核桃腐爛病拮抗菌Pseudomonas chlororaphis的篩選、鑒定及其防病促生效果

摘 " "要：【目的】為有效控制核桃腐爛病的發(fā)生與發(fā)展，從新疆溫宿縣核桃園土壤中分離既對核桃腐爛病有很好防效，又對核桃種子萌芽具有促進作用的拮抗細菌?！痉椒ā客ㄟ^稀釋涂布平板法進行分離培養(yǎng)、平皿對峙篩選，通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法進行鑒定，以及通過室內(nèi)離體枝條、盆栽和田間盆栽試驗探究防病促生作用?！窘Y(jié)果】篩選出1株生防菌WS-04，通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性測定及分子鑒定，最終確定菌株WS-04為綠針假單胞菌Pseudomonas chlororaphis。研究發(fā)現(xiàn)WS-04能使病原菌菌絲發(fā)生斷裂和解體，使菌絲無法正常生長，對核桃腐爛病菌Cytospora chysosperma的抑菌效果達87.00%，其發(fā)酵液對核桃腐爛病的防效也達到84.96%，還具有一定的熱穩(wěn)定性。經(jīng)過拮抗菌株發(fā)酵濾液浸泡處理的核桃種子，萌芽率和發(fā)芽率與對照相比都有顯著提高（p＜0.05），且有效地降低了壞種率。菌株發(fā)酵濾液能促進核桃幼苗苗高、主根長、須根數(shù)、葉片面積和干質(zhì)量的顯著增加，其依次增加了25.40%、83.33%、48.02%、24.76%和98.40%。【結(jié)論】從核桃園土壤中分離并篩選出一株具有廣譜抗菌且對核桃種子和幼苗具有促生作用的生防細菌。研究成果為核桃腐爛病的生物防治提供了新的菌株來源。

關(guān)鍵詞：核桃腐爛??；拮抗細菌；促生作用

中圖分類號：S664.1；S436.64 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2025）01-0170-15

Screening and identification of antagonistic bacterium Pseudomonas chlororaphis for walnut rot disease and its effect on promoting germination of seeds and growth of seedlings in walnut

LIU Zhijin1， SHAN Lulu1， Maliyanguli·Tuerdi1， LI Tong1， KANG Qihang1， ZHANG Rui2， DONG Ning3， CHEN Xiaofei1*

（1College of Agriculture， Tarim University/Key Laboratory of Integrated Pest Management （IPM） of Xinjiang Production and Construction Corps in Southern Xinjiang， Alar 843300， Xinjiang， China; 2College of Horticulture and Forestry， Tarim University， Alar 843300， Xinjiang， China; 3Forestry and Grassland Work Station of Xinjiang Production and Construction Corps， Urumqi 830013， Xinjiang， China）

Abstract： 【Objective】 The study aimed to select indigenous bacterial strain that could control walnut rot and other fungal diseases and promote the germination of seeds and growth of seedlings of walnut. 【Methods】 Bacteria were isolated from the rhizosphere soil of walnut （Juglans regia L.） trees using confronting plate methods and streaked on agar to screen for antagonistic strains. The broad-spectrum antibacterial activity of the selected antagonistic strains against walnut rot disease was evaluated. The morphological characteristics， physicochemical properties， and molecular biological characters were employed to identify the screened strains. The thermal stability of the antagonistic strains was determined using mycelial growth assays under different temperature gradients. The inoculation experiments were conducted to ascertain the effects of the antagonistic strains on the walnut rot symptoms. The pot experiments in a controlled environment were carried out to analyze the impact of varying concentrations of fermented filtrate on the germination of walnut seeds and the rate of poor-quality seeds. The mature， unspoiled walnuts weighing approximately 12 grams each were selected as experimental materials and dried in the air naturally. The fermented filtrate of the antagonistic strain WS-04 was diluted by sterilized distilled water， and five concentrations （50， 150， 250， 350， and 450 mg·mL-1） were set for treatment. The sterilized distilled water was used as a control， and each concentration was applied to 20 seeds with three repeats for each experiment. Prior to soaking， the walnut shells were opened to ensure that the kernels would contact the fermented filtrate. After soaking for one day， the seeds were rinsed with clean water and placed in a humid germination box within an incubator at a constant temperature of 30 ℃ to promote germination. Daily observations were made during the course of seed germination， and any rotten or moldy seeds were promptly removed. The germinated seeds were transplanted into pots with a diameter of 20 cm， with two seeds planted per hole， covered with 1 cm of substrate （vermiculite： perlite： peat soil： soil in a volume ratio of 1∶1∶1∶1）. The number of germinated seeds was recorded， and the rate of blanching was calculated. Following the emergence of two leaves， the germination rate and the rate of poor-quality seeds were calculated. Simultaneously， both indoor pot experiments and field pot experiments were conducted to study the effect of different concentrations of the fermented filtrate on the growth of walnut seedlings. The pretreatment of hulled walnut seeds for the experiment of promotion of growth on seedlings was as follows： the walnuts were gently split open to ensure the contact between the kernel and the fermented filtrate of the antagonistic bacteria. A concentration of 150 mg·mL-1 of the antagonistic culture was assigned to the experimental group， while the control group consisted of a medium without antagonistic culture; each group comprised 25 walnut seeds， with five repeats. After germination， the single well plates （32 wells， 6 cm × 4.5 cm） were used for the treatments， one seed per well. The seedling treatment in plates involved sowing in the wells and initiating irrigation with the antagonistic filtrate （experimental group received 150 mg·mL-1 of fermented filtrate）， administering 50 mL every five days. After 20 days of growth， the seedlings from the well plates were transplanted outdoors. For the pot experiments， the walnut seedlings were transplanted into experimental plots （with a diameter of 40 cm）， with each pot irrigated with 500 mL of fermented filtrate （once every ten days）. After 90 days of transplanting， five plants were randomly selected to measure biological indicators， including dry weight， seedling height， main root length， and root count. 【Results】 A total of 157 bacterial strains were isolated from walnut rhizosphere soil， of which five strains were found to inhibit walnut rot disease， with strain WS-04 demonstrating an inhibition rate of 87.00%. The inhibition rates for Cytospora nivea， Valsa mali， Valsa ambiens， Cytospora chrysosperma， Cytospora leucostoma， Alternaria alternata， Verticillium dahliae， and Fusarium oxysporum were all above 70.00%. Through the morphological characteristics， physicochemical properties， and molecular biological confirmation， the strain WS-04 was ultimately identified as Pseudomonas chlororaphis. The antibacterial activity of C. chrysosperma was assessed using the mycelial growth rate method， revealing that WS-04 exhibited significant inhibitory effects on C. chrysosperma， with inhibition rates exceeding 80% as the concentration of fermented filtrate increased. At a concentration of 15%， the inhibition rate reached 93.65%. The thermal stability assays indicated that as the temperature increased， the inhibition rate of the WS-04 gradually declined; however， it remained above 85% against C. chrysosperma， indicating favorable thermal stability. The treatment at 95 ℃ for 30 minutes demonstrated that increased temperature progressively led to the loss of the activity of the fermented filtrate. The isolation protection tests suggested that the WS-04 would have good preventive effects on anti- walnut rot， with an average disease lesion area of 0.85 cm2 for treated samples compared with 6.32 cm2 for the control group， resulting in a control efficacy of 84.96%. The pot experiments revealed that the germination rate of the walnut seeds was improved with increase of the concentrations after treatments. At concentrations of 150 mg·mL-1 and 250 mg·mL-1， significant promotion of walnut seed germination was observed. The germination rate was notably higher in the treatment groups with concentrations of 250 mg·mL-1 ＞ 150 mg·mL-1 ＞ 350 mg·mL-1 ＞ 50 mg·mL-1 ＞ 450 mg·mL-1 compared with the control group （p ＜ 0.05）. As the concentration increased， the germination rate initially rose and then declined; within the range of 50 to 250 mg·mL-1， the germination rate of walnut seeds steadily increased， but when the concentration of the fermented filtrate exceeded 250 mg·mL-1， the germination rate began to decrease. At a concentration of 150 mg·mL-1， the percentage of the poor-quality seeds was the lowest， reaching 6.68%. When the concentration of the antagonistic bacteria exceeded 150 mg·mL-1， the rate of poor-quality seeds exhibited an upward trend; however， the rates of poor quality seeds of all concentrations remained significantly lower than those in the control group （p ＜ 0.05）. In the field experiments， we found that the WS-04 could promote the growth of walnut seedlings， increasing seedling height， root length， leaf area， and dry weight by 25.40%， 83.33%， 48.02%， 24.76%， and 98.40%， respectively. 【Conclusion】 A biocontrol bacterium with broad antibacterial spectrum and growth promotion effect on walnut seeds and seedlings was isolated and screened from the soil of walnut orchard. This would provide a novel strain source for the biological control of the walnut rot disease.

Key words： Walnut rot disease; Antagonistic bacteria; Promoting effect

核桃（Juglans regia L.）是胡桃科核桃屬的重要經(jīng)濟樹種，是世界四大干果之一，具有較高營養(yǎng)價值和藥用價值[1]。新疆是中國核桃種植第二大省份，2020年新疆種植面積已達到4.14×105 hm2，年產(chǎn)量達到1.15×106 t[2]。近年來隨著新疆核桃的大面積種植，核桃腐爛病大面積發(fā)生，嚴重制約核桃產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[3-5]。目前生產(chǎn)上病害仍然以化學(xué)防治為主，但化學(xué)殺菌劑存在易污染環(huán)境、對人畜不安全、農(nóng)藥殘留等一系列問題[6-7]。因此，開發(fā)出高效的生防菌株替代化學(xué)藥劑防治核桃腐爛病，不僅可以有效控制病害的發(fā)生與發(fā)展，還可以有效規(guī)避化學(xué)防治帶來的系列問題。

土壤細菌是植物根際土壤微生態(tài)的優(yōu)勢種群之一，具有分布廣、數(shù)量多、營養(yǎng)要求簡單、繁殖快、競爭定殖力強等特點[8]。土壤細菌能產(chǎn)生吩嗪-1-羧酸（phenazine-1-carboxylic acid，PCA）、2，4-二乙?；g苯三酚、硝吡咯菌素（pyrrolnitrin，PRN）、藤黃綠膿菌素（pyoluterorin，PLT）、假單胞菌酸（pseudomonicacid）、氫氰酸和植物生長素吲哚乙酸（indole-3-aceticacid，IAA）等次生代謝產(chǎn)物，這些有機化合物不僅能增強植物抗病能力，而且還對植物生長發(fā)育產(chǎn)生積極影響[9-10]。目前對于核桃腐爛病的生物防治應(yīng)用較多的拮抗細菌主要有芽孢桿菌（Bacillus spp.），假單胞桿菌（Pseudomonas spp.）、土壤放射桿菌（Agrobacterium radiobacter）等。例如許多學(xué)者利用假單胞菌成功防治了小麥[11]、草莓[12]、小白菜[13]和番茄[14]等作物的部分侵染性病害，同時發(fā)現(xiàn)假單胞菌還能促進作物的健康生長[15-16]。魏海雷等[17]在小麥全蝕病的土壤中分離得到一株熒光假單胞菌2P2 4，通過研究發(fā)現(xiàn)此熒光假單胞菌產(chǎn)生的多種抗菌物質(zhì)對枯黃萎病、全蝕病以及根腐病均有較好的生物防治效果。冉隆賢等[18]通過篩選發(fā)現(xiàn)3株假單胞桿菌及其缺失嗜鐵素對桉樹灰霉病具有較好的防治效果，且假單胞菌能否產(chǎn)生嗜鐵素直接影響桉樹灰霉病的發(fā)生與否。劉艷萍等[19]研究表明，惡臭假單胞菌A3產(chǎn)生的嗜鐵素可以顯著促進黃瓜幼苗的生長。楊藝煒[20]研究發(fā)現(xiàn)綠針假單胞菌XF10能有效地抑制煙草黑脛病菌菌絲生長，且能夠抑制游動孢子囊的產(chǎn)生和孢子的萌發(fā)，盆栽防效超過70.00%。史娜艷[21]從核桃樹皮分離出一株枯草芽孢桿菌S23，該菌株可以使金黃殼囊孢菌絲發(fā)生皺縮、畸形甚至斷裂，從而抑制菌絲的生長。展麗然等[22]從土壤中篩選到一株放線菌Z-6，該菌株對腐爛病菌有較強拮抗作用，經(jīng)過鑒定該放線菌屬于鏈霉菌屬（Streptomyces）。

目前對核桃腐爛病的生物防治應(yīng)用較多的拮抗細菌主要有芽孢桿菌（Bacillus spp.）[23]，但是利用綠針假單胞來防治核桃腐爛病還未見報道。如今核桃產(chǎn)業(yè)已成為新疆核桃種植區(qū)鞏固脫貧、促進鄉(xiāng)村振興和增加農(nóng)民收入的重要支柱性產(chǎn)業(yè)。然而核桃腐爛病的發(fā)生與蔓延嚴重阻礙了核桃產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。因此，從核桃園土壤中分離篩選活性高、對環(huán)境友好且能促進壯苗培育的拮抗菌，對促進新疆核桃產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 土壤樣品 2023年5月從阿克蘇地區(qū)溫宿縣核桃林場采集試驗土壤。果園核桃品種為溫185，樹齡30年，株行距為5 m×7 m。采樣時選取長勢均勻的核桃樹，按照5點采樣法采集核桃園土壤，在距離核桃樹主干1 m的地方去除0～5 cm表層土，用取土鉆采集5～20 cm的土壤，每個30年樹齡核桃園采集20份土壤樣品，共采集90份樣品。按照四分法收集土壤，將土壤過2 mm篩并將土樣裝入無菌袋中，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 供試病原菌菌株 核桃腐爛病菌Cytospora chrysosperma和C. nivea、蘋果腐爛病菌Valsa mali、香梨腐爛病菌V. ambiens、沙棗腐爛病菌C. chrysosperma、杏樹腐爛病菌C. leucostoma、核桃褐斑病菌Alternaria alternata、棉花黃萎病菌Verticillium dahliae、棉花枯萎病菌Fusarium oxysporum，均由南疆有害生物綜合治理兵團重點實驗室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基 NA培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，蛋白胨10 g，瓊脂20 g，蒸餾水定容至1000 mL。LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母膏5 g，氯化鈉5 g，蒸餾水定容至1000 mL。PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯去皮200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水定容至1000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 拮抗細菌的分離 稱取土壤樣品10.0 g放入裝有90 mL無菌水和玻璃珠的三角瓶中，于搖床上振蕩30 min后制得土壤樣品懸液，然后按比例制成10-2、10-3、10-4樣品稀釋液。分別吸取100 μL上述處理液于NA培養(yǎng)基上，通過稀釋涂布法分離菌株，30 ℃培養(yǎng)24 h，然后平板上劃線純化、培養(yǎng)并編號，4 ℃存放。

1.2.2 拮抗細菌的篩選 采用平板對峙培養(yǎng)法。將保存的細菌活化培養(yǎng)后，十字交叉等距離（距離病原菌2.5 cm左右）劃線至已接種核桃樹腐爛病病原菌C. chrysosperma的PDA平板上[24]，以只接病原菌為對照，每個處理3個重復(fù)。26 ℃恒溫培養(yǎng)，待對照菌絲即將長滿時，觀察菌落形態(tài)并且測量菌落直徑計算菌落生長抑菌率。

抑菌率/%=（對照平板菌落直徑－處理平板菌落直徑）/對照平板菌落直徑×100。

1.3 拮抗菌株的鑒定

1.3.1 拮抗菌株形態(tài)學(xué)特征和生理生化特性測定 將活化后的菌株WS-04劃線接種于NA固體培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落顏色和形態(tài)，并參考《伯杰細菌鑒定手冊》[25]和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[26]測定生理生化指標。

1.3.2 拮抗菌株分子生物學(xué)鑒定 拮抗細菌基因組DNA提取采用試劑盒（生工生物科技有限公司），采用細菌通用引物27F5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'[27]擴增16S rDNA；擴增采用50 μL反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性35 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳，使用凝膠成像儀觀察結(jié)果，最后將檢測合格的擴增產(chǎn)物送至上海生物工程股份有限公司測序。利用MEGA 11.0軟件采用鄰接法構(gòu)建基于16S基因的系統(tǒng)發(fā)育樹，明確拮抗菌株的分類地位。

1.4 拮抗菌株抑菌譜測定

采用平板對峙法對核桃樹腐爛病另一種病原菌C. nivea、蘋果腐爛病菌V. mali、香梨腐爛病菌V. ambiens、杏樹腐爛病菌C. leucoostoma、沙棗腐爛病菌C. chysosperma、核桃褐斑病菌A. alternata、棉花黃萎病菌V. dahliae、棉花枯萎病菌F. oxysporum開展抑菌率測定，方法參照1.2.2。

1.5 拮抗菌株生長曲線的測定

將拮抗菌株用接種環(huán)挑取放入盛有LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30 ℃ 200 r·min-1控溫搖床培養(yǎng)，每2 h測量1次OD600，培養(yǎng)80 h，記錄數(shù)據(jù)，繪制生長曲線。

1.6 不同濃度梯度發(fā)酵濾液對病原菌菌絲抑制率測定

菌懸液的制備：挑取拮抗菌單菌落接種于液體培養(yǎng)基中，30 ℃ 200 r·min-1培養(yǎng)2 d，獲得菌懸液。

發(fā)酵液的制備：取100 μL拮抗菌菌懸液于12 000 r·min-1室溫離心2 min，吸取上清液轉(zhuǎn)接于100 mL的液體培養(yǎng)基中，30 ℃ 200 r·min-1培養(yǎng)2 d后得到發(fā)酵液。

發(fā)酵濾液的制備：將發(fā)酵液4 ℃、12 000 r·min-1離心20 min后取上清液，用0.22 μm濾膜過濾器過濾獲得發(fā)酵濾液，將獲得的發(fā)酵濾液放置于4 ℃冰箱中備用。

將發(fā)酵濾液和融化好的PDA培養(yǎng)基混合，分別配置成發(fā)酵濾液含量為3%、6%、9%、12%、15%的培養(yǎng)基平板，中央接種一個培養(yǎng)3 d的C. chrysosperma菌餅（直徑5 mm），以不含發(fā)酵濾液的PDA培養(yǎng)基為對照組，每處理3次重復(fù)，26 ℃培養(yǎng)3 d，采取菌絲生長速率法測定抑菌率。

1.7 拮抗菌株發(fā)酵濾液熱穩(wěn)定性測定

將5個裝有10 mL發(fā)酵濾液的離心管，分別置于55、65、75、85、95 ℃溫度條件下水浴30 min，將發(fā)酵濾液與融化冷卻至55 ℃的PDA培養(yǎng)基（1∶3）混合倒板，待培養(yǎng)基凝固后在平板中央放置病原菌菌餅，以沒有進行溫度處理的發(fā)酵濾液和PDA培養(yǎng)基（1∶3）混合為陽性對照，以未加入發(fā)酵濾液的PDA培養(yǎng)基為空白對照，每個處理3次重復(fù)，26 ℃黑暗培養(yǎng)，直至空白對照組病原菌菌絲長滿平皿后，測量病原菌菌落直徑，并計算菌絲生長抑制率。

1.8 發(fā)酵液對C. chrysosperma菌絲生長的影響

取20 mL冷卻的PDA與5 mL發(fā)酵液混合后，在滅菌載玻片上倒上一層混合液，凝固后用滅菌刀片劃去寬約1 cm的培養(yǎng)基，挑取培養(yǎng)3 d的C. chrysosperma菌絲接種于截面，蓋上蓋玻片，然后置于濕潤的培養(yǎng)皿中26 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，以不加發(fā)酵液的PDA為對照。顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)變化。

1.9 發(fā)酵液對離體枝條的保護作用

枝條處理：采集健康和粗細程度均一的2年生核桃枝條，剪成10～15 cm的枝段，在超凈工作臺用滅菌水沖洗干凈后，用0.6%次氯酸鈉溶液消毒15～20 min后，無菌水再次清洗3～4次，自然晾干。用水浴鍋融化的石蠟封住枝條兩端保濕，靜置晾干備用，整個過程均在無菌環(huán)境進行。

將處理好的枝條用滅菌打孔器（孔徑5 mm）打孔，處理組織用滅菌刷子蘸取適量發(fā)酵液涂刷枝條5次，等整體晾干后在枝條已打好的孔徑處接種核桃樹腐爛病菌菌餅，每個枝條1個接種點，每個處理設(shè)置3個重復(fù)（每重復(fù)為5個枝條），以LB液體培養(yǎng)基代替發(fā)酵液為對照，在26 ℃條件下保濕培養(yǎng)15 d后，觀察離體枝條腐爛病的發(fā)生情況，并測量病斑面積（游標卡尺）。

病斑面積/cm2＝1/4×π×長徑×短徑。

1.10 菌株WS-04發(fā)酵濾液對核桃種子和幼苗的促生作用

1.10.1 菌株WS-04對溫185核桃種子萌芽率、發(fā)芽率和壞種率的影響 選取種仁飽滿、無霉無蟲，且單果質(zhì)量≥12 g的干果作為試驗材料，自然晾干。將拮抗菌株WS-04發(fā)酵濾液加入到滅菌蒸餾水，設(shè)置成5個質(zhì)量濃度（50、150、250、350、450 mg·mL-1），以滅菌蒸餾水處理為對照，一個質(zhì)量濃度處理20粒種子，3次重復(fù)。浸泡之前將核桃外殼開口，使其發(fā)酵濾液接觸核桃仁，浸泡1 d后用清水洗凈，放在濕潤的發(fā)芽盒內(nèi)，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽處理，每日觀察種子發(fā)芽情況，及時清除腐爛霉變種子。待種子發(fā)芽后，播種于花盆（20 cm×20 cm）中，每穴2粒種子，覆蓋l cm厚基質(zhì)（蛭石∶珍珠巖∶泥炭∶土壤體積比為1∶1∶1∶1）。統(tǒng)計種子萌動情況，計算種子萌芽率，待種子長出2枚葉子后統(tǒng)計發(fā)芽率和壞種率。

種子萌芽率/%=（催芽后種子露白數(shù)/供試種子數(shù)）×100；

發(fā)芽率/%=（發(fā)芽總粒數(shù)/供試種子數(shù)）×100；

壞種率/%=（種子霉?fàn)€數(shù)/供試種子數(shù)）×100。

1.10.2 菌株WS-04發(fā)酵濾液對核桃幼苗的促生作用 帶殼核桃種子的預(yù)處理：將帶殼核桃使用核桃夾輕輕裂開，避免核桃仁接觸不到拮抗菌發(fā)酵濾液。以150 mg·mL-1拮抗菌發(fā)酵濾液為試驗組，以未添加拮抗菌發(fā)酵濾液的培養(yǎng)基為對照，25粒核桃種子為一個處理，5次重復(fù)。

浸種催芽處理：核桃種子用75%乙醇表面消毒30 s，無菌水漂洗3次。30 ℃溫水浸種4～5 h，種子于28 ℃催芽。種子發(fā)芽后，播種于穴盤（32孔，6 cm×4.5 cm）中，每穴1粒種子，覆蓋l cm厚基質(zhì)（蛭石∶珍珠巖∶泥炭∶土壤體積比為1∶1∶1∶1）。

促生苗處理：（1）穴盤苗處理。將催芽處理的核桃種子播種于穴盤，開始澆灌拮抗菌發(fā)酵濾液（試驗組澆灌150 mg·mL-1發(fā)酵濾液，對照澆灌水），每次每穴澆灌50 mL、每5 d澆灌一次，待種子生長20 d后，將穴盤幼苗移栽至室外大田盆栽。

（2）盆栽苗處理。于2023年7月將穴盤盆栽核桃幼苗移栽到塔里木大學(xué)節(jié)水灌溉試驗田（直徑為40 cm花盆），澆灌3次發(fā)酵濾液每次每盆500 mL（每10 d 1次），核桃幼苗移栽生長90 d后，于2023年9月隨機選擇5株幼苗測量干質(zhì)量、苗高、主根長、須根數(shù)等生物學(xué)指標。拔出核桃幼苗時保證植株的完整性，對核桃幼苗的根系整理時，用無菌水緩慢沖洗，確保根部的完整性。

1.11 數(shù)據(jù)處理

利用Excel和DPS軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析，利用MEGA 11.0建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌株分離和篩選

采用稀釋涂布平板法總共分離得到細菌157株，平皿對峙獲得5株對C. chysosperma有較強拮抗作用的菌株，其抑菌率超過70%（表1）。其中菌株WS-04對C. chysosperma抑制作用最強（圖1），抑制率達到87.00%。因此本研究中選定菌株WS-04進一步開展后續(xù)研究。

2.2 拮抗菌株WS-04的鑒定

2.2.1 形態(tài)特征觀察 在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后可形成1.2 mm菌落，菌落橙色，圓形，表面凸起，光滑，較黏稠，易挑起，邊緣整齊，電鏡掃描菌體形態(tài)為桿狀（圖2）。生理生化測定結(jié)果表明，菌株可利用分解無機磷、蛋白酶、鐵載體、明膠、多糖、M.R、蔗糖、精氨酸、酯酶、氧化酶、檸檬酸鹽。最適生長鹽含量（w）為0%～6% NaCl，最適生長pH為7.0～7.5（表2）。

2.2.2 分子生物學(xué)鑒定 16S rRNA基因序列測序后提交GenBank獲得登錄號PP059680，同源性比對結(jié)果顯示菌株WS-04與綠針假單胞菌P. chlororaphis的同源率為99%。以Bacillus subtilis為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株WS-04與綠針假單胞菌P. chlororaphis聚在同一分支（圖3），表明WS-04與P. chlororaphis的親緣關(guān)系最近，結(jié)合形態(tài)特征、生理生化特征和分子鑒定結(jié)果，最終將菌株WS-04鑒定為綠針假單胞菌P. chlororaphis。

2.3 拮抗菌株WS-04抑菌譜的測定

抑菌譜測定結(jié)果表明，拮抗菌株WS-04對8種供試病原菌的抑制率均高于75%（表3）。其中對C. nivea、V. mali、V. ambiens、V. dahliae、C. chrysosperma、A. alternata病原菌的抑制率超過80%，說明菌株WS-04具有較好廣譜拮抗效果（圖4）。

2.4 拮抗菌株WS-04生長曲線的測定

菌株WS-04的生長曲線如圖5所示，在0～6 h菌株生長緩慢，進入生長延滯期；6 h以后細菌快速生長，48 h達到生長高峰期，隨后進入生長穩(wěn)定期；自58 h以后菌體數(shù)量逐漸減少進入衰亡期。研究表明菌株在48～58 h菌懸液數(shù)量最多而且活性強。

2.5 不同濃度梯度發(fā)酵濾液對病原菌菌絲的抑制率

采用菌絲生長速率法測定不同濃度梯度發(fā)酵濾液對C. chrysosperma菌絲生長的抑菌率。結(jié)果表明不同濃度梯度發(fā)酵濾液對菌絲均具有較好抑制效果（圖6），且隨著濃度升高，其抑制效果越明顯，最高抑制率達到93.65%（表4）。

2.6 拮抗菌WS-04發(fā)酵濾液熱穩(wěn)定性測定

由圖7可知，菌株WS-04發(fā)酵濾液在不同水浴溫度處理后，其抑制率隨溫度升高而下降，但對C. chrysosperma的抑制率均在85%以上，表現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性（圖7-A、B）。但是95 ℃處理30 min后，其抑制率明顯降低。綜上可知，拮抗菌WS-04發(fā)酵濾液經(jīng)溫度梯度處理以后，對C. chrysosperma的抑制率有一定的影響，說明溫度升高會導(dǎo)致發(fā)酵濾液中抑菌成分逐漸喪失活性。

2.7 拮抗菌WS-04發(fā)酵液對C. chrysosperma菌絲生長的影響

由圖8可以看出，C. chrysosperma的菌絲在混合培養(yǎng)基上生長3 d后，菌絲頂端膨大出現(xiàn)皺縮，局部菌絲彎曲變畸，菌絲出現(xiàn)嚴重消融的現(xiàn)象，菌絲無法正常生長（圖8-B、C、E）；而對照組C. chrysosperma菌絲細長均勻且表面光滑，形態(tài)飽滿而完整，能正常生長（圖8-A、D）。

2.8 離體枝條保護試驗

離體枝條保護試驗表明（圖9），菌株WS-04對核桃腐爛病具有很好的預(yù)防效果，用菌株WS-04發(fā)酵液處理過的病斑平均面積為0.85 cm2（圖9-B），而對照病斑平均面積達到6.32 cm2（圖9-A），防治效果為84.96%（表5）。

2.9 拮抗菌株WS-04發(fā)酵濾液對核桃種子和幼苗的促生作用

2.9.1 拮抗菌株WS-04對核桃種子萌芽率、發(fā)芽率和壞種率的影響 由圖10-A可知，帶殼核桃種子在拮抗菌發(fā)酵濾液的處理下，隨著菌發(fā)酵濾液質(zhì)量濃度的增加，其萌芽率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，而且處理質(zhì)量濃度在150 mg·mL-1和250 mg·mL-1左右時能顯著提高核桃種子萌芽率。綠針假單胞菌WS-04不同質(zhì)量濃度發(fā)酵濾液處理后的種子萌芽情況為250 mg·mL-1＞150 mg·mL-1＞350 mg·mL-1＞50 mg·mL-1＞450 mg·mL-1，各處理均顯著高于對照（p＜0.05）。因此綠針假單胞菌WS-04具有促進核桃種子萌芽的作用。

由圖10-B可知，帶殼核桃種子在拮抗菌不同質(zhì)量濃度發(fā)酵濾液處理下，發(fā)芽率隨質(zhì)量濃度增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢。綠針假單胞菌WS-04發(fā)酵濾液在50～150 mg·mL-1范圍內(nèi)，核桃種子發(fā)芽率逐漸升高，當(dāng)發(fā)酵濾液質(zhì)量濃度超過250 mg·mL-1時其發(fā)芽率逐漸減弱。拮抗菌發(fā)酵濾液質(zhì)量濃度在150～250 mg·mL-1之間時，對核桃種子發(fā)芽有著明顯促進作用。由圖10-C可知，隨著發(fā)酵濾液質(zhì)量濃度增加，核桃種子壞種率呈現(xiàn)出先下降后略微升高的趨勢。綠針假單胞菌WS-04在質(zhì)量濃度為150 mg·mL-1時的壞種率最低為6.68%。當(dāng)拮抗菌發(fā)酵濾液質(zhì)量濃度大于150 mg·mL-1以后壞種率呈現(xiàn)上升趨勢，但各質(zhì)量濃度處理后的壞種率均顯著低于對照（p＜0.05）。

2.9.2 菌株WS-04發(fā)酵濾液對核桃幼苗的促生作用 由表6可知，用綠針假單胞菌WS-04處理后的核桃幼苗的平均生長指標（圖11），其苗高為16.97 cm、主根長18.7 cm、須根數(shù)為12.33條、葉片面積為65.51 cm2、干質(zhì)量為3.73 g。而對照組核桃幼苗的苗高為13.53 cm，主根長為10.20 cm，須根數(shù)為8.33條，葉片面積為52.51 cm2，干質(zhì)量為2.33 g。與對照相比，其苗高、主根長、須根數(shù)、葉片面積和干質(zhì)量顯著增加，其依次增加了25.42%、83.33%、48.02%、24.76%和98.40%。

3 討 論

從核桃園土壤中分離篩選到一株對核桃腐爛病有較強拮抗作用，同時又能提高核桃萌芽率并降低壞種率的綠針假單胞菌WS-04，該菌株可使C. chrysosperma菌絲消融、萎縮、畸變，其抑制率達到87.00%，核桃離體枝條腐爛病防效亦達到84.96%。經(jīng)過綠針假單胞菌WS-04發(fā)酵濾液處理過的核桃種子，其萌芽率和發(fā)芽率明顯提高，同時壞種率也明顯下降。這是首次報道綠針假單胞菌在核桃上的應(yīng)用，但綠針假單胞菌的發(fā)酵條件、不同環(huán)境核桃園根際定殖能力以及防病促生的機制還有待進一步深入研究。

生物防治是實現(xiàn)植物病害綠色防控的有效手段，發(fā)掘?qū)Σ≡锞哂修卓棺饔玫挠幸嫖⑸锸菍嵤┥锓乐蔚那疤醄28]。很多具有拮抗作用的微生物產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)對真菌菌絲形態(tài)有明顯破壞作用，如P. chlororaphis CY02處理水稻稻瘟病菌后，導(dǎo)致分生孢子干癟畸形，菌絲腫脹，隔膜不清晰[29]。Broadbent等[30]發(fā)現(xiàn)假單胞桿菌（Pseudomonas spp.）主要作用機制是菌株產(chǎn)生的抗菌素有溶解煙草黑脛病菌菌絲的功能。假紫色色桿菌的菌株發(fā)酵液處理紋枯菌菌絲后，菌絲變形扭曲，萎縮并局部腫脹[31]。綠針假單胞菌菌株SPS-41產(chǎn)生的揮發(fā)性氣體3-甲基-1-丁醇、2-甲基-1-丁醇和苯乙醇對甘薯黑斑病病菌有顯著的拮抗作用[32]。筆者在本研究中從核桃園土壤中分離到一株綠針假單胞菌WS-04，該菌株能夠使C. chrysosperma菌絲嚴重畸變甚至消融，表現(xiàn)出了很好的抑菌效果，核桃離體枝條腐爛病的防治效果也非常好，而且還具有一定的熱穩(wěn)定性，該菌株展現(xiàn)出了良好的生物防治前景。綠針假單胞菌WS-04發(fā)酵濾液經(jīng)5個溫度梯度處理30 min后，隨著溫度升高，對C. chrysosperma的抑制率有所下降，但是抑制率均在80%以上，表現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性。史娜艷從核桃樹分離篩選的枯草芽孢桿菌不僅能有效防治真菌病害且還具有熱穩(wěn)定性。說明枯草芽孢桿菌和綠針假單胞菌具有相似的生理特性[21]，但是筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)假單胞菌會提前產(chǎn)生大量色素限制病原菌菌絲的生長[21]。李寶燕等[33]篩選獲得一株對果樹病害具有較好防治作用的綠針假單胞菌YTBTa14，菌株發(fā)酵濾液經(jīng)溫度梯度處理表現(xiàn)出較好的熱穩(wěn)定性，這與本研究結(jié)論一致。但是綠針假單胞菌與核桃腐爛病菌的作用方式與抑菌機制還不清楚，同時實驗室條件下的抑菌試驗和接種試驗，與大田環(huán)境完全不同，綠針假單胞菌能否在大田中發(fā)揮其穩(wěn)定的作用，也需要進一步研究。

一些拮抗菌株在對病原物產(chǎn)生破壞作用的同時，還能產(chǎn)生對植物起到很好促生作用的次生代謝產(chǎn)物。如番茄根際P. piscium不僅具有抑制尖孢鐮刀菌的能力，而且還有較強的溶磷作用，因此能有效促進盆栽番茄苗的生長[34]。綠針假單胞菌能夠產(chǎn)生吩嗪化合物、鐵載體、揮發(fā)性物質(zhì)等，對番茄、玉米、小麥等多種農(nóng)作物具有促生的功能[35-37]。本研究中分離到的綠針假單胞菌，其發(fā)酵液能夠有效促進核桃種子萌芽，同時還能大大降低壞種率，為核桃育好苗、培壯苗提供了優(yōu)異的生物制劑材料，而且菌株發(fā)酵濾液能促進核桃幼苗苗高、主根長、須根數(shù)、葉片面積和干質(zhì)量顯著增加，依次增加了25.40%、83.33%、48.02%、24.76%和98.40%。王娟等[38]從小麥根際篩選的綠針假單胞菌P. chlororaphis HG28-5在盆栽防病試驗中對辣椒疫病具有明顯的防治效果。秦娟娟等[39]研究發(fā)現(xiàn)熒光假單孢桿菌XG32，以卡拉膠和草炭為菌劑，處理組的辣椒苗在株高、根長、鮮質(zhì)量和干質(zhì)量等方面都有顯著提高。Wu等[40]從鐵皮石斛中提取的內(nèi)生細菌銅綠假單胞菌P. saponiphila，具有促進辣椒幼苗生長的功能，以上研究結(jié)論與本研究結(jié)果一致。但是綠針假單胞菌促進核桃種子萌發(fā)的原因是什么？其作用機制如何還有待進一步深入研究。

4 結(jié) 論

從新疆阿克蘇地區(qū)30年樹齡核桃園土壤中分離并篩選出一株具有廣譜抗菌、熱穩(wěn)定性的生防細菌綠針假單胞菌。通過促生特性試驗，表明綠針假單胞菌（P. chlororaphis）發(fā)酵濾液不僅有效促進核桃種子萌芽和發(fā)芽，同時還能促進核桃幼苗的苗高、主根長、須根數(shù)、葉片面積和干質(zhì)量顯著增加。

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