福建省多花黃精炭疽病的病原菌鑒定及防治藥劑篩選

摘要

為明確引起福建省多花黃精炭疽病的病原菌種類，并篩選其防治藥劑，本研究采集具有典型炭疽病癥狀的多花黃精葉片并分離純化病原菌，再利用形態(tài)學(xué)特征、ITS-CHS-GAPDH-ACT-TUB2多基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析及致病性測(cè)定進(jìn)行鑒定;采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定生產(chǎn)上常用于炭疽病防治的4種殺菌劑對(duì)病原菌的室內(nèi)毒力。結(jié)果表明，分離純化后共獲得86株菌株，分別鑒定為果生炭疽菌Colletotrichum fructicola、喀斯特炭疽菌C.karsti和白蠟樹(shù)炭疽菌C.spaethianum，三者的分離頻率依次為67.44%、11.63%和20.93%，且存在復(fù)合侵染現(xiàn)象。室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果表明，70%甲基硫菌靈可濕性粉劑對(duì)3種多花黃精炭疽菌的抑菌效果均最佳，對(duì)果生炭疽菌、喀斯特炭疽菌和白蠟樹(shù)炭疽菌的EC50分別為0.381、0.105 mg/L和0.122 mg/L;其次是450 g/L咪鮮胺水乳劑， EC50分別為1.465、1.994 mg/L和2.261 mg/L; 250 g/L吡唑醚菌酯乳油對(duì)3種炭疽病菌的抑制效果略差， EC50分別為10.232、3.899 mg/L和1.057 mg/L，說(shuō)明不同殺菌劑對(duì)炭疽菌的毒力差異較大，不同種類炭疽菌對(duì)殺菌劑的敏感性也存在差異。綜上所述，果生炭疽菌、喀斯特炭疽菌和白蠟樹(shù)炭疽菌是福建地區(qū)多花黃精炭疽病的主要病原菌，其中果生炭疽菌是優(yōu)勢(shì)種，而喀斯特炭疽菌可引起多花黃精炭疽病為國(guó)內(nèi)首次報(bào)道。70%甲基硫菌靈可濕性粉劑、450 g/L咪鮮胺水乳劑和250 g/L吡唑醚菌酯乳油適用于福建省多花黃精炭疽病的田間防治。

關(guān)鍵詞

多花黃精;" 炭疽病;" 病原菌鑒定;" 藥劑篩選

中圖分類號(hào)：

S 435.672

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：" A

DOI：" 10.16688/j.zwbh.2024098

收稿日期：" 20240228""" 修訂日期：" 20240419

基金項(xiàng)目：

福建省重大科研專項(xiàng)（2022NZ029017）;福建省人民政府中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展超越“5511”協(xié)同創(chuàng)新工程項(xiàng)目（XTCXGC2021019）;福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院英才項(xiàng)目（YC2021002）;福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新平臺(tái)（CXPT2023）

致" 謝：" 參加本試驗(yàn)部分工作的還有江代禮、譚翰杰、張能和紀(jì)燁斌等同學(xué)，特此一并致謝。

* 通信作者

E-mail：

蘇海蘭363801575@qq.com;肖榮鳳xrfxiao@163.com

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為并列第一作者

Identification of the pathogen causing anthracnose on Polygonatum cyrtonema

in Fujian province and screening of fungicides for disease control

CHENG Xi1，" SHI Huiyan1，" YANG Yihan2，" NIU Yuqing3，" SU Hailan3*，" XIAO Rongfeng2*

（1. Key Laboratory of Biopesticide and Chemical Biology， Ministry of Education， College of Plant Protection，

Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou" 350002， China; 2. Institute of Resources， Environment

and Soil Fertilizer， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou" 350003， China; 3. Institute of Crop

Sciences， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou" 350003， China）

Abstract

This study aimed to identify the pathogen species causing the anthracnose disease on Polygonatum cyrtonema in Fujian province and to screen suitable fungicides for its control. P.cyrtonema leaves showing typical anthracnose symptoms were collected， and the pathogens were isolated and purified. Identification was conducted using morphological characteristics， multilocus phylogenetic analysis of the ITS-CHS-GAPDH-ACT-TUB2 sequences， and pathogenicity tests. Furthermore， the indoor toxicities of four common fungicides against these pathogens were measured according to the mycelial growth rate. The results showed that a total of 86 strains were obtained and identified as Colletotrichum fructicola， C.karsti and C.spaethianum， with isolation frequencies of 67.44%， 11.63% and 20.93%， respectively， and the presence of compound infections. Indoor toxicity assays indicated that thiophanate-methyl 70% WP exhibited the best inhibitory effect on the three Colletotrichum species， with EC50 values for C.fructicola， C.karsti， and C.spaethianum of 0.381 mg/L， 0.105 mg/L， and 0.122 mg/L， respectively. Prochloraz 450 g/L EW was also effective， with EC50 values of 1.465 mg/L， 1.994 mg/L， and 2.261 mg/L， respectively， while pyraclostrobin 250 g/L EC exhibited a slightly lower inhibitory effect， with EC50 values of 10.232 mg/L， 3.899 mg/L， and 1.057 mg/L， respectively. These results highlighted significant variations in fungicide toxicity and sensitivity Colletotrichum species. In conclusion， C.fructicola， C.karsti and C.spaethianum were identified as the primary pathogens causing anthracnose in P.cyrtonema in Fujian， with C.fructicola as the dominant species. To our knowledge， this is the first report of C.karsti causing anthracnose on P.cyrtonema in China. The fungicides thiophanate-methyl 70% WP， prochloraz 450 g/L EW and pyraclostrobin 250 g/L EC are recommended for field control of anthracnose in P.cyrtonema in Fujian.

Key words

Polygonatum cyrtonema;" anthracnose disease;" pathogen identification;" fungicide screening

多花黃精Polygonatum cyrtonema Hua是百合科Liliaceae黃精屬Polygonatum多年生草本植物，為《中華人民共和國(guó)藥典》收錄的黃精屬3個(gè)品種之一［1］。隨著市場(chǎng)需求量的增加和野生資源的急劇下降，多花黃精在貴州、福建、湖南和安徽等地的規(guī)?；耘嗝娣e逐年增加［23］。由于種植面積不斷擴(kuò)大、種植年限不斷增加以及管理措施不當(dāng)?shù)仍?，炭疽病、葉枯病和莖腐病等病害的發(fā)生也日益加重［45］。特別是炭疽菌屬Colletotrichum真菌引起的炭疽病，發(fā)生較為普遍，可危害葉片、莖稈和果實(shí)，嚴(yán)重影響了多花黃精根莖的生長(zhǎng)和產(chǎn)量［67］。

炭疽菌屬是世界上最重要的致病性真菌屬之一，且種類多，已報(bào)道有600多種，許多作物的炭疽病常由復(fù)合種共同侵染引起［89］。因此，對(duì)引起炭疽病的病原物進(jìn)行準(zhǔn)確的分類和鑒定，是研究該病害并進(jìn)行有效防治的重要基礎(chǔ)。早期對(duì)炭疽菌屬的種類鑒定主要是基于形態(tài)學(xué)和生物學(xué)特征，但易受培養(yǎng)條件的影響而產(chǎn)生差異，從而存在一種多名或種類歸屬錯(cuò)誤的現(xiàn)象［1011］。而多位點(diǎn)基因序列分析能夠提供更準(zhǔn)確的鑒定依據(jù)，已成為鑒定炭疽病菌的重要方法，常用的基因有ITS （internal transcribed spacer）、ACT （actin）、CAL （calmodulin）、CHS-1 （chitin synthase-1）、GAPDH （glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase） 和TUB2 （β-tubulin 2）等［1213］。目前已報(bào)道的引起黃精屬植物炭疽病的病原菌有白蠟樹(shù)炭疽菌Colletotrichum spaethianum［7，1415］、松針炭疽菌C.fioriniae［16］、博寧炭疽菌C.boninense［1617］、膠孢炭疽菌C.gloeosporioides［1718］、果生炭疽菌C.fructicola［1718］、冬麥炭疽菌C.liriopes［18］、尖孢炭疽菌C.acutatum［17］和滇黃精炭疽菌C.kingianum［19］。鑒于引起黃精屬植物炭疽病的病原菌種類多樣，且未見(jiàn)福建地區(qū)多花黃精炭疽病的病原菌種類鑒定的報(bào)道，因此，明確該地區(qū)多花黃精炭疽病的病原菌種類，可為該病害的田間防控提供理論依據(jù)。

目前，針對(duì)作物炭疽病的防治以化學(xué)防治為主，我國(guó)已登記用于防治炭疽病的殺菌劑產(chǎn)品共有800多種，其中咪鮮胺登記產(chǎn)品數(shù)量最多，其次為苯醚甲環(huán)唑、代森錳鋅、吡唑醚菌酯、戊唑醇、多菌靈、百菌清和甲基硫菌靈等［20］。有報(bào)道指出，炭疽菌屬的不同種類除了在寄主、侵染方式和致病性上有差異，其對(duì)殺菌劑的敏感性上也存在差異［2122］。防治炭疽病殺菌劑登記作物有36種，主要以蔬菜、水果等經(jīng)濟(jì)作物為主，在中藥材上登記的數(shù)量較少，目前在農(nóng)藥信息網(wǎng)上僅查到30%唑醚·戊唑醇懸浮劑登記用于防治人參炭疽病，25%嘧菌酯懸浮劑、36%喹啉·戊唑醇懸浮劑、75%苯醚·咪鮮胺可濕性粉劑和25%咪鮮胺乳油登記用于防治鐵皮石斛炭疽病，20%苯甲·咪鮮胺水乳劑和30%肟菌酯懸浮劑登記用于防治枸杞炭疽病等［20，2324］。目前還未有殺菌劑登記用于多花黃精炭疽病的防治，且針對(duì)多花黃精炭疽病進(jìn)行殺菌劑篩選的相關(guān)研究較少，僅邱澤瀾等［15］對(duì)危害多花黃精的白蠟樹(shù)炭疽菌進(jìn)行了藥劑篩選，發(fā)現(xiàn)咪鮮胺和吡唑醚菌酯對(duì)該病原菌有較好的抑菌效果;但雨柔等［18，25］報(bào)道了咪鮮胺和大黃素甲醚等殺菌劑對(duì)松針炭疽菌有較好的抑菌作用，苯醚甲環(huán)唑和咪鮮胺對(duì)膠孢炭疽菌、果生炭疽菌和冬麥炭疽菌菌絲生長(zhǎng)有較強(qiáng)的抑制作用。但不同地區(qū)、不同寄主以及不同種類炭疽病菌對(duì)藥劑的敏感性都存在一定的差異。

因此，為明確引起福建省多花黃精炭疽病的病原菌及篩選其防治藥劑，本研究采集省內(nèi)多地的炭疽病癥狀病樣，分離純化獲得病原菌，并利用形態(tài)學(xué)特征、多位點(diǎn)基因序列分析和致病性測(cè)定對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定;同時(shí)通過(guò)菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定常用農(nóng)藥對(duì)分離出的代表性菌株

的室內(nèi)毒力，篩選出高效低毒的化學(xué)藥劑用于多花黃精炭疽病防治，以期為多花黃精的優(yōu)質(zhì)栽培提供技術(shù)支撐。

1" 材料與方法

1.1" 試驗(yàn)材料

供試病樣：多花黃精種植基地的炭疽病葉片樣品采自福建省南平市光澤縣（117°15′E，27°55′N）、寧德市柘榮縣（119°49′E，27°15′N）和漳州市南靖縣（117°10′E，24°35′N）等地。

供試植株：兩年生長(zhǎng)葉多花黃精，購(gòu)買(mǎi)自福建省邵武市御草農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA），馬鈴薯200 g、葡萄糖15 g、瓊脂18 g，定容至1 000 mL。合成低營(yíng)養(yǎng)固體培養(yǎng)基（SNA）， KH2PO4 1.0 g、KNO31.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KCl 0.5 g、葡萄糖0.2 g、蔗糖0.2 g、Noble瓊脂15 g， 定容至1 000 mL。

化學(xué)殺菌劑： 250 g/L吡唑醚菌酯乳油（pyraclostrobin 250 g/L EC）購(gòu)自巴斯夫歐洲公司;70%甲基硫菌靈可濕性粉劑（thiophanate-methyl 70% WP）購(gòu)自江蘇省江陰市農(nóng)藥二廠有限公司;430 g/L戊唑醇懸浮劑（tebuconazole 430 g/L SC）購(gòu)自安徽華星化工有限公司;450 g/L咪鮮胺水乳劑（prochloraz 450 g/L EW）購(gòu)自濟(jì)南一農(nóng)化工有限公司。

試劑及儀器： 真菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自百泰克生物科技有限公司，2×Taq Master Mix購(gòu)自福州尚亞生物技術(shù)有限公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。C1000型PCR儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司，DYY-6C型電泳儀購(gòu)自北京六一儀器廠，LMS-26 凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)UVP公司，BX43型光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司。

1.2" 方法

1.2.1" 多花黃精炭疽病田間癥狀觀察

2022年-2023年，對(duì)福建省內(nèi)感染炭疽病的多花黃精的葉片進(jìn)行癥狀觀察。

1.2.2" 多花黃精炭疽病病原菌的分離與形態(tài)學(xué)鑒定

病原菌的分離： 取具有典型癥狀的多花黃精病葉樣本， 在病健交界處切取5 mm×5 mm組織， 于75%乙醇中浸泡處理30 s進(jìn)行表面消毒， 隨后用1%次氯酸鈉溶液消毒3 min， 取出組織用無(wú)菌蒸餾水沖洗3次， 置于無(wú)菌濾紙上吸干水分并轉(zhuǎn)移至含200 μg/mL的硫酸鏈霉素的PDA培養(yǎng)基上， 每皿放5片， 于25℃黑暗條件下培養(yǎng)3～4 d至組織塊周?chē)L(zhǎng)出菌絲。從不同組織樣本的分離物中分別隨機(jī)選擇5～10個(gè)代表性菌落， 挑取菌落邊緣少量菌絲于新的PDA平板上培養(yǎng)5～7 d， 并經(jīng)單孢分離后純化培養(yǎng)2次。挑取二次純化的培養(yǎng)物于含20%甘油的培養(yǎng)基中， 并保存于-80℃超低溫冰箱。

病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定： 用直徑5 mm的無(wú)菌打孔器在菌落外圈打取菌餅， 并接種于新的PDA 培養(yǎng)基中央， 于28℃黑暗培養(yǎng)7 d， 觀察并記錄菌落顏色和形態(tài)， 測(cè)定菌落直徑， 計(jì)算菌落生長(zhǎng)速度， 每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。待菌落上產(chǎn)生分子孢子團(tuán)后， 挑取少量分生孢子制備玻片置于顯微鏡下觀察其形態(tài)。針對(duì)在PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量少的菌株采用SNA培養(yǎng)基培養(yǎng)， 于28℃暗培養(yǎng)5 d。觀察記錄孢子的形態(tài)特征并測(cè)量其大小（n=30）。依據(jù)菌落形態(tài)和色澤， 結(jié)合孢子形態(tài)將分離物進(jìn)行分類整理。

1.2.3" 多花黃精炭疽病病原菌的分子鑒定

取培養(yǎng)7 d的菌絲體參照真菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行菌株總DNA提取。采用引物ITS1/ITS4［26］、ACT-512F/ACT-783R［27］、T1/Bt2b［28］、GDF1/GDR1［29］和CHS-79F/CHS-234R［27］進(jìn)行PCR 擴(kuò)增， 各序列擴(kuò)增引物信息見(jiàn)表1。PCR 反應(yīng)體系總體積為25 μL： DNA 模板1.5 μL， 正、反向引物各1 μL （10 μmol/L）， 2×Taq Master Mix 12.5 μL， 加ddH2O 補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件為： 94℃預(yù)變性5 min;94℃變性45 s， （ITS 55℃， ACT 56℃， TUB2 62℃， GAPDH 54℃， CHS 58℃）退火30 s， 72℃延伸1 min， 共35 個(gè)循環(huán);最后72℃延伸7 min。取5 μL各菌株的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后， 條帶大小符合要求的樣品委托福州尚亞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。將不同基因測(cè)得的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列比對(duì)和同源性分析， 并將序列提交至NCBI獲得登錄號(hào)。下載同種及其近緣種的相關(guān)序列， 使用DNAMAN軟件和MEGA 7.0軟件剪切后按照ITS-GAPDH-TUB2-CHS-ACT的順序編輯和連接， 并采用最大似然法（maximum likelihood， ML）構(gòu)建菌株的多基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)， bootstrap值設(shè)為1 000［30］。

1.2.4" 多花黃精炭疽病病原菌的致病性測(cè)定

根據(jù)上述病原菌鑒定結(jié)果， 從不同類型的菌株中各選擇3個(gè)代表性菌株進(jìn)行致病性測(cè)定。將選出的菌株于PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)7 d后打取直徑為5 mm的菌餅。選取健康多花黃精植株的葉片經(jīng)75%乙醇表面消毒后， 采用接種針?lè)謩e在葉脈兩側(cè)的上下部位進(jìn)行刺傷， 將菌餅的菌絲面貼于傷口處， 覆上濕潤(rùn)脫脂棉， 保鮮膜包裹48 h， 定期施以等量無(wú)菌水保濕。以接種無(wú)菌PDA 餅為對(duì)照。接種植株放于25℃、相對(duì)濕度80%、光照周期L∥D=12 h∥12 h條件下保濕培養(yǎng)。48 h后去除脫脂棉， 逐日觀察葉片發(fā)病情況。依據(jù)柯赫氏法測(cè)， 待其發(fā)病后進(jìn)行病原菌的再分離， 并鑒定分離到的培養(yǎng)物性狀是否與接種的原始菌株相同。

1.2.5" 殺菌劑對(duì)病原菌的室內(nèi)毒力測(cè)定

選擇上述鑒定為不同種類炭疽病菌的強(qiáng)致病性

菌株各1株為靶標(biāo)菌， 采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定4種殺菌劑對(duì)病原菌的抑菌率。將各供試殺菌劑配制成一系列濃度梯度的備用藥劑， 然后用0.45 μm的無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾后備用。待加熱滅菌后的PDA 培養(yǎng)基冷卻至50℃時(shí)加入各濃度梯度藥劑， 充分搖勻后制成各殺菌劑的不同濃度含藥平板， 最終質(zhì)量濃度梯度見(jiàn)表2。以不加藥劑加入等量無(wú)菌水的PDA 平板作為對(duì)照， 每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。用孔徑為5 mm的打孔器在培養(yǎng)7 d的菌落邊緣打取菌餅， 接種至PDA平板中央， 置于28℃條件下黑暗培養(yǎng)7 d， 然后用十字交叉法測(cè)量各處理的菌落直徑， 計(jì)算各殺菌劑菌絲生長(zhǎng)抑制率。生長(zhǎng)抑制率=（對(duì)照菌落直徑-藥劑處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑）×100%。采用DPS 20.05軟件進(jìn)行毒力回歸方程擬合，并進(jìn)行抑制中濃度EC50、95%置信限、卡方值（χ2）和P值的計(jì)算。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 多花黃精炭疽病的田間癥狀

在福建省內(nèi)多地的調(diào)查發(fā)現(xiàn)， 炭疽病菌可危害多花黃精的葉片， 4月份開(kāi)始發(fā)病， 6月-9月尤為嚴(yán)重， 雨后病情加重。發(fā)病初期， 在葉尖、葉緣出現(xiàn)圓形或不規(guī)則病斑， 隨著病情發(fā)展， 病斑逐漸擴(kuò)大， 病斑呈灰白色、灰褐色或紅褐色， 中央灰白色、凹陷或穿孔， 周?chē)忻黠@的黃色暈圈;潮濕條件下， 病斑上會(huì)出現(xiàn)不同形態(tài)的分生孢子盤(pán)， 散狀分布或輪紋狀分布;部分葉片邊緣出現(xiàn)黃化、卷曲（圖1a～i）。

2.2" 多花黃精炭疽病病原菌的分離與形態(tài)學(xué)鑒定

從不同癥狀病害樣品中共純化保存菌株86株， 根據(jù)菌落形態(tài)、分生孢子等特征初步判定有3種類型的炭疽病菌。第1種類型的菌株在PDA培養(yǎng)基上， 菌落圓形較扁平， 氣生菌絲發(fā)達(dá)， 絨毛狀， 中心灰色至深灰色， 邊緣灰白色。背面中間灰綠色，邊緣灰白色。培養(yǎng)后期， 培養(yǎng)基上會(huì)產(chǎn)生黑褐色分生孢子團(tuán)（圖2a～b）。生長(zhǎng)至7 d時(shí)的菌落平均直徑為8.5 cm。分生孢子光滑、無(wú)色透明， 單孢， 呈棒形或圓柱形， 頂端鈍圓， 大小為16.68（12.01～20.24）μm×5.57（4.63～6.62）μm（n=30）（圖2c）。形態(tài)學(xué)特征與果生炭疽菌Colletotrichum fructicola相似［18，31］。

第2種類型的菌株在PDA培養(yǎng)基上， 菌落圓形， 呈淺粉色， 邊緣整齊， 氣生菌絲發(fā)達(dá)， 絨毛狀;背面淺黃色;培養(yǎng)后期會(huì)產(chǎn)生淺橙色至橘紅色的分生孢子團(tuán)（圖3a～b）。生長(zhǎng)至7 d時(shí)的菌落平均直徑為6.5 cm。分生孢子無(wú)色透明， 單胞， 較直， 圓柱狀， 兩端鈍圓， 大小為15.23（12.66～17.93）μm×8.29（6.88～10.38）μm（n=30）（圖3c）。形態(tài)學(xué)特征與喀斯特炭疽菌C.karsti相似［32］。

第3種類型的菌株在PDA培養(yǎng)基上菌落圓形， 邊緣整齊， 菌絲初期呈白色， 培養(yǎng)后期菌落中間呈灰色至灰黑色， 氣生菌絲發(fā)達(dá)， 絨毛狀;背面中央黑色， 有黑色色素， 邊緣呈白色至灰色， 培養(yǎng)后期會(huì)產(chǎn)生黑灰色分生孢子團(tuán)（圖4a～b）。生長(zhǎng)至7 d時(shí)的菌落平均直徑為8.7 cm。分生孢子單胞， 無(wú)色， 月牙形， 兩端略尖， 大小為15.35（8.87～21.81）μm×4.22（2.99～5.06）μm（n=30）（圖4c）。形態(tài)學(xué)特征與白蠟樹(shù)炭疽菌C.spaethianum相似［19］。

2.3" 多花黃精炭疽病病原菌的分子鑒定

86株菌株經(jīng)ITS、CHS-1、GAPDH、ACT和TUB2這5個(gè)基因擴(kuò)增測(cè)序比對(duì)結(jié)果表明：第1種類型的菌株與果生炭疽菌C.fructicola的一致性達(dá)99%以上;第2種類型的菌株與喀斯特炭疽菌C.karsti一致性達(dá)99%以上;第3種類型的菌株與白蠟樹(shù)炭疽菌C.spaethianum一致性達(dá)99%以上。從3種類型菌株中分別選擇3個(gè)代表性菌株的序列提交至GenBank獲得登錄號(hào)（表3）。9個(gè)代表性菌株的5個(gè)基因序列與從GenBank中下載得到的16個(gè)模式菌株或公認(rèn)菌株相應(yīng)的序列（表3），采用最大似然法構(gòu)建的多基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖5所示，菌株FJAT-33037、FJAT-33106和FJAT-33112與果生炭疽菌CBS125397和CBS130416處于同一分支，支持率為99%;菌株FJAT-33043、FJAT-33059和FJAT-33061與喀斯特炭疽菌CBS128524和CBS132134處于同一分支，支持率為99%;菌株FJAT-33116、FJAT-33117和FJAT-33118與白蠟樹(shù)炭疽菌CBS100063和CBS167.49處于同一分支，支持率為100%?；谛螒B(tài)學(xué)特征及多基因系統(tǒng)發(fā)育分析，確定這3種類型的病原菌依次為果生炭疽菌、喀斯特炭疽菌和白蠟樹(shù)炭疽菌，各類型的菌株分離頻率依次為67.44%、11.63%和20.93%，且存在復(fù)合侵染現(xiàn)象。

2.4" 多花黃精炭疽病菌的致病性

致病性測(cè)定結(jié)果表明， 3種類型的9個(gè)代表性炭疽病菌菌株對(duì)多花黃精均有致病作用， 接種后的葉片發(fā)病率均為100%。接種6 d時(shí)葉片出現(xiàn)褐色的圓形或不規(guī)則病斑， 病斑周?chē)霈F(xiàn)黃色暈圈;接種10 d時(shí)， 隨著病情加重， 病斑中央呈薄膜狀， 病斑范圍逐漸擴(kuò)大;接種14 d時(shí)， 病斑中央凹陷或穿孔， 周?chē)⑸『邳c(diǎn)（圖6a～c）， 該癥狀與田間植株葉片的發(fā)病癥狀相似;從回接發(fā)病組織獲得的培養(yǎng)物與接種病原菌的形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)特征一致。空白對(duì)照組接種的葉片均不發(fā)病， 僅在傷口刺傷處有輕微褐色生理性壞死（圖6d）。根據(jù)柯赫氏法則確定接種的果生炭疽菌、喀斯特炭疽菌和白蠟樹(shù)炭疽菌的代表性菌株均為多花黃精炭疽病的致病菌， 且果生炭疽菌的致病性更強(qiáng)。

接種后的發(fā)病癥狀與自然發(fā)病癥狀一致， 再次從接種后發(fā)病部位進(jìn)行病原分離， 獲得菌株的形態(tài)特征與原來(lái)的菌株相同。

2.5" 殺菌劑對(duì)病原菌的室內(nèi)毒力

殺菌劑的室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果表明（表4）， 4種殺菌劑對(duì)3種炭疽病菌代表性菌株（果生炭疽菌FJAT-33112、喀斯特炭疽菌FJAT-33059和白蠟樹(shù)炭疽菌FJAT-33117）的毒力差異較大， 且不同種類的炭疽菌對(duì)殺菌劑的敏感性存在差異。其中， 70%甲基硫菌靈可濕性粉劑對(duì)侵染多花黃精的3種炭疽菌的抑菌效果均最佳， EC50均最低， 對(duì)果生炭疽菌、

喀斯特炭疽菌和白蠟樹(shù)炭疽菌的EC50分別為0.381、0.105 mg/L和0.122 mg/L;其次為450 g/L咪鮮胺水乳劑， 對(duì)果生炭疽菌、喀斯特炭疽菌和白蠟樹(shù)炭疽菌的EC50分別為1.465、1.994 mg/L和2.261 mg/L;250 g/L吡唑醚菌酯乳油對(duì)3種炭疽病菌的抑制效果略差， EC50分別為10.232、3.899 mg/L和1.057 mg/L;最差的為430 g/L戊唑醇懸浮劑， 對(duì)這3種炭疽病菌的EC50依次為33.436、9.482 mg/L和9.201 mg/L。因此， 多花黃精炭疽病的田間防治時(shí)， 可用70%甲基硫菌靈可濕性粉劑、450 g/L咪鮮胺水乳劑和250 g/L吡唑醚菌酯乳油在田間輪換使用， 以免產(chǎn)生抗藥性。

3" 結(jié)論與討論

炭疽菌屬是重要的植物致病性真菌，其種類多樣，常以復(fù)合種共同侵染果樹(shù)、蔬菜和茶樹(shù)等眾多經(jīng)濟(jì)作物引起炭疽病并造成嚴(yán)重產(chǎn)量損失［3335］。本研究通過(guò)形態(tài)學(xué)特征，結(jié)合ITS-CHS-GAPDH-ACT-TUB2等多基因的序列遺傳分析，明確了引起福建省多花黃精炭疽病的病原菌為果生炭疽菌C.fructicola、喀斯特炭疽菌C.karsti和白蠟樹(shù)炭疽菌C.spaethianum，分離頻率依次為67.44%、11.63%和20.93%，且存在復(fù)合侵染現(xiàn)象，其中果生炭疽菌是引起福建多花黃精炭疽病的優(yōu)勢(shì)種，喀斯特炭疽菌可引起多花黃精炭疽病為首次發(fā)現(xiàn)。已有的研究報(bào)道表明，果生炭疽菌是茶樹(shù)和滇黃精炭疽病的優(yōu)勢(shì)種［13，17］。但雨柔等［18］的研究表明，膠孢炭疽菌是引起重慶地區(qū)多花黃精炭疽病的優(yōu)勢(shì)種。白蠟樹(shù)炭疽菌可引起安徽和湖南地區(qū)的多花黃精炭疽?。?，1415］。前述研究表明，不同地區(qū)的多花黃精炭疽病病原菌的種類有差異，且優(yōu)勢(shì)種也有所不同。喀斯特炭疽菌曾被報(bào)道可以引起百香果、紫山藥和薄荷等作物的炭疽病［3638］。喀斯特炭疽菌作為多花黃精上新發(fā)現(xiàn)的炭疽病致病菌，其對(duì)不同黃精品種的致病性和發(fā)生規(guī)律還待進(jìn)一步研究。

本研究的室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果表明70%甲基硫菌靈可濕性粉劑、450 g/L咪鮮胺水乳劑和250 g/L吡唑醚菌酯乳油對(duì)分離自福建省多花黃精的3種炭疽病菌均具有良好的抑制效果，但毒力差異較大，且不同種類炭疽菌對(duì)殺菌劑的敏感性存在差異。70%甲基硫菌靈可濕性粉劑對(duì)3種多花黃精炭疽菌的抑菌效果均為最佳。甲基硫菌靈是一種廣譜內(nèi)吸性苯并咪唑類殺菌劑，對(duì)許多作物炭疽病具有預(yù)防和治療作用［3940］。450 g/L咪鮮胺水乳劑對(duì)本研究分離的3種多花黃精炭疽菌的抑菌效果次之，咪鮮胺為咪唑類殺菌劑，屬于脫甲基化酶抑制劑類（DMI）殺菌劑，在防治炭疽病的藥劑中占有極其重要的地位［20］。相關(guān)的研究也表明，咪鮮胺對(duì)多花黃精炭疽菌的不同種類有較好的抑菌效果［15，18，25］。250 g/L吡唑醚菌酯乳油對(duì)本研究分離的白蠟樹(shù)炭疽菌、喀斯特炭疽菌和果生炭疽菌的抑菌效果差異較大， EC50依次為1.057、3.899 mg/L和10.232 mg/L。吡唑醚菌酯屬于甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，是新型廣譜殺菌劑，主要作用于真菌線粒體，抑制真菌的呼吸，使其生長(zhǎng)受到抑制甚至停止生長(zhǎng)，也被廣泛用于作物炭疽病的防治［4142］。但是，吡唑醚菌酯作用位點(diǎn)單一，抗藥性問(wèn)題也頻繁出現(xiàn)［4344］。本研究證實(shí)了果生炭疽菌是引起福建多花黃精炭疽病的優(yōu)勢(shì)種，在田間防治的過(guò)程中，可能由于用藥次數(shù)累積，使得該菌對(duì)吡唑醚菌酯的敏感性下降。

藥劑的田間防治效果除了與室內(nèi)抑菌活性有關(guān)之外，還與藥劑的作用方式、吸收傳導(dǎo)活性、持效期等因素有關(guān)［17］。而且，本研究分離獲得的3種炭疽菌對(duì)殺菌劑的敏感性存在差異，因此，在多花黃精炭疽病的大田應(yīng)用中應(yīng)明確病原菌的優(yōu)勢(shì)種，及時(shí)調(diào)整施藥方案，精準(zhǔn)防治，提高防治效果，并采取多種藥劑輪換使用以降低病原菌的抗藥性。本研究篩選到的殺菌劑對(duì)黃精炭疽病的田間防治效果，還需要開(kāi)展進(jìn)一步的田間小區(qū)藥效試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。

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（責(zé)任編輯：田" 喆）