一株花生根瘤菌高效菌株的篩選及其在原生環(huán)境中的應(yīng)用

摘 要：本研究從湖南省7個(gè)主要花生種植區(qū)采集的新鮮花生根瘤進(jìn)行根瘤菌分離、純化，共獲得7株根瘤菌菌株。分別以湖南地方花生品種安化小籽花生、常寧小籽花生為測(cè)試品種，通過(guò)溫室盆栽接種試驗(yàn)進(jìn)行篩選，7株根瘤菌均能在兩個(gè)花生品種上有效結(jié)瘤，其中R3-2、R4-6固氮能力最強(qiáng)。通過(guò)16S rDNA基因測(cè)序及序列比對(duì)，初步鑒定菌株R3-2屬于日本慢生根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）。室內(nèi)耐酸試驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株R3-2具有一定的耐酸性能，在pH為 5.4 （含pHgt;5.4 ）的改良的Keyser和Munns培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，且具有一定的重金屬耐受性。在原生環(huán)境中進(jìn)行的田間小區(qū)試驗(yàn)結(jié)果表明，70%常規(guī)施氮量并接種R3-2根瘤菌的處理組花生生長(zhǎng)最佳，產(chǎn)量比對(duì)照組（常規(guī)施氮無(wú)接種根瘤菌）提高28.54%。菌株R3-2在固氮的同時(shí)具有一定的抵抗土壤中氫離子和重金屬脅迫的能力，為我國(guó)南方花生栽培應(yīng)用根瘤菌提供了一種新的選擇。

關(guān)鍵詞：花生；日本慢生根瘤菌；耐酸；產(chǎn)量；生物固氮

中圖分類(lèi)號(hào)：Q939.36" " " " " " " " " " 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A" " " " " " " " DOI：10.3969/j.issn.1007-7146.2025.01.006

Abstract： In this study， fresh peanut nodules were collected from seven major peanut growing areas in Hunan Province， and a total of 7 rhizobia strains were isolated and purified. The local peanut varieties Anhua small-seeded peanut and Changning small-seeded peanut varieties in Hunan Province were selected to test the capability of the 7 rhizobia strains by greenhouse pot inoculation experiments， and all 7 rhizobia strains could effectively form nodulation on the two peanut varieties， among which R3-2 and R4-6 showed the strongest nitrogen-fixing capability. Through 16S rDNA gene sequencing and sequence alignment， strain R3-2 was preliminarily identified as belonging to Bradyrhizobium japonicum. Further experiments demonstrated that the strain R3-2 had certain acid resistance and it grew well in modified Keyser and Munns medium while the pH is equal to 5.4 （including pHgt;5.4）， and holding a certain tolerance to heavy metals. Finally， field experiments were carried out in the native environment of R3-2， and the results showed that peanut yield of the treatment group with 70% conventional nitrogen application and R3-2 rhizobia inoculation was the highest， which was 28.54% higher than that of the control group which is with conventional nitrogen application without rhizobia inoculation. With the fine effect on nitrogen fixation， as well as its positive tolerances on hydrogen ion and heavy metals， strain R3-2 is the potential rhizobium utilized in peanut cultivation in southern China.

花生（Arachis hypogaea L.）是豆科一年生草本植物，我國(guó)三大傳統(tǒng)油料作物之一［1］。同時(shí)，花生也是全球繼大豆（Glycine max L.）、油菜（Brassica campestris L.）、向日葵（Helianthus annuus L.）之后的第四大食用油來(lái)源，第三大植物蛋白來(lái)源，花生仁平均含油45%～51%、蛋白質(zhì)25%、碳水化合物24.2% ［2］。氮是農(nóng)作物生長(zhǎng)必需的三大元素之一，化學(xué)氮肥的施用為農(nóng)業(yè)增產(chǎn)作出了巨大貢獻(xiàn)，但長(zhǎng)期施用氮肥導(dǎo)致農(nóng)田土壤出現(xiàn)酸化、板結(jié)等問(wèn)題，影響農(nóng)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展［3］。生物固氮是利用微生物自身固氮或微生物與植物共生固氮的模式將空氣中的氮?dú)廪D(zhuǎn)化為植物可吸收的氮素形式，其中尤其以豆科植物和豆科根瘤菌的共生固氮效率最高［4］。花生屬于豆科植物，花生與花生根瘤菌通過(guò)形成根瘤來(lái)固定空氣中的氮?dú)猓瑸榛ㄉL(zhǎng)提供必需的氮素營(yíng)養(yǎng)［5］。花生-根瘤菌共生固氮體系可以滿足花生生長(zhǎng)所需氮量的50%左右，同時(shí)還可以改善土壤肥力，提高花生的產(chǎn)量和品質(zhì)［6］。Shang等［7］證明，花生接種慢生根瘤菌（Bradyrhizobium）后顯著改變了其根際微生物群落結(jié)構(gòu)組成，增加了潛在有益微生物的相對(duì)豐度，改變了根際細(xì)菌的共生網(wǎng)絡(luò)。

20世紀(jì)50年代開(kāi)始，我國(guó)北方花生主產(chǎn)區(qū)開(kāi)展了一系列花生高產(chǎn)栽培技術(shù)研究，包括高產(chǎn)品種選育、花生根瘤菌接種、科學(xué)施肥、拌種、起壟等高產(chǎn)種植管理技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了花生的高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)［5］。其中，1956—1985年，花生根瘤菌的研究和應(yīng)用取得重大進(jìn)展，接種根瘤菌后平均每畝花生增產(chǎn)23.6 kg，增產(chǎn)率為13.4%［8］，在北方主產(chǎn)區(qū)獲得廣泛應(yīng)用。但是，豆科作物固氮效率在不同品種和不同菌系間差異很大。鄭永美等［9］利用同位素15N示蹤技術(shù)，探究了19個(gè)花生品種的根瘤固氮效率，發(fā)現(xiàn)不同花生品種的根瘤結(jié)瘤數(shù)和固氮量等存在顯著差異。豆科作物生物固氮效率是作物品種、菌系及品種與菌系互作的結(jié)果［10］，同時(shí)還受一系列外在因素如土壤氮素含量、酸堿度、水分、鉀肥、溫度、土壤類(lèi)型、種植年限、種植方式（混播或單播）、土著根瘤菌系及其數(shù)量、菌劑接種技術(shù)措施等因素的影響［11］。熊煥燁［12］比較了遼寧省主栽的普通結(jié)瘤特性的花生品種農(nóng)花5號(hào)（NH5）和高效結(jié)瘤特性花生品種紅花16號(hào)（HH16）不同施氮量時(shí)接種根瘤菌的效果，施氮量為105 kg/hm2時(shí)效果顯著，過(guò)量施用氮肥（gt;135 kg/hm2）會(huì)抑制花生的生長(zhǎng)。Zhao等［13］調(diào)查了酸性土壤對(duì)花生-慢生根瘤菌共生相互作用和根瘤的碳、氮代謝的影響，發(fā)現(xiàn)魯花11號(hào)和贛花5號(hào)在pH為5.0的土壤生長(zhǎng)時(shí)，其生產(chǎn)性能、根瘤數(shù)、根瘤干重以及地上部和根部的氮含量均較低。El-Sherbeny等［14］研究表明，根瘤菌的施用策略對(duì)其增產(chǎn)效果影響較大，前茬花生秸稈還田配合接種慢生根瘤菌后增產(chǎn)效果最佳。Shao等［15］發(fā)現(xiàn)，花生長(zhǎng)期連作降低了根瘤菌種群的多樣性，優(yōu)勢(shì)根瘤菌遼寧慢生根瘤菌（B. liaoningense）和渥太華慢生根瘤菌（B. ottawaense）得到了顯著富集。

研究表明，豆科根瘤菌的生長(zhǎng)和結(jié)瘤對(duì)生存環(huán)境要求較高，通常情況下根瘤菌在中性或中堿性的土壤中結(jié)瘤固氮效果最好，而在酸性土壤中固氮結(jié)瘤效果較差［16］。中國(guó)南方花生主要種植于丘陵紅壤、黃壤，大部分土壤瘠薄，屬酸性甚至強(qiáng)酸性（pH 4.5～5.5）土壤，地力普遍偏低［17］，北方主產(chǎn)區(qū)篩選的花生根瘤菌在南方不具有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。湖南省花生種植區(qū)的土壤主要為酸性土壤，且生產(chǎn)上習(xí)慣種植的花生品種大多為具有地方特色和地域優(yōu)勢(shì)的地方品種，如安化小籽花生［18］、常寧小籽花生等［19］。從湖南本土的花生品種和酸性土壤環(huán)境下分離的自然結(jié)瘤的野生根瘤菌資源，再應(yīng)用到其原生環(huán)境中，比其他地域分離的根瘤菌具有更好的環(huán)境適應(yīng)性和更高的定殖結(jié)瘤率及固氮效率［20］。因此，本研究嘗試從湖南省本土主要花生種植區(qū)采集的新鮮花生根瘤進(jìn)行根瘤菌分離，通過(guò)室內(nèi)盆栽試驗(yàn)和田間試驗(yàn)篩選出適宜我省土壤環(huán)境和本地品種的高效花生固氮菌株，為花生根瘤菌劑的開(kāi)發(fā)提供菌種資源，實(shí)現(xiàn)化肥減量和農(nóng)業(yè)增效。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

7株花生根瘤菌為本課題組自湖南省宜章、資興、常寧、湘鄉(xiāng)、漣源、永順、安化等地花生新鮮根瘤中分離，分別是R1-3、R3-2、R4-6、R7、R8-3、R9-7-1、R9-7-2，置于20%甘油凍存管中-80℃保存。

1.2 供試花生品種

盆栽試驗(yàn)選用安化小籽紅皮花生（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準(zhǔn)的農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志品種）和常寧小籽紅皮花生，田間小區(qū)試驗(yàn)采用資興本地小籽花生。

1.3 培養(yǎng)基

花生根瘤菌的培養(yǎng)和分離純化采用酵母甘露醇瓊脂（yeast mannitol agar，YMA）培養(yǎng)基，各菌株培養(yǎng)液采用酵母甘露醇（yeast mannitol，YM）培養(yǎng)基，YMA中加溴麝香草酚藍(lán)（bromothymol blue，BTB）檢查細(xì)菌生長(zhǎng)時(shí)的產(chǎn)酸或產(chǎn)堿反應(yīng)，花生溫室栽培采用液體微氮培養(yǎng)液，上述所有培養(yǎng)基配制方法均參照文獻(xiàn)［21］。

菌株耐酸性評(píng)估采用Graham等［22］改良的Keyser和Munns培養(yǎng)基，115℃蒸汽高壓滅菌15 min，冷卻至52℃，分別調(diào)節(jié)pH值為 5.0、5.4、6.0、6.5、7.0，倒入平板，冷卻至28℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 花生高效共生固氮菌株室內(nèi)盆栽篩選

選擇東北某公司花生根瘤菌產(chǎn)品中分離的菌株R6作為對(duì)照菌株，與上述7株供試菌株組成盆栽試驗(yàn)菌株，同時(shí)設(shè)置不接種根瘤菌的空白，共9個(gè)處理，每處理3個(gè)重復(fù)，共27盆，隨機(jī)排列。

選飽滿、新鮮、無(wú)破損的花生種子，表面消毒后放入墊有濾紙并加無(wú)菌水潤(rùn)濕的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，25℃培養(yǎng)箱內(nèi)萌發(fā)。待種子主根2 cm長(zhǎng)時(shí)，在預(yù)先制備的OD600（600 nm波長(zhǎng)處的光密度值）為0.6～1.0根瘤菌YM培養(yǎng)液中浸泡30 min，每苗1 mL根瘤菌培養(yǎng)液，浸泡完成后幼苗轉(zhuǎn)移到盛有滅菌蛭石和微氮培養(yǎng)液的組培盆（80 mm×95 mm）。對(duì)照用滅菌的YM培養(yǎng)液。每處理3個(gè)重復(fù)。組培盆外覆隔光膜，溫室放置15～28℃，采用全光譜植物生長(zhǎng)光源，光照時(shí)間16 h/d。培養(yǎng)45 d收獲，測(cè)量并統(tǒng)計(jì)花生總結(jié)瘤數(shù)、植株的地上部分干重。

1.5 菌種鑒定

1.5.1 形態(tài)觀察和生化特征分析

按細(xì)菌鑒定手冊(cè)，對(duì)根瘤菌進(jìn)行革蘭氏染色確定其革蘭氏屬性，然后在光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形狀和大??；同時(shí)在YMA培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d，觀察菌落形態(tài)特征。

在添加BTB的YMA培養(yǎng)基中觀察根瘤菌的產(chǎn)酸產(chǎn)堿屬性，通過(guò)盆栽進(jìn)行花生的回結(jié)瘤試驗(yàn)［23］，檢驗(yàn)這些菌株與花生共生結(jié)瘤的能力。

1.5.2 分子鑒定

提取根瘤菌基因組DNA，利用引物27F/1492R 進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增，采用DNA膠回收試劑盒，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳回收目標(biāo)DNA片段［20］，送湖南擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序。所測(cè)序列經(jīng)校對(duì)、拼接后與NCBI（National Center for Biotechnology Information）GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)種屬的序列進(jìn)行BLAST比較。利用軟件MEGA 11.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，采用自舉法（Bootstrap）評(píng)估分支可信度，Bootstrap取樣值大于1 000［21］。

1.6 根瘤菌R3-2菌株耐酸性室內(nèi)評(píng)估

采用室內(nèi)評(píng)估法對(duì)根瘤菌的pH耐受性進(jìn)行初步評(píng)估。將菌株在YM培養(yǎng)液中28℃、150 r/min培養(yǎng)5 d，發(fā)酵液采用無(wú)菌水進(jìn)行稀釋?zhuān)辆簼舛葹?～4 CFU/μL。取25 μL上述稀釋菌液涂布在不同pH值的耐酸培養(yǎng)皿上，每處理5個(gè)重復(fù)。28℃培養(yǎng)7 d，觀察菌株生長(zhǎng)情況。

1.7 根瘤菌R3-2菌株對(duì)多種重金屬的抗性測(cè)定

將根瘤菌在YM培養(yǎng)液中28℃、150 r/min培養(yǎng)5～7 d，取100 μL培養(yǎng)液涂布于含不同濃度K2Cr2O7、CdCl2、ZnSO4?7H2O、MnSO4?H2O、CuSO4?5H2O、Pb（NO3）2 和CoCl3 的YMA培養(yǎng)基上，以不添加任何重金屬的YMA平板為對(duì)照，每處理3個(gè)重復(fù)，28℃培養(yǎng)5～7 d［24］。根據(jù)平板上根瘤菌有無(wú)生長(zhǎng)來(lái)評(píng)估各金屬的最低抑制濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。

1.8 田間小區(qū)試驗(yàn)

試驗(yàn)在湖南省資興市州門(mén)司鎮(zhèn)燕窩村前臺(tái)組進(jìn)行，土壤為細(xì)沙壤土，pH為5.1，有機(jī)質(zhì)為44 g/kg，全氮為2.06 g/kg，堿解氮為153.6 mg/kg，有效磷為14.7 mg/kg，緩效鉀為544 mg/kg，速效鉀為29 mg/kg。供試菌株是根瘤菌R3-2和對(duì)照菌株R6。試驗(yàn)設(shè)7個(gè)處理，每處理3個(gè)重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列，小區(qū)面積20 m2，共21個(gè)小區(qū)，總面積420 m2。處理1：Con（常規(guī)施肥量施肥）；處理2：50%NR3（常規(guī)施肥量的50%施肥，根瘤菌R3拌種）；處理3：50%NR6（常規(guī)施肥量的50%施肥，根瘤菌R6拌種）；處理4：70%R3（常規(guī)施肥量的70%施肥，根瘤菌R3拌種）；處理5：70%NR6（常規(guī)施肥量的70%施肥，根瘤菌R6拌種）；處理6：100%NR3（常規(guī)施肥量施肥，根瘤菌R3拌種）；處理7：100%NR6（常規(guī)施肥量施肥，根瘤菌R6拌種）。常規(guī)施肥量的N、P、K用量水平一致，分別按N、P2O5、K2O計(jì)算含量為15%－15%－15%，總施用量按375 kg/hm2進(jìn)行。同時(shí)，田土翻耕前按750 kg/hm2標(biāo)準(zhǔn)施用鈣鎂磷肥。2022年4月22日播種，點(diǎn)播，穴間距20～25 cm，每穴3粒，出苗后間苗，每穴定苗2株。播種前用菌劑拌種，根瘤菌水劑用量每畝100 mL，菌數(shù)2×108 CFU/mL，先將菌劑與適量細(xì)土混合加適量水拌種、晾干，即拌即用。試驗(yàn)地的田間管理同一般大田。

花生成熟后，2022年8月18日收獲，每小區(qū)單打單收測(cè)產(chǎn)，同時(shí)每一處理按五點(diǎn)隨機(jī)法取樣5穴共10株，分別測(cè)定株均根瘤數(shù)、株均瘤干重、飽果率、莢果產(chǎn)量（kg/hm2）。

1.9 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)分析

采用隨機(jī)區(qū)組的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)結(jié)果采用新復(fù)極差多重比較法（Duncan’s new multiple range test，MRT）［25］。所有數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS statistics 17.0軟件完成［26］。

2 結(jié)果與分析

2.1 室內(nèi)盆栽篩選結(jié)果

2.1.1 總結(jié)瘤數(shù)

對(duì)分離的野生根瘤菌進(jìn)行盆栽回接試驗(yàn)，檢驗(yàn)這些菌株與花生共生結(jié)瘤的能力。首先考察了總平均結(jié)瘤數(shù)，由表 1、圖1可知，兩種花生品種接種不同根瘤菌菌株后均能有效結(jié)瘤，不同菌株在同一品種上的總平均結(jié)瘤數(shù)存在差異，且不同菌株在兩種花生上的總平均結(jié)瘤數(shù)的排列順序呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)，結(jié)瘤數(shù)由低到高依次為R9-7-2、R9-7-1、R3-2、R4-6、R6、R1-3、R7、R8-3。其中R8-3在常寧花生和安化花生兩個(gè)品種上的結(jié)瘤數(shù)最高，分別為173.0±8.7和201.3±34.5，顯著高于其他菌株，其次為菌株R7，在兩個(gè)品種上的結(jié)瘤數(shù)分別達(dá)到133.3±23.5和135.3±24.0，顯著高于除R8-3之外的其他菌株，表明這兩株菌在這兩個(gè)品種上的結(jié)瘤能力最強(qiáng)。其他菌株之間的結(jié)瘤數(shù)部分有顯著差異，且兩種不同的花生品種上的差異性也不一致。

2.1.2 地上部分干重

花生地上部分干重是間接反映固氮能力的指標(biāo)，為此我們測(cè)定了所有盆栽試驗(yàn)各處理組的地上部分干重。結(jié)果如表2、圖1a所示，不同花生接種不同菌株后地上部分干重差異很大。各處理組常寧花生的地上部分干重從小到大依次為Con、R9-7-2、R9-7-1、R7、R8-3、R1-3、R6、R3-2、R4-6，而安化花生的不同處理組地上部分干重從小到大依次為R8-3、R7、Con、R9-7-1、R9-7-2、R1-3、R4-6、R6、R3-2。對(duì)比結(jié)瘤數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)結(jié)瘤能力強(qiáng)的菌株并未表現(xiàn)出相應(yīng)的高固氮能力，具體表現(xiàn)在R8-3、R7總結(jié)瘤數(shù)遠(yuǎn)高于其他菌株（圖1b），而相對(duì)應(yīng)兩個(gè)花生品種的地上部分干重卻都不是最高的，甚至R7菌株在安化花生上接種后地上部分干重居于所有菌株的最低水平。而R4-6、R6、R3-2三個(gè)菌株，卻在兩種花生品種的地上部分干重上都表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢(shì)。商業(yè)菌株R6作為東北地區(qū)的優(yōu)勢(shì)菌株，也在此次室內(nèi)盆栽試驗(yàn)中表現(xiàn)了優(yōu)良的固氮性能。因此，通過(guò)地上部分干重，初步確定有潛力的優(yōu)勢(shì)菌株為R4-6、R3-2。

2.2 根瘤菌R3-2菌株鑒定

在盆栽回接試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇1株固氮優(yōu)勢(shì)菌株R3-2進(jìn)行菌種鑒定試驗(yàn)。

首先對(duì)根瘤菌R3-2進(jìn)行形態(tài)鑒定，結(jié)果如圖2所示，菌體細(xì)胞呈桿狀、不直，革蘭氏染色陰性，菌體大小為（0.5～0.9）μm×（1.2～3.0）μm。在YMA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后菌落圓形，凸起，半透明，乳白色，直徑1～2 mm， 好氧生長(zhǎng)，在添加BTB的YMA培養(yǎng)基上產(chǎn)堿。

以菌株R3-2基因組DNA為模板，利用引物27F/1492R對(duì)其16S rDNA基因序列進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，獲得了長(zhǎng)度為1 366 bp的序列，并提交至GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)，基因登錄號(hào)為PP956620。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中經(jīng)過(guò)BLAST比對(duì)后，結(jié)果表明，該菌株的16S rDNA序列與日本慢生根瘤菌（B. japonicum）序列的相似度為99.71%。進(jìn)一步選擇部分相似度較高菌株的16S rDNA序列，利用MEGA 11.0軟件的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖3）。結(jié)果表明，菌株R3-2與多株日本慢生根瘤菌（B. japonicum）聚類(lèi)在一起，處于一個(gè)分支， 初步將該菌鑒定為日本慢生根瘤菌（B. japonicum）。

2.3 根瘤菌R3-2菌株耐酸性室內(nèi)評(píng)估

由于南方花生產(chǎn)區(qū)的土壤主要為酸性土壤，需要對(duì)花生根瘤菌對(duì)酸性的適應(yīng)性進(jìn)行測(cè)定［17］。結(jié)果如圖4所示，R3-2具有一定的耐酸性能，在pH 為5.4至弱酸性的改良的Keyser和Munns培養(yǎng)基仍生長(zhǎng)良好，但在pH為4.8的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。

2.4 根瘤菌對(duì)多種重金屬的抗性測(cè)定

由于南方花生產(chǎn)區(qū)的部分土壤重金屬含量較高，需要對(duì)花生根瘤菌對(duì)重金屬的耐受性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果如表3所示，R3-2對(duì)K2Cr2O7、CdCl2、ZnSO4·7H2O、MnSO4·H2O、CuSO4·5H2O、Pb（NO3）2、CoCl3等多種重金屬都具有一定的抗性。

2.5 田間小區(qū)試驗(yàn)

選取固氮和耐酸能力較強(qiáng)的R3-2菌株在其分離的田塊進(jìn)行田間小區(qū)試驗(yàn)，收獲后每處理組隨機(jī)取樣5穴共10株，分別測(cè)定根瘤數(shù)、瘤干重、地上部分干重、飽果率、莢果每公頃產(chǎn)量（kg/hm2）。結(jié)果如表4所示，在田間小區(qū)試驗(yàn)中，R3-2菌株和商業(yè)菌株R6在不同施氮量的處理組中都能與花生正常結(jié)瘤，平均每株結(jié)瘤數(shù)量都維持在較高的水平［（129.0～198.7）個(gè)/株］，其中平均結(jié)瘤數(shù)最高的處理組為100R6組，達(dá)到（198.7±15.5）個(gè)/株。各處理組平均瘤干重雖然也呈現(xiàn)一定的差異性，但差異經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不顯著。產(chǎn)量方面，3個(gè)不同施氮水平下接種R3-2菌株處理組的產(chǎn)量都高于接種商業(yè)菌株R6處理組。其中70R3組（70%施氮量接種R3-2處理組）花生產(chǎn)量最高，折合產(chǎn)量達(dá)到（2 722.3±196.67） kg/hm2，顯著高于70R6組（70%施氮量接種R6處理組）和其他處理組（Plt;0.05），該處理組比對(duì)照組Con增產(chǎn)28.54%，比70R6組增產(chǎn)14.20%；其次為100R3組（100%施氮量接種R3-2處理組），產(chǎn)量比對(duì)照組Con增加13.88%（Plt;0.05），比100R6組增產(chǎn)6.59%；50R3組（減氮50%后接種R3-2處理組）花生產(chǎn)量與對(duì)照組Con（100%施氮量）相當(dāng)，比50R6組（減氮50%后接種R6處理組）產(chǎn)量高6.11%，其差異不顯著。

上述結(jié)果表明，R3-2菌株的增產(chǎn)性能優(yōu)于北方商業(yè)菌株R6，接種R3-2菌株能減少氮肥用量50%，在減少30%氮肥用量的情況下同時(shí)接種R3-2菌株能獲得較高的花生產(chǎn)量。

3 討論

3.1 花生根瘤菌在原生環(huán)境中的生物適應(yīng)性和競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)

為提高根瘤菌對(duì)本土環(huán)境的適應(yīng)性，本研究從湖南采集的花生根瘤中分離到了7株根瘤菌。分別以湖南地方花生品種安化小籽花生、常寧小籽花生為測(cè)試品種，通過(guò)溫室盆栽接種試驗(yàn)進(jìn)行篩選，7株根瘤菌均能在兩個(gè)花生品種上有效結(jié)瘤，其中R3-2、R4-6固氮能力最強(qiáng)。本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)栽培和田間小區(qū)試驗(yàn)結(jié)果，表明菌株R3-2具有很好的耐酸、固氮、增產(chǎn)性能，還具有一定的重金屬抗性，是一株綜合性能優(yōu)良、能夠適應(yīng)我國(guó)南方酸性土壤花生栽培的優(yōu)良花生根瘤菌株。雖然室內(nèi)栽培試驗(yàn)時(shí)選自東北的R6菌株與R3-2比較沒(méi)有顯著差異，但在酸性土壤的田間試驗(yàn)中，R3-2優(yōu)勢(shì)凸顯，減氮30%后仍增產(chǎn)28.54%，同等情況下R6僅增產(chǎn)12.56%，甚至在減氮50%時(shí)接種R6出現(xiàn)減產(chǎn)（-4.82%），表明在原生環(huán)境下R3-2具有顯著的生物適應(yīng)性和競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。這一結(jié)果和目前許多通過(guò)從本土分離根瘤菌提高對(duì)環(huán)境適應(yīng)性和競(jìng)爭(zhēng)力的報(bào)道是一致的。例如，Jovino等［27］通過(guò)田間試驗(yàn)證明，接種本土分離的Bradyrhizobium sp. ESA 123分別使豆莢和花生粒產(chǎn)量提高了9.3%～44.1%、14.5%～51.3%，比廣泛應(yīng)用的商業(yè)化菌種B. elkanii SEMIA 6144結(jié)瘤效果更好。El-Sherbeny等［14］施用植物殘?bào)w和本土慢生根瘤菌顯著提高了花生鮮重和干重、莢重和種子重及生物產(chǎn)量。杜普旋等［28］從廣東省本土分離篩選出了1株共生固氮性狀優(yōu)良的花生根瘤菌GDHS-5，屬于慢生根瘤菌屬，這個(gè)菌株具有廣譜結(jié)瘤性，田間試驗(yàn)表明，接種GDHS-5分別使單株莢果數(shù)和產(chǎn)量顯著增加35.82%、9.92%。劉鵬［17］從福建不同酸性土壤種植區(qū)域的花生根瘤中分離到4株固氮效率較高的根瘤菌，田間試驗(yàn)表明，接種根瘤菌后花生生物量分別提高了33.6%、37.7%、38.0%和27.1%，花生產(chǎn)量提高了24.7%～104.2%，增產(chǎn)最高的為FAMB12-6菌株。劉瑞瑞等［29］以采自河北省保定市淶水縣的花生根瘤為原材料，成功篩選出可與該種花生高效固氮的優(yōu)良菌株，接種Hbu074005菌株效果最佳，花生植株干質(zhì)量較對(duì)照組提高52.29%，其結(jié)瘤數(shù)、果穗數(shù)、植株株高等指標(biāo)也明顯優(yōu)于對(duì)照組及其他處理，分別較對(duì)照組提高235.56%、112.00%、31.31%。與這些菌株相比，本研究分離的R3-2菌株是從湖南本土分離的耐酸能力強(qiáng)的菌株，能在pH為5.4的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，同時(shí)還有耐受重金屬的性能，且由于該菌株分離自本地花生品種，其在原生環(huán)境中的田間應(yīng)用效果表現(xiàn)非常穩(wěn)定，對(duì)于湖南本地花生品種的高效種植具有較大的應(yīng)用潛力。

3.2 花生根瘤菌的種群多樣性

本研究從湖南地方品種中采集的花生根瘤中分離到優(yōu)異根瘤菌R3-2，通過(guò)16S rDNA基因測(cè)序及序列比對(duì)，初步鑒定為日本慢生根瘤菌（B. japonicum）。當(dāng)前已報(bào)道從花生根瘤中分離到的根瘤菌具有一定的種群多樣性，如Chen等［30］調(diào)查了廣東省花生根瘤菌的多樣性和地理分布，分離到的216株在屬水平都屬于慢生根瘤菌屬（Bradyrhizobium），在種水平可以歸屬為22個(gè)種，其中占比高的14個(gè)種都為新種，還包括日本慢生根瘤菌（B. japonicum）、重氮慢生根瘤菌（B. diazoefficiens）、圓明園慢生根瘤菌（B. yuanmingense）、花生慢生根瘤菌（B. arachidis）、廣東慢生根瘤菌（B. guangdongense）、廣西慢生根瘤菌（B. guangxiense）、西表島慢生根瘤菌（B. iriomotense）和遼寧慢生根瘤菌（B. liaoningense）等8個(gè)已知種。Paudel等［31］從花生根瘤中分離到了一株慢生根瘤菌Lb8 初步鑒定為重氮慢生根瘤菌（B. diazoefficens），并證明水平基因轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)座子等DNA元件的插入為根瘤菌基因組帶來(lái)了可塑性。Bouznif等［32］嘗試研究來(lái)自不同地理區(qū)域的許多不同野生和栽培豆類(lèi)物種相關(guān)的慢生根瘤菌的系統(tǒng)地理學(xué)，對(duì)67株來(lái)自花生的慢生根瘤菌基因組序列（絕大部分來(lái)自中國(guó)，1株來(lái)自印度）進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，表明從中國(guó)分離的花生根瘤菌跟非參考菌株聚在一類(lèi)，說(shuō)明這些菌株的來(lái)源還不清楚，但這些菌株跟大豆中分離的根瘤菌具有高度的相似性。Zhang等［33］從河南正陽(yáng)采集的花生根瘤中分離、鑒定了3株慢生根瘤菌新種，定名為正陽(yáng)慢生根瘤菌（B. zhengyangense sp. nov.）。Li等［34］從廣東采集的花生根瘤中分離鑒定了3個(gè)慢生根瘤菌新種 ，定名為南寧慢生根瘤菌（B. nanningense sp. nov.）、 廣州慢生根瘤菌（B. guangzhouense sp. nov.）和湛江慢生根瘤菌（B. zhanjiangense sp. nov.）。本研究從湖南本土分離出的花生根瘤菌的遺傳多樣性與上述研究結(jié)果相符，同時(shí)也表明慢生根瘤菌是與花生共生結(jié)瘤固氮的主要根瘤菌類(lèi)群。

3.3 花生根瘤重量與植株產(chǎn)量的相關(guān)性

本研究在盆栽試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，R8-3的結(jié)瘤水平最高，但它處理后的花生地上部分干重卻低于其他結(jié)瘤水平中等的R3-2和R4-6，尤其是處理安化花生品種后，地上部分干重顯著低于R3-2和R4-6處理后的花生（Plt;0.01）。酸性田間土壤的田間小區(qū)試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，三種不同施氮水平下，北方商業(yè)化根瘤菌R6的根瘤干重均大于本土分離的R3-2，部分處理的根瘤數(shù)也大于R3-2處理，但是R3-2處理后的花生產(chǎn)量則均高于R6處理，尤其是在70%施氮量下，差異達(dá)到顯著水平（Plt;0.05）。這些結(jié)果說(shuō)明，根瘤菌在花生上形成的根瘤數(shù)和根瘤重量與植株生長(zhǎng)和產(chǎn)量不呈現(xiàn)正相關(guān)，該結(jié)果與前人報(bào)道的根瘤菌鮮重與產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)［35］的結(jié)論不同。分析原因，可能是由于根瘤的產(chǎn)生需要消耗大量的能量和光合代謝產(chǎn)物，本土菌株R3-2在進(jìn)化過(guò)程中與原生寄主形成了更優(yōu)的共生機(jī)制，對(duì)原生環(huán)境中的生長(zhǎng)環(huán)境因素如光照強(qiáng)度、土壤氮濃度、溫濕度、土著微生物群落等更加適應(yīng)，能夠?qū)⒏龅闹亓靠刂圃诤侠淼乃?，表現(xiàn)了更好的根瘤生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)性，而北方的R6菌株應(yīng)用到南方非原生環(huán)境中后，土壤更低的氮素水平、pH等因素，刺激菌株做出對(duì)環(huán)境的競(jìng)爭(zhēng)性響應(yīng)，表現(xiàn)出根瘤超量，從而過(guò)多消耗寄主光合作用的產(chǎn)物，影響了寄主自身生長(zhǎng)和花生生產(chǎn)。這些結(jié)果同時(shí)提示我們，優(yōu)異根瘤菌的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)不應(yīng)以結(jié)瘤數(shù)量和根瘤重量為主要衡量指標(biāo)，而應(yīng)根據(jù)結(jié)瘤水平并結(jié)合產(chǎn)量指標(biāo)來(lái)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

綜上所述，我們從湖南本土花生中分離到了一株日本慢生根瘤菌R3-2，該菌株在原生環(huán)境中展現(xiàn)出了優(yōu)異的增產(chǎn)性能，具有很好的推廣應(yīng)用前景。該菌株的田間小區(qū)試驗(yàn)?zāi)壳皟H在原生環(huán)境和原生寄主進(jìn)行，后續(xù)將進(jìn)一步研究和考察它在湖南其他地區(qū)和其他花生品種上是否有同樣的優(yōu)勢(shì)。

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收稿日期：2024-07-12；修回日期：2024-08-16。

基金項(xiàng)目：長(zhǎng)沙市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（kq2208130）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（32000047）；湖南省技術(shù)攻關(guān)“揭榜掛帥”項(xiàng)目（2021NK1040）。

作者簡(jiǎn)介：陳海榮，高級(jí)農(nóng)藝師，主要從事農(nóng)用微生物研究及開(kāi)發(fā)。

*通信作者：劉宇波，高級(jí)工程師，主要從事農(nóng)用微生物研究及開(kāi)發(fā)。E-mail： lyubo123@163.com。