(yáng)性克隆，并將其轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，菌液PCR鑒定陽(yáng)性克隆，轉(zhuǎn)化煙草葉片，經(jīng)質(zhì)壁分離，激光共聚焦顯微鏡（型號(hào)LSM 900 Airyscan2，卡爾蔡司管理有限公司，上海）下觀察綠色熒光。

1.2.4 GmEXLA1 轉(zhuǎn)化擬南芥 利用Sal Ⅰ 和BamHⅠ酶切GmEXLA1 擴(kuò)增產(chǎn)物與植物表達(dá)載體pCHAC，回收目的片段并利用T4 連接酶連接，轉(zhuǎn)化Top10 感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建超表達(dá)載體pCHACGmEXLA1；將載體轉(zhuǎn)化GV3101，通過(guò)菌液PCR鑒定陽(yáng)性克隆，加入50%甘油，-20 ℃保存。

種植擬南芥，待植株抽薹開(kāi)花，28 ℃活化含pCHAC-GmEXLA1 的農(nóng)桿菌陽(yáng)性克隆，加入100 mL含Kan（100 mg·mL-1）和Rif（100 mg·mL-1）的LB液體培養(yǎng)基，28 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)至OD600 為0.8～1.0；收集菌體，用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)5%蔗糖溶液和0.03% Silwet L-77 等體積重懸菌體，振蕩混勻放置30 min，蘸花法侵染擬南芥；將侵染后的擬南芥在黑暗、（23±1）℃、RH 60%～70%條件下培養(yǎng)1 d，隨后恢復(fù)光照培養(yǎng)（16 h 光照/8 h 黑暗），1周后重復(fù)侵染；待擬南芥種子成熟后收獲，4 ℃保存3～4 d，隨后通過(guò)潮霉素篩選、PCR擴(kuò)增、DNA測(cè)序等方法鑒定轉(zhuǎn)基因擬南芥，直至獲得T3純合株系。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥種子萌發(fā)速率測(cè)定 將轉(zhuǎn)基因擬南芥T3 株系和野生型種子分別裝入1.5 mL離心管，滅菌ddH2O清洗，75%乙醇消毒3～5 min，滅菌ddH2O清洗4～5遍；用1 mL槍頭將擬南芥種子種植在pH 4.5 的1/2 MS 培養(yǎng)基，置于光照培養(yǎng)室[（23±1）℃、RH 60%～70%、16 h 光照/8 h 黑暗]，隨后于不同時(shí)間調(diào)查萌發(fā)種子數(shù)量和萌發(fā)率。

1.2.6 轉(zhuǎn)GmEXLA1 擬南芥莢果相關(guān)性狀測(cè)定 分別種植轉(zhuǎn)基因擬南芥T3 代株系和野生型對(duì)照于光照培養(yǎng)室，每個(gè)材料至少保留20株，待植株生長(zhǎng)成熟，每個(gè)選取生長(zhǎng)整齊的15株，分別取其上部的成熟果莢30 個(gè)，利用良田高拍儀（型號(hào)S500A3B，深圳市新良田科技股份有限公司）進(jìn)行拍照，并利用萬(wàn)深自動(dòng)種子考種分析系統(tǒng)（型號(hào)SC-G，杭州萬(wàn)深檢測(cè)科技有限公司）測(cè)定其莢長(zhǎng)、莢寬等性狀。

1.2.7 大豆gmexla1 提前終止突變體分子鑒定 以從南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院引進(jìn)的大豆gmexla1 提前終止突變體[24] 為材料，將其與野生型對(duì)照Williams82分別種植在花盆內(nèi)，每盆2株；待植株長(zhǎng)出復(fù)葉，采用總RNA 提取試劑盒（Promega）提取葉片總RNA，全長(zhǎng)反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并利用已設(shè)計(jì)引物對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增（表1），擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和DNA測(cè)序確認(rèn)gmexla1 突變體的突變堿基。

待gmexla1 突變體與野生型對(duì)照開(kāi)花后，標(biāo)記開(kāi)花時(shí)間，并于開(kāi)花后15 d取豆莢樣品，提取RNA（Promega總RNA提取試劑盒），并利用實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄為cDNA；以大豆組成型表達(dá)基因GmActin11 為內(nèi)參，利用Bio-Rad CFX96 Real-Time System 對(duì)目的基因表達(dá)量進(jìn)行分析。qRT-PCR反應(yīng)體系：cDNA 0.5 μL，引物GmEXLA1-RT-F1和GmEXLA1-RT-R1各0.5 μL，TB Green Premix EX Taq Ⅱ 5 μL，ddH2O 3.5 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，56 ℃ 15 s，72 ℃20 s，39個(gè)循環(huán)；50 ℃ 2 min?；虮磉_(dá)量分析方法采用2-ΔΔCT法。

為進(jìn)一步確認(rèn)突變體中的終止密碼子，分別擴(kuò)增突變體與野生型的目的基因（表1），利用BamHⅠ和SacⅠ酶切目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物與原核表達(dá)載體pET-28a（+），回收目的片段并進(jìn)行連接，構(gòu)建pET-28a-GmEXLA1；將載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21，菌液PCR鑒定陽(yáng)性克??；加入含Kan（100 mg·mL-1）的液體LB培養(yǎng)基，37 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)3 h，取3 mL誘導(dǎo)前的菌液為對(duì)照，其余菌液加入5 μL的1 mol·L-1 IPTG，28 ℃、180 r·min-1誘導(dǎo)3 h；收集誘導(dǎo)后的菌體，以誘導(dǎo)前的菌體為對(duì)照，加入100 μL蛋白上樣緩沖液，100 ℃高溫變性10 min；利用SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，確認(rèn)密碼子的終止效果。

1.2.8 大豆豆莢和籽粒性狀測(cè)定 待大豆gmexla1 突變體及其野生型對(duì)照生長(zhǎng)至鼓粒盛期～初熟期（R6～R7期），分別測(cè)定其三粒莢、兩粒莢和一粒莢的莢長(zhǎng)和莢寬；待植株生長(zhǎng)成熟，收獲單株，測(cè)定其百粒重，并利用良田高拍儀對(duì)其籽粒進(jìn)行拍照，利用萬(wàn)深自動(dòng)種子考種分析系統(tǒng)測(cè)定其粒長(zhǎng)、粒寬等性狀。

1.2.9 GmEXLA1 等位變異分析方法及其對(duì)大豆籽粒和葉片大小的影響分析 基于課題組前期已有大豆品種資源重測(cè)序數(shù)據(jù)以及粒長(zhǎng)和粒寬等相關(guān)數(shù)據(jù)[25]，分析GmEXLA1 等位變異及其與籽粒大小的關(guān)系。同時(shí)，將上述品種資源于2023年6月份種植在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)作物育種中心試驗(yàn)基地（河北保定），并在開(kāi)花期測(cè)定其倒三葉的葉長(zhǎng)、葉寬等相關(guān)性狀，用于分析GmEXLA1 等位變異與葉片大小的關(guān)系，其中葉長(zhǎng)、葉寬等相關(guān)性狀的測(cè)定采用良田高拍儀拍照，并利用萬(wàn)深自動(dòng)分析系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.10 數(shù)據(jù)分析 利用Microsoft Excel 2016 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，利用GraphPad Prism8軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 擴(kuò)展蛋白GmEXLA1 序列與生物信息學(xué)分析

2.1.1 擴(kuò)展蛋白GmEXLA1 序列分析 利用C813豆莢快速發(fā)育時(shí)期cDNA為模板，擴(kuò)增擴(kuò)展蛋白基因GmEXLA1，經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，GmEXLA1 開(kāi)放讀碼框長(zhǎng)度為780 bp。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，GmEXLA1 位于大豆參考基因組Williams82（a4V1）11號(hào)染色體的7 365 314～7 369 267 bp，含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，編碼259個(gè)氨基酸，分子量為28 kD，分子式為C1245H1943N335O371S14，理論等電點(diǎn)為8.28。

2.1.2 擴(kuò)展蛋白GmEXLA1生物信息學(xué)分析 信號(hào)肽分析發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)展蛋白GmEXLA1第1～19位氨基酸為信號(hào)肽序列，預(yù)期切割位點(diǎn)在第19～20位氨基酸之間。進(jìn)一步分析GmEXLA1保守結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn)（圖1），與擬南芥、水稻和棉花等其他物種LA-亞家族擴(kuò)展蛋白序列存在一致性，含有擴(kuò)展蛋白發(fā)揮其功能所必需的2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，即催化功能域和結(jié)合功能域，其中催化區(qū)位于GmEXLA1的第40～144位氨基酸，結(jié)合區(qū)位于第147～240位氨基酸。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，含有該類蛋白發(fā)揮其作用功能所必需的2個(gè)保守性氨基酸殘基，即氨基端的半胱氨酸C和羧基端的色氨酸W，暗示擴(kuò)展蛋白GmEXLA1具有結(jié)合到植物細(xì)胞壁，并發(fā)揮其催化功能，進(jìn)而松弛細(xì)胞壁，釋放胞內(nèi)膨脹壓力使得細(xì)胞擴(kuò)張的功能。

2.2 擴(kuò)展蛋白GmEXLA1 亞細(xì)胞定位分析

利用在線工具預(yù)測(cè)GmEXLA1位于植物細(xì)胞壁；構(gòu)建其GFP融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化煙草葉片，經(jīng)質(zhì)壁分離和激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)其定位于細(xì)胞壁（圖2），與預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

2.3 GmEXLA1 在大豆不同組織部位和發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析

利用SoyBase 網(wǎng)站（https：//www.soybase.org/）公布的大豆轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析擴(kuò)展蛋白基因GmEXLA1 在不同組織以及發(fā)育時(shí)期的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該基因在大豆的根系、葉片和花、莢和種子均有表達(dá)，且以豆莢和種子的表達(dá)量高；該基因表達(dá)量隨大豆豆莢和籽粒生長(zhǎng)發(fā)育呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)，說(shuō)明其與大豆豆莢和籽粒生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)。

2.4 GmEXLA1 在擬南芥果莢發(fā)育中的功能分析

將GmEXLA1 整合至擬南芥基因組，利用qRT-PCR檢測(cè)2個(gè)純合株系GmEXLA1 表達(dá)量，均顯著高于野生型，說(shuō)明基因能夠正常表達(dá)，可用于功能鑒定。

2.4.1 GmEXLA1 在擬南芥種子萌發(fā)中的作用 分析2個(gè)超表達(dá)轉(zhuǎn)GmEXLA1 擬南芥純合株系的種子萌發(fā)情況發(fā)現(xiàn)（圖3），在同一萌發(fā)時(shí)間，轉(zhuǎn)基因擬南芥的萌發(fā)情況優(yōu)于野生型，且2個(gè)株系的萌發(fā)率較對(duì)照平均提高27.1%～35.6%，最高可提高39.4%～49.4%。與野生型對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥種子能夠在更短的時(shí)間內(nèi)萌發(fā)，2個(gè)株系萌發(fā)率達(dá)到85%的時(shí)間為87～103 h，而對(duì)照則超過(guò)119 h（圖3）。由此可見(jiàn)，由于擴(kuò)展蛋白基因GmEXLA1 具有松弛植物細(xì)胞壁的功能，因而使得超表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥種子在萌發(fā)過(guò)程中能夠更快地突破種皮，加快了其萌發(fā)速率。

2.4.2 轉(zhuǎn)GmEXLA1 擬南芥莢果與種子重量分析 分析發(fā)現(xiàn)，超表達(dá)轉(zhuǎn)GmEXLA1 擬南芥純合株系的莢果長(zhǎng)度和寬度均顯著高于野生型對(duì)照（圖4），說(shuō)明GmEXLA1 具有促進(jìn)轉(zhuǎn)基因擬南芥莢果生長(zhǎng)發(fā)育的功能。同時(shí)，超表達(dá)轉(zhuǎn)GmEXLA1 擬南芥單株種子重量亦顯著高于野生型對(duì)照，且較野生型對(duì)照種子重量增加的幅度達(dá)到61.2%～80.6%（圖4），說(shuō)明GmEXLA1 具有提高轉(zhuǎn)基因擬南芥單株種子重量的功能。

2.5 GmEXLA1 在大豆莢粒發(fā)育中的功能分析

2.5.1 大豆gmexla1 突變體的分子鑒定 對(duì)野生型大豆Williams82及其gmexla1 突變體進(jìn)行擴(kuò)增（圖5A）和DNA 測(cè)序（圖5B），發(fā)現(xiàn)突變體的gmexla1 在第430個(gè)核苷酸位置發(fā)生C/T變異，使得三聯(lián)體密碼子發(fā)生CAG/TAG變異，導(dǎo)致突變體的gmexla1 提前終止；利用qRT-PCR 技術(shù)檢測(cè)野生型Williams82及其gmexla1 突變體的基因表達(dá)量，結(jié)果（圖5C）發(fā)現(xiàn)，突變體豆莢中的gmexla1 表達(dá)量低于野生型對(duì)照。

進(jìn)一步克隆野生型大豆Williams82及其突變體的gmexla1 序列（去除信號(hào)肽序列），并連接原核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，誘導(dǎo)基因原核表達(dá)，結(jié)果（圖5D）發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)后的野生型Williams82 的GmEXLA1 目的條帶為32 kD 左右（去除信號(hào)肽，另加His標(biāo)簽后的條帶），與預(yù)期大小一致，而突變體的gmexla1 由于提前終止故而分子量變小，目的條帶大小在19 kD左右（去除信號(hào)肽，另加His標(biāo)簽后的條帶），充分證實(shí)了該終止密碼子在蛋白翻譯水平的有效性。

在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析該突變體終止密碼子的突變位置，結(jié)果（圖5E）發(fā)現(xiàn)，其位于擴(kuò)展蛋白GmEXLA1的結(jié)合區(qū)前面，使得突變后的gmexla1丟失了與細(xì)胞壁進(jìn)行結(jié)合的保守域。由于結(jié)合保守域是擴(kuò)展蛋白發(fā)揮其催化功能的前提，因而該突變體的gmexla1 提前終止導(dǎo)致基因功能完全喪失。

2.5.2 大豆gmexla1 突變體莢粒性狀分析 分析大豆gmexla1 突變體的莢粒相關(guān)性狀（圖6）發(fā)現(xiàn)，三粒莢和兩粒莢的莢長(zhǎng)均較野生型對(duì)照顯著降低，其中三粒莢的莢長(zhǎng)平均顯著降低0.36 cm，兩粒莢的莢長(zhǎng)平均顯著降低0.35 cm，說(shuō)明gmexla1功能的缺失嚴(yán)重影響大豆的豆莢生長(zhǎng)發(fā)育。同時(shí)發(fā)現(xiàn)（圖7），gmexla1 突變體的籽粒長(zhǎng)度和寬度亦顯著低于野生型對(duì)照，其籽粒長(zhǎng)度顯著下降13.5%，籽粒寬度顯著下降7.0%；gmexla1 突變體的百粒重（17.5 g）亦較野生型對(duì)照（23.5 g）顯著下降25.6%（圖7），折合百粒重6.0 g，說(shuō)明GmEXLA1 突變顯著降低大豆籽粒大小和重量。

2.6 擴(kuò)展蛋白GmEXLA1 等位變異分析

基于課題組前期已有大豆品種資源重測(cè)序數(shù)據(jù)[25]分析GmEXLA1 全長(zhǎng)序列存在的SNP 等位變異（圖8A）發(fā)現(xiàn)，共有15個(gè)SNPs，1個(gè)SNP位于基因上游，12 個(gè)位于基因3’UTR，2 個(gè)位于基因下游。進(jìn)一步利用上述15個(gè)SNPs分析重測(cè)序大豆品種資源相關(guān)性狀，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，位于該基因上游啟動(dòng)子區(qū)（-854 bp）的SNP（A/G）可將供試品種資源分為2種類型，且2種類型間的籽粒長(zhǎng)度（圖8B）、葉片長(zhǎng)度（圖8C）、葉片重量（圖8D）和葉面積（圖8E）等性狀存在顯著或極顯著差異，暗示該SNP與大豆籽粒大小和葉片大小有關(guān)。

隨后，進(jìn)一步利用SoyBase網(wǎng)站公布的1 556份大豆品種資源的重測(cè)序數(shù)據(jù)[26]分析GmEXLA1上游啟動(dòng)子區(qū)該SNP（A/G）在大豆品種中的具體分布，結(jié)果（圖8F）發(fā)現(xiàn)，有173份野生大豆屬于AA型，而30份屬于GG型；有572份栽培大豆屬于GG型，而350份屬于AA型。通過(guò)計(jì)算該SNP等位變異（A/G）分布頻率發(fā)現(xiàn)，野生大豆的AA類型占比為85%，GG類型占比為15%，而栽培大豆中的AA類型占比為38%，GG類型占比為62%，且差異達(dá)到極顯著。由此可見(jiàn)，GmEXLA1 上游SNP（A/G）的分布頻率在野生大豆與栽培大豆之間存在較大差異。

3 討論

目前，有關(guān)擴(kuò)展蛋白α和β亞家族的報(bào)道較多[27-29]，而關(guān)于LA和LB亞家族的研究較少[30]。本研究利用課題組前期篩選的大豆LA亞家族擴(kuò)展蛋白基因GmEXLA1 為研究對(duì)象，通過(guò)分析其保守結(jié)構(gòu)域和亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，具有擴(kuò)展蛋白發(fā)揮功能所必需的2個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，且定位于細(xì)胞壁；隨后，通過(guò)分析轉(zhuǎn)GmEXLA1 擬南芥種子萌發(fā)速度，初步認(rèn)為其具有松弛細(xì)胞壁使細(xì)胞得以擴(kuò)張的功能；在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用超表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥證實(shí)了GmEXLA1 可促進(jìn)莢果和種子發(fā)育進(jìn)而提高種子重量，并利用該基因的大豆突變體證實(shí)了其在莢果和籽粒發(fā)育中的功能，為今后利用該基因改良大豆產(chǎn)量相關(guān)性狀提供了依據(jù)。

突變體是驗(yàn)證基因功能的重要材料，根據(jù)基因突變位置不同可分為外顯子突變、內(nèi)含子突變、啟動(dòng)子突變以及基因下游突變等；同時(shí)，根據(jù)基因突變類型不同可分為同義突變、非同義突變、無(wú)義突變、移碼突變、非移碼突變等。在眾多的基因突變類型中，無(wú)義突變因引起的遺傳效應(yīng)大而被認(rèn)為是驗(yàn)證基因功能的良好材料。Wang等[31]利用全基因組關(guān)聯(lián)分析方法獲得控制大豆綠色種皮顏色的G 基因，該基因存在1個(gè)G/A變異，使得突變后的g 基因提前終止，進(jìn)而由于缺少最后1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)е麓蠖狗N皮顏色由綠變黃。Yong 等[32]研究大豆裂莢基因Pdh1 發(fā)現(xiàn)，該基因的功能缺失型突變直接影響大豆的裂莢特性，且該基因的1個(gè)無(wú)義突變?cè)谝吧蠖柜Z化為栽培大豆的過(guò)程中受到選擇。

2022 年，Zhang 等[24]利用EMS 誘變技術(shù)獲得了千余個(gè)大豆突變體材料，并通過(guò)重測(cè)序技術(shù)分析了這些材料的基因突變位置，為大豆分子生物學(xué)研究搭建了重要平臺(tái)。本研究分析Zhang等[24]通過(guò)EMS誘變獲得的GmEXLA1 突變體材料發(fā)現(xiàn)1個(gè)無(wú)義突變體材料，該材料的第430個(gè)核苷酸發(fā)生C→T變異，導(dǎo)致CAG變?yōu)榻K止密碼子TAG，且該無(wú)義突變發(fā)生的位置位于該擴(kuò)展蛋白基因的結(jié)合功能域前面，使突變的gmexla1 失去了結(jié)合功能域，因而無(wú)法結(jié)合到植物細(xì)胞壁從而導(dǎo)致其催化功能全部喪失。為進(jìn)一步確認(rèn)上述無(wú)義突變是否有效，本研究分別利用PCR、DNA 測(cè)序、qRTPCR和原核表達(dá)等方法，從DNA、RNA和蛋白水平證實(shí)了該無(wú)義突變真實(shí)存在且突變有效，為利用該突變體驗(yàn)證GmEXLA1 在大豆中的生物學(xué)功能提供了堅(jiān)實(shí)可靠的依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

［1］ SHEN Y T， LIU J， GENG H Y， et al .. De novo assembly of a

Chinese soybean genome [J]. Sci. China Life Sci.， 2018， 61：

871-884.

［2］ MCQUEEN-MASON S， DURACHKO D M， COSGROVE D J.

Two endogenous proteins that induce cell wall extension in

plants [J]. Plant Cell， 1992， 4（11）： 1425-1433.

［3］ KOK B ?， ALTUNOGLU Y C， ?NCüL A B， et al .. Expansin

gene family database： a comprehensive bioinformatics resource

for plant expansin multigene family [J/OL]. J. Bioinf. Comput.

Biol.， 2023， 21（3）： 2350015 [2024-03-13]. https：//doi.org/

10.1142/S0219720023500154.

［4］ HAN Z S， LIU Y L， DENG X， et al .. Genome-wide

identification and expression analysis of expansin gene family

in common wheat （Triticum aestivum L.） [J/OL]. BMC

Genomics， 2019， 20： 101 [2024-03-13]. https：//doi.org/10.1186/

s12864-019-5455-1.

［5］ PARK S， LI F F， RENAUD J， et al .. NbEXPA1， an

α-expansin， is plasmodesmata-specific and a novel host factor

for potyviral infection [J]. Plant J.， 2017， 92： 846-861.

［6］ HEPLER N K， BOWMAN A， CAREY R E， et al .. Expansin

gene loss is a common occurrence during adaptation to an

aquatic environment [J]. Plant J.， 2020， 101： 666-680.

［7］ 蔡兆琴，龍婷晞，肖冬，等.甘薯擴(kuò)展蛋白IbEXPA2 基因克隆

和表達(dá)分析[J].分子植物育種，2023， 21（5）： 1401-1407.

CAI Z Q， LONG T X， XIAO D， et al .. Cloning and expression

analysis of IbEXPA2 from sweet potato [J]. Mol. Plant

Breeding， 2023， 21（5）： 1401-1407.

［8］ LIU X P， DONG S Y， MIAO H， et al .. Genome-wide analysis of

expansins and their role in fruit spine development in

cucumber （Cucumis sativus L.） [J]. Hortic. Plant J.， 2022， 8（6）：

757-768.

［9］ BEREZHNEVA Z A， MUSIN K G， KULUEV B R. Root growth

of transgenic tobacco plants with overexpression of expansin

and xyloglucan endotransglycosylase genes under cadmium

stress [J/OL]. Russ. J. Plant Physiol.， 2022， 69： 96 [2024-03-

10]. https：//doi.org/10.1134/S102144372205003X.

［10］ 朱益民. 桂花OfSVP 和擴(kuò)張蛋白基因在開(kāi)花過(guò)程中的作

用[D].杭州：浙江農(nóng)林大學(xué)，2019.

ZHU Y M. The role of OfSVP transcription factors and dilated

proteins in Osmanthus fragrans flowering [D]. Hangzhou： Zhejiang

Aamp;F University， 2019.

［11］ 鄒寒艷.水稻OsLIR1 維持葉綠體功能的機(jī)制及OsEXPB2 參

與水稻根系發(fā)育的功能研究[D].重慶：重慶大學(xué)，2015.

ZOU H Y. Study on mechanisms of OsLIR1 maintaining

chloroplast function and roles of OsEXPB2 in root development

in rice （Oryza sativa） [D]. Chongqing： Chongqing University，

2015.

［12］ YAQOOB A， BASHIR S， RAO A Q， et al .. Transformation of

α-EXPA1 gene leads to an improved fibre quality in Gossypium

hirsutum [J]. Plant Breeding， 2020， 139： 1213-1220.

［13］ 趙灣灣，馮力，胡紹彬，等.番木瓜果實(shí)軟化相關(guān)CpEXPA2 基

因的克隆與表達(dá)分析[J].果樹(shù)學(xué)報(bào)，2018， 35（7）：785-793.

ZHAO W W， FENG L， HU S B， et al .. Cloning and expression

analysis of CpEXPA2 gene related to softening of papaya fruit [J]. J.

Fruit Sci.， 2018， 35（7）： 785-793.

［14］ 廖嘉明，包鈺韜，陳媛，等.黃梁木NcEXPA8 基因提高擬南芥

種子萌發(fā)速度的研究[J].廣西植物， 2021， 41（4）： 654-661.

LIAO J M， BAO Y T， CHEN Y， et al .. Enhancement of

Arabidopsis thaliana seed germination speed by NcEXPA8 gene

of Neolamarckia cadamba [J]. Guihaia， 2021， 41（4）： 654-661.

［15］ LI X X， ZHAO J， TAN Z Y， et al .. GmEXPB2， a cell wall

β-expansin gene， affects soybean nodulation through modifying

root architecture and promoting nodule formation and

development [J]. Plant Physiol.， 2015， 169（4）： 2640-2653.

［16］ SUN Q， LI Y F， GONG D M， et al .. A NAC-EXPANSIN

module enhances maize kernel size by controlling nucellus

elimination [J/OL]. Nat. Commun.， 2022， 13： 5708 [2024-03-

13]. https：//doi.org/10.1038/s41467-022-33513-4.

［17］ CALDERINI D F， CASTILLO F M， ARENAS-M A， et al ..

Overcoming the trade-off between grain weight and number in

wheat by the ectopic expression of expansin in developing

seeds leads to increased yield potential [J]. New Phytol.， 2021，

230： 629-640.

［18］ MAROWA P， DING A M， KONG Y Z. Expansins： roles in

plant growth and potential applications in crop improvement [J].

Plant Cell Rep.， 2016， 35： 949-965.

［19］ GUO W B， ZHAO J， LI X X， et al .. A soybean β-expansin gene

GmEXPB2 intrinsically involved in root system architecture

responses to abiotic stresses [J]. Plant J.， 2011， 66： 541-552.

［20］ YANG Z J， ZHENG J K， ZHOU H W， et al .. The soybean

β-expansin gene GmINS1 contributes to nodule development

in response to phosphate starvation [J]. Physiol. Plant， 2021，

172（4）： 2034-2047.

［21］ 孫麗. 大豆膨脹素GmEXPA4 基因轉(zhuǎn)化擬南芥及功能驗(yàn)

證[D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

SUN L. The soybean expansion GmEXPA4 gene transformed

Arabidopsis thaliana and functional verification [D]. Harbin：

Northeast Agricultural University， 2013.

［22］ LEE D， AHN J H， SONG S， et al .. Expression of an expansin

gene is correlated with root elongation in soybean [J]. Plant

Physiol.， 2003， 131： 985-997.

［23］ KONG Y B， WANG B， DU H， et al .. GmEXLB1， a soybean

expansin-like B gene， alters root architecture to improve

phosphorus acquisition in Arabidopsis [J/OL]. Front. Plant Sci.，

2019， 10： 808 [2024-03-13]. https：//doi.org/10.3389/fpls.2019.

00808.

［24］ ZHANG M Z， ZHANG X Y， JIANG X Y， et al .. iSoybean： a

database for the mutational fingerprints of soybean [J]. Plant

Biotechnol. J.， 2022， 20： 1435-1437.

［25］ SHAO Z Q， SHAO J B， HUO X B， et al .. Identifcation of

closely associated SNPs and candidate genes with seed size

and shape via deep re-sequencing GWAS in soybean [J].

Theor. Appl. Genet.， 2022， 135： 2341-2351.

［26］ ZHANG H Y， JIANG H， HU Z B， et al.. Development of a

versatile resource for post-genomic research through consolidating

and characterizing 1500 diverse wild and cultivated soybean

genomes [J/OL]. BMC Genomics， 2022， 23（1）： 250 [2024-03-13].

https：//doi.org/10.1186/s12864-022-08326-w.

［27］ CHEN Y H， REN Y Q， ZHANG G Q， et al .. Overexpression of

the wheat expansin gene TaEXPA2 improves oxidative stress

tolerance in transgenic Arabidopsis plants [J]. Plant Physiol.

Biochem.， 2018， 124： 190-198.

［28］ REN Y Q， CHEN Y H， AN J， et al .. Wheat expansin gene

TaEXPA2 is involved in conferring plant tolerance to Cd

toxicity [J]. Plant Sci.， 2018， 270： 245-256.

［29］ 丁安明，陳志華，楊懿德，等. NtabEXPA12 基因過(guò)表達(dá)對(duì)煙草

葉片發(fā)育及抗逆性的影響[J]. 中國(guó)煙草科學(xué)，2021，42（4）：

58-66.

DING A M， CHEN Z H， YANG Y D， et al .. Overexpression of

NtabEXPA12 affects leaf development and abiotic stress

tolerance in tobacco [J]. Chin. Tobacco Sci.， 2021，42（4）： 58-66.

［30］ KRISHNAMURTHY P， MUTHUSAMY M， KIM J A， et al ..

Brassica rapa expansin-like B1 gene （BrEXLB1） regulate

growth and development in transgenic Arabidopsis and elicits

response to abiotic stresses [J]. J. Plant Biochem. Biot.， 2019，

28（4）： 437-446.

［31］ WANG M， LI W Z， FANG C， et al .. Parallel selection on a

dormancy gene during domestication of crops from multiple

families [J]. Nat. Genet.， 2018， 50： 1435-1441.

［32］ YONG B， ZHU W W， WEI S M， et al .. Parallel selection of

loss-of-function alleles of Pdh1 orthologous genes in warmseason

legumes for pod indehiscence and plasticity is related

to precipitation [J]. New Phytol.， 2023， 240（2）： 863-879.