裂褶菌HJ-18發(fā)酵濾液對三線鐮刀菌的抑菌機(jī)理研究

摘要

花椒流膠病是危害花椒植株的主要病害之一，嚴(yán)重影響花椒的品質(zhì)和產(chǎn)量。三線鐮刀菌Fusarium tricinctum是引起花椒流膠病的主要病原菌。本研究利用裂褶菌Schizophyllum commune HJ-18的發(fā)酵濾液，探討其對三線鐮刀菌生長發(fā)育、細(xì)胞壁完整性、細(xì)胞膜通透性、活性氧代謝以及抗氧化酶活性的影響。結(jié)果表明，經(jīng)裂褶菌菌株HJ-18發(fā)酵濾液處理后，三線鐮刀菌的生物量和產(chǎn)孢量分別顯著降低18.84%（第7天）和35.81%（第7天）;堿性磷酸酶活性和幾丁質(zhì)酶活性分別比對照組高73.66% （12 h）和24.63% （12 h）;電導(dǎo)率比對照組高1.48倍（36 h），蛋白質(zhì)和核酸等大分子物質(zhì)泄漏，在處理36 h時胞外蛋白質(zhì)和核酸含量比對照組高85.94%和64.54%，處理12 h MDA含量是對照組的1.2倍;此外，處理后期產(chǎn)生O-2能力較對照顯著降低39.19% （36 h）， H2O2的含量比對照組高88% （36 h）;SOD活性比對照組低36.61% （12 h）， CAT、POD活性較對照組分別增加55.84% （36 h）和141.7% （36 h）。綜上所述，菌株HJ-18發(fā)酵濾液抑制三線鐮刀菌的機(jī)理可能是抑制其生長發(fā)育，破壞細(xì)胞壁完整性和細(xì)胞膜通透性影響活性氧代謝、抗氧化酶活性。

關(guān)鍵詞

花椒流膠病;" 裂褶菌;" 三線鐮刀菌;" 生防效果;" 抑菌機(jī)理

中圖分類號：

S 432.4

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：" A

DOI：" 10.16688/j.zwbh.2024073

收稿日期：" 20240204""" 修訂日期：" 20240325

基金項目：

甘肅省科技重大專項計劃（23ZDNA002）

致" 謝：" 參加本試驗(yàn)部分工作的還有江代禮、譚翰杰、張能和紀(jì)燁斌等同學(xué)，特此一并致謝。

* 通信作者

E-mail：

hejing268@aliyun.com

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為并列第一作者

Antifungal mechanism of fermentation filtrate of Schizophyllum commune HJ-18 against Fusarium tricinctum

YAN Yuke1，" ZHAO Jitao1，" HE Jing1，2*，" WANG Bin1，" CHEN Wei1，" LI Nan1，LI Ruiyun1，" ZHANG Chongqing1，" WANG Yupeng1

（1. Forestry College of Gansu Agricultural University， Lanzhou" 730070， China; 2. Gansu Province Wolfberry

Harmless Cultivation Engineering Research Center， Lanzhou" 730070， China）

Abstract

Gummosis of Zanthoxylum is one of the main diseases of Zanthoxylum plants， which seriously harms the quality and yield of pepper. Fusarium tricinctum is the main pathogen causing gummosis. In this study， the fermentation filtrate of Schizophyllum commune HJ-18 was used to investigate its effects on the growth and development， cell wall integrity， cell membrane permeability， reactive oxygen species metabolism and antioxidant enzymes activities of F.tricinctum. The results showed that treatment with the fermentation filtrate of HJ-18 significantly reduced the biomass and sporulation of F. tricinctum by 18.84% （7th day） and 35.81% （7th day）， respectively. Alkaline phosphatase activity and chitinase activity were 73.66% （12 h） and 24.63% （12 h） higher than those in the control group， respectively. Conductivity was 1.48 times （36 h） higher than that in the control group， and the macromolecules， such as proteins and nucleic acids leaked， with an increased content of 85.94% and 64.54% in extracelluar compared to the control 36 h after treatment. The MDA content was 1.2 times of the control group （12 h）. In addition， in the late-stage of treatment a 39.19% （36 h） reduction in O-2-producing levels compared to the control was observed， while the content of H2O2 increased by 88% （36 h）. The activity of SOD was 36.61% （12 h） lower than that in the control group， whereas the activities of CAT and POD increased by 55.84% （36 h） and 141.7% （36 h）， respectively. In summary， the antifungal mechanism of the HJ-18 fermentation filtrate may involve inhibiting the growth of F.tricinctum， disrupting cell wall integrity， and affecting reactive oxygen species metabolism and antioxidant enzyme activity.

Key words

gummosis of Zanthoxylum;" Schizophyllum commune;" Fusarium tricinctum;" biocontrol effect;antifungal mechanism

花椒屬蕓香科Rutaceae、花椒屬Zanthoxylum落葉小喬木， 是我國重要的經(jīng)濟(jì)樹種之一［1］?；ń肪哂辛己檬秤脙r值和藥用價值。在林業(yè)中， 由于其具有收益早、用途廣、價值高及較強(qiáng)的適應(yīng)性， 常作為我國一些地區(qū)的主要經(jīng)濟(jì)、抗旱和水土保持樹種［23］。

花椒流膠病， 又稱黑脛病， 是危害花椒植株的主要病害之一， 三線鐮刀菌Fusarium tricinctum是引起花椒流膠病的主要病原菌［4］。該病害主要發(fā)生在植株莖的基部［5］，在發(fā)病初期能夠迅速引起樹干莖基部壞死或產(chǎn)生琥珀色膠狀物， 嚴(yán)重阻礙樹體正常的營養(yǎng)運(yùn)輸。發(fā)病后期， 樹皮大面積發(fā)黑， 出現(xiàn)大量黃化葉片， 枝干干枯直至樹體死亡， 并可能會引起周圍健康花椒植株甚至造成整園花椒的大面積感病。長期以來， 花椒流膠病的防治主要采取化學(xué)手段， 但傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥不僅破壞環(huán)境， 還會使病原菌產(chǎn)生一定的耐藥性， 使得該病害的防治難度增加。與化學(xué)防治相比， 生物防治是一種綠色、環(huán)保且有效的植物病害防治策略， 近年來已成為研究熱點(diǎn)。

植物內(nèi)生真菌資源豐富， 具有巨大的開發(fā)價值和研究潛力［6］。內(nèi)生真菌通過產(chǎn)生一些具有生物活性的次級代謝產(chǎn)物， 形成不利于病原菌生長的環(huán)境， 起到抑制病原菌生長的作用。從東鄉(xiāng)野生稻中分離得到的內(nèi)生放線菌菌株Streptomyces sp. PRh5的代謝物對小麥赤霉病菌 Fusarium graminearum、芝麻枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp. sesami等多種病原真菌均具有良好的抑菌活性［7］。從越南槐Sophora tonkinensis根系中獲得的內(nèi)生真菌曲霉菌Aspergillus sp. JXRPH-20的次級代謝產(chǎn)物對植物病原真菌腐皮鐮刀菌Fusarium solani、膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides、人參鏈格孢Alternaria panax均具有較強(qiáng)的抑制作用， 抑制率可達(dá)50%以上［8］?！Ｂ荨夯╕ulania denudata ‘Hailuo’內(nèi)生真菌絲枝蠟蚧菌Lecanicillium aphanocladii EF-WCH-51的發(fā)酵液粗提物對葫蘆科刺盤孢Colletotrichum orbiculare菌絲生長具有較強(qiáng)抑制作用［9］。我們前期從花椒植株中分離到一株對花椒流膠病具有生防效果的內(nèi)生真菌， 經(jīng)鑒定為裂褶菌Schizophyllum commune， 進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)其對花椒流膠病主要病原菌三線鐮刀菌Fusarium tricinctum具有明顯的抑制作用， 但其抑制機(jī)理尚不明確［4］。裂褶菌屬裂褶菌科Schizophyllaceae、裂褶菌屬Schizophyllum真菌［10］， 是一種兼性寄生真菌。有研究報道， 裂褶菌蛋白粗提液對煙草花葉病毒（tobacco mosaic virus， TMV）和黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus， CMV）增殖具有較好的抑制作用［11］。裂褶菌G18的粗提物對藍(lán)莓根腐病菌尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum有明顯的抑制作用， 并且對藍(lán)莓根腐病的盆栽防效良好［12］。目前雖然已有關(guān)于裂褶菌作為生防菌株的報道， 但相關(guān)研究很少， 且其發(fā)酵液對花椒流膠病病原菌的抑制作用及機(jī)理尚未見報道。

本研究以裂褶菌菌株HJ-18為研究對象， 通過測定其發(fā)酵濾液處理對三線鐮刀菌菌絲生長發(fā)育、細(xì)胞壁完整性、細(xì)胞膜通透性， 活性氧積累以及抗氧化酶活性的影響， 揭示其可能的抑菌機(jī)理， 為裂褶菌的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1" 材料與方法

1.1" 試驗(yàn)材料

1.1.1" 供試菌株

菌株HJ-18從健康的花椒植株中分離得到， 通過形態(tài)學(xué)方法和分子生物學(xué)方法鑒定為裂褶菌［4］;三線鐮刀菌經(jīng)分離和致病性回接確定為花椒流膠病病原真菌， 在實(shí)驗(yàn)室保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2" 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基： 馬鈴薯200 g， 葡萄糖20 g， 瓊脂16 g， 蒸餾水1 000 mL。

PDB培養(yǎng)基： 馬鈴薯200 g， 葡萄糖20 g， 蒸餾水1 000 mL。

1.2" 試驗(yàn)方法

1.2.1" 發(fā)酵濾液和含藥培養(yǎng)基的制備

將裝有PDB培養(yǎng)基的150 mL錐形瓶（每瓶裝液75 mL）高溫滅菌30 min。待冷卻后， 向每個錐形瓶中接種5個直徑為6 mm活化的裂褶菌菌株HJ-18菌餅， 置于恒溫?fù)u床（25℃、160 r/min）中培養(yǎng)7 d， 將發(fā)酵液于4℃、9 027 g條件下離心10 min， 取上清液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾3次， 得到發(fā)酵濾液。

將無菌發(fā)酵濾液與冷卻至50℃左右的PDA培養(yǎng)基按體積比1∶9的比例混勻，倒入無菌培養(yǎng)皿制成固體含藥平板， 以不加發(fā)酵濾液的PDA培養(yǎng)基為對照， 每處理 3個重復(fù)。

1.2.2" 裂褶菌菌株HJ-18發(fā)酵濾液對三線鐮刀菌生長和產(chǎn)孢的影響

生物量的測定采用固體培養(yǎng)基玻璃紙培養(yǎng)菌絲的方法，將面積一致的滅菌玻璃紙鋪在含藥PDA平板上， 在平板中央接種2 μL濃度為 1×106 個/mL的三線鐮刀菌孢子懸浮液， 于28℃黑暗條件下培養(yǎng)， 分別于3、5、7 d 后稱取菌絲重量。

產(chǎn)孢量測定參照 Zhang等［13］的方法并稍作修改， 在含藥PDA平板上接種2 μL濃度為1×106 個/mL的三線鐮刀菌孢子懸浮液于PDA平板中央， 28℃黑暗條件下分別培養(yǎng)3、5、7 d。在培養(yǎng)好的平板中加入10 mL無菌水， 滅菌涂布器輕輕刮下PDA平板上的孢子， 4層無菌紗布過濾， 用血球計數(shù)板統(tǒng)計分生孢子數(shù)量。

1.2.3" 裂褶菌HJ-18發(fā)酵液對三線鐮刀菌細(xì)胞膜、活性氧代謝及抗氧化酶活性的影響

1.2.3.1" 三線鐮刀菌菌絲體樣品制備

用10 mL無菌水沖洗已在PDA上25℃培養(yǎng)7 d的三線鐮刀菌菌絲，沖洗后用無菌紗布過濾， 將含有孢子的渾濁液移至10 mL離心管， 5 777 g離心10 min后， 將孢子濃度稀釋至1×106 個/mL。

將200 μL三線鐮刀菌孢子懸浮液加入75 mL的PDB液體培養(yǎng)基中， 于25℃， 160 r/min振蕩培養(yǎng)， 48 h后， 用紗布過濾培養(yǎng)液， 并用無菌水沖洗3～4次， 獲得菌絲體。準(zhǔn)確稱取0.5 g菌絲體， 加入到30 mL含10% 裂褶菌發(fā)酵濾液的PDB培養(yǎng)基中， 以不加入發(fā)酵濾液的培養(yǎng)基為對照， 每個樣品3個重復(fù)， 經(jīng)25℃， 160 r/min振蕩培養(yǎng)0、3、6、9、12、24、36 h后， 收集三線鐮刀菌菌絲體。準(zhǔn)確稱取0.1 g菌絲體， 用于指標(biāo)的測定。

1.2.3.2" HJ-18發(fā)酵濾液對三線鐮刀菌細(xì)胞壁完整性的影響

堿性磷酸酶（AKP）

是位于細(xì)胞壁和細(xì)胞膜之間的磷酸單酯酶，測定AKP活性可以了解細(xì)胞壁的完整性［14］。

其活性使用微生物AKP試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司， YJ455535）進(jìn)行測定。準(zhǔn)確稱取三線鐮刀菌菌絲0.1 g加入0.9 mL NaCl溶液冰浴條件下進(jìn)行勻漿， 3 000 g、4℃條件下離心10 min， 取上清液按試劑盒說明書

測定上清液在450 nm處的吸光度，

以每升反應(yīng)體系中每分鐘吸光度值變化0.01定義為一個酶活力單位（U），

AKP活性單位為U/L。

幾丁質(zhì)酶屬于細(xì)胞壁降解酶，拮抗菌可通過

提升病菌體內(nèi)的幾丁質(zhì)酶活性來破壞病菌的細(xì)胞壁

［15］。

幾丁質(zhì)酶活性使用微生物chitinase試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司， YJ925625）進(jìn)行測定， 與堿性磷酸酶測定方法一致， 用酶標(biāo)儀測定上清液在450 nm處的吸光度。以每升反應(yīng)體系中每分鐘吸光度值變化0.01定義為一個酶活力單位（U），活性單位為U/L。

1.2.3.3" HJ-18發(fā)酵濾液對三線鐮刀菌細(xì)胞膜通透性的影響

電導(dǎo)率的測定：準(zhǔn)確稱取三線鐮刀菌0.1 g加入含1 mL發(fā)酵濾液的10 mL PDB中， 以加同體積的無菌水為對照， 用便攜式電導(dǎo)儀測定電導(dǎo)率。

蛋白質(zhì)和核酸含量的測定：準(zhǔn)確稱取三線鐮刀菌0.1 g加入10 mL無菌水中， 離心后取上清液測定在280 nm、260 nm處的吸光度。分別用OD280和OD260表示蛋白質(zhì)和核酸的相對含量。

丙二醛含量的測定：準(zhǔn)確稱取三線鐮刀菌0.1 g， 加入少量三氯乙酸（10%）研磨成漿， 定容至2 mL， 9 027 g， 4℃條件下離心20 min后， 測定上清液分別在450、532、600 nm處的吸光度， 計算MDA含量，單位為mmol/g。

1.2.3.4" HJ-18發(fā)酵濾液對三線鐮刀菌活性氧累積的影響

蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法使用試劑盒（南京建成生物工程研究所， A045-2）進(jìn)行測定。準(zhǔn)確稱取待測菌體0.1 g加入0.9 mL PBS（pH 7.0～7.4， 0.1 mol/L）溶液， 冰浴條件下勻漿， 9 027 g、4℃離心10 min， 取上清液按試劑盒說明書加入試劑混勻， 測定在595 nm處的吸光度。計算蛋白含量，單位為g/L。

產(chǎn)生超氧陰離子（O-2）能力使用試劑盒（南京建成生物工程研究所， A052-1-1）進(jìn)行測定。準(zhǔn)確稱取待測菌體0.1 g加入0.9 mL PBS（pH 7.0～7.4， 0.1 mol/L）溶液冰浴條件下進(jìn)行勻漿， 9 027 g、4℃下離心10 min， 取上清液按試劑盒說明書加入試劑，混勻， 10 min后測定在550 nm的吸光度。

每克蛋白在37℃反應(yīng)10 min所產(chǎn)生的O-2相當(dāng)于1 mg維生素C所抑制的O-2的變化值為一個活力單位（U），

單位為U/g。

過氧化氫（H2O2）含量使用試劑盒（南京建成生物工程研究所， A064-1-1）進(jìn)行測定。稱取待測菌體0.1 g加入 0.9 mL PBS（pH 7.0～7.4， 0.1 mol/L）緩沖液冰浴條件下進(jìn)行勻漿， 9 027 g、4℃下離心10 min，取上清液按試劑盒說明書加入試劑混勻， 測定在405 nm處的吸光度。

H2O2含量單位為mmol/g。

1.2.3.5" HJ-18發(fā)酵濾液對三線鐮刀菌抗氧化酶活性的影響

準(zhǔn)確稱取三線鐮刀菌0.1 g， 置于冰冷研缽， 加入2 mL提取液， 迅速研磨， 將勻漿液定容至10 mL，4℃， 9 027 g離心20 min， 得上清液，用于超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）活性的測定。

SOD活性測定采用分光光度法。反應(yīng)體系［6，16］： 1.5 mL磷酸緩沖液（50 mmol/L， pH 7.8）、0.3 mL蛋氨酸（130 mmol/L）、0.3 mL氯化硝基四氮唑藍(lán)（750 μmol/L）、0.3 mL乙二胺四乙酸二鈉（100 μmol/L）、0.3 mL核黃素（20 μmol/L）、0.5 mL蒸餾水、100 μL上清液。以等量磷酸緩沖液代替上清液為空白對照，分別設(shè)置黑暗和光照對照， 加入上清液后于3 000 lx光照20 min， 立即于黑暗下終止反應(yīng)。測定上清液在560 nm的吸光度。

將反應(yīng)體系中每分鐘吸光度值變化0.01定義為一個酶活力單位（U），SOD活性單位為U/g。

CAT活性測定采用分光光度法。反應(yīng)體系［6，17］：0.2 mL上清液、2.8 mL H2O2（0.067%），以等量蒸餾水代替上清液為對照。加入H2O2啟動反應(yīng)，記錄2 min內(nèi)反應(yīng)溶液在240 nm吸光度值的變化，以

每克樣品在反應(yīng)體系中

每分鐘催化1 μmol H2O2降解為1個活力單位（U），CAT活性單位為U/g。

POD活性測定采用分光光度法。反應(yīng)體系［6，17］： 100 μL上清液、2.6 mL愈創(chuàng)木酚（0.3%）、0.3 mL H2O2（0.6%）。加入上清液后開始計時， 計算2 min內(nèi)在470 nm的吸光度值的變化。

每克樣品在每毫升反應(yīng)體系中每分鐘為

吸光度值變化0.01被定義為1個酶活力單位（U），POD活性單位為U/g。

1.3" 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 25.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析， 用LSD法進(jìn)行差異顯著性分析， 采用Origin 2021進(jìn)行繪圖。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 裂褶菌菌株HJ-18發(fā)酵濾液對三線鐮刀菌生長和產(chǎn)孢的影響

培養(yǎng)期間， 發(fā)酵濾液處理組生物量顯著低于對照組， 第7天時， 較對照降低18.84%（圖1a）。處理和對照組的產(chǎn)孢量均隨培養(yǎng)時間的延長逐漸增加。裂褶菌菌株HJ-18發(fā)酵濾液處理導(dǎo)致三線鐮刀菌的產(chǎn)孢量顯著降低， 第7 天時， 較對照降低35.81%（圖1b）。

2.2" 裂褶菌菌株HJ-18發(fā)酵濾液對三線鐮刀菌細(xì)胞壁完整性的影響

培養(yǎng)期間， AKP活性總體隨處理時間的延長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢， 但多有起伏， 12 h時AKP活性下降， 但處理組仍比對照高73.66%， 兩者差異顯著（圖2a）。幾丁質(zhì)酶活性隨處理時間延長呈先升高后降低的趨勢。12 h時， 處理組比對照組高24.63%， 達(dá)到顯著差異（圖2b）。

2.3" 裂褶菌菌株HJ-18發(fā)酵濾液對三線鐮刀菌細(xì)胞膜通透性的影響

培養(yǎng)期間， 三線鐮刀菌的胞外電導(dǎo)率，蛋白質(zhì)與核酸含量均隨處理時間延長逐漸升高， 且處理組均顯著高于對照組， 36 h時， 電導(dǎo)率、蛋白質(zhì)與核酸含量比對照組分別高1.48倍、85.94%和64.54%（圖3a、b、c）。12 h時， 處理組的MDA含量顯著高于對照組， 為對照組的1.2倍（圖3d）。

2.4" 裂褶菌菌株HJ-18發(fā)酵濾液對三線鐮刀菌活性氧累積的影響

與對照相比， 處理組菌絲產(chǎn)生O-2能力維持在較低水平， 36 h時， 比對照組低39.19%（圖4a）。處理組和對照組的H2O2含量均隨處理時間的延長逐漸升高。處理組在第36 h時比對照組高88%， 達(dá)到顯著差異（圖4b）。

2.5" 裂褶菌菌株HJ-18發(fā)酵濾液對三線鐮刀菌抗氧化酶活性的影響

培養(yǎng)期間， 對照組和發(fā)酵濾液處理組的SOD活性均呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢， 12 h時， 處理組SOD活性比對照組低36.61%， 兩者差異顯著（圖5a）。對照組和處理組的CAT活性整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在0～12 h內(nèi)， CAT活性持續(xù)上升但變化較為平穩(wěn)， 在12 h時達(dá)到最大值。而12～36 h內(nèi)， CAT活性呈現(xiàn)下降趨勢， 36 h時， 處理組酶活性比對照組高55.84%， 兩者差異顯著（圖5b）。處理組POD活性均隨時間的變化總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢， 對照組總體呈下降趨勢， 僅12 h時又略有上升。36 h時處理組POD活性高于對照組，比對照組高141.7%（圖5c）。

3" 結(jié)論與討論

在本研究中， 根據(jù)生物量和產(chǎn)孢量測定發(fā)現(xiàn)， 菌株HJ-18發(fā)酵濾液能夠破壞三線鐮刀菌的菌絲生長發(fā)育， 起到抑制其正常生長的作用。細(xì)胞壁是細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)， 位于細(xì)胞的最外層， 除保持胞內(nèi)外物質(zhì)交換和能量流動外， 還承擔(dān)著保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)及抗?jié)B透壓的作用［1819］。AKP是一種位于細(xì)胞壁和細(xì)胞膜之間的細(xì)胞內(nèi)酶， 因此在細(xì)胞外環(huán)境中無法檢測到其活性。然而， 當(dāng)細(xì)胞壁完整性受到外界損害時， AKP會泄漏并進(jìn)入細(xì)胞外環(huán)境［20］。幾丁質(zhì)是大多數(shù)真菌的細(xì)胞壁成分， 而幾丁質(zhì)酶是一種能夠分解幾丁質(zhì)的細(xì)胞壁降解酶［21］。從信號草Brachiaria brizantha中分離得到的內(nèi)生真菌帚枝霉屬真菌Sarocladium brachiariae HND5菌株可通過真菌細(xì)胞壁降解酶來抑制香蕉枯萎病菌Fusarium oxysporum f.sp. cubense Race 4（FOC4）的生長［22］。已有研究表明， 幾丁質(zhì)酶和堿性磷酸酶可通過破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)來抑制病原菌的生長。三線鐮刀菌經(jīng)裂褶菌菌株HJ-18發(fā)酵濾液處理后堿性磷酸酶和幾丁質(zhì)酶活性顯著增加， 推測發(fā)酵濾液破壞了三線鐮刀菌細(xì)胞壁的完整性， 使其失去了保護(hù)作用， 此時細(xì)胞壁內(nèi)的AKP不受約束， 導(dǎo)致胞內(nèi)堿性磷酸酶大量滲漏到細(xì)胞外以及提高幾丁質(zhì)酶活性， 最終致使病原菌的死亡。

細(xì)胞膜具有分隔細(xì)胞內(nèi)外界環(huán)境的功能， 其通透性在維持真菌細(xì)胞生存能力方面發(fā)揮著重要作用［2324］。電解質(zhì)滲漏是細(xì)胞膜遭受破壞的衡量指標(biāo)［25］， 因此， 通過測定電導(dǎo)率來判斷細(xì)胞膜的損傷程度。核酸是真菌的遺傳物質(zhì)， 當(dāng)細(xì)胞膜遭受破壞或損傷時， 會引起蛋白質(zhì)、核酸等大分子外泄［26］。MDA是生物體膜脂過氧化的衡量指標(biāo)［27］， 其含量的高低代表膜脂過氧化的程度和生物體對逆境的耐受力大小。本研究發(fā)現(xiàn)， 與對照組相比， 發(fā)酵濾液處理組電導(dǎo)率顯著增加， 蛋白質(zhì)、核酸和MDA含量升高， 這可能是由于發(fā)酵濾液破壞了三線鐮刀菌細(xì)胞膜， 導(dǎo)致膜通透性增加， 促進(jìn)了菌絲體電解質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸和MDA向外界環(huán)境中的滲漏。

活性氧（ROS）是一類化學(xué)性質(zhì)很活潑、氧化能力很強(qiáng)的含氧物質(zhì)的總稱。在植物組織中， 活性氧的類型主要有H2O2、O-2等。通常情況下， 許多抗真菌劑能夠通過誘導(dǎo)真菌活性氧累積引起細(xì)胞凋亡的方式來抑制真菌生長［28］， 體內(nèi)活性氧增加能啟動膜脂過氧化作用而導(dǎo)致質(zhì)膜透性增加［29］。本研究也發(fā)現(xiàn)， 與對照組相比，處理組產(chǎn)生的O-2減少，H2O2的累積增加， 加速了O-2向H2O2的轉(zhuǎn)化。

SOD、POD和CAT作為活性氧清除劑能夠發(fā)揮重要作用， SOD是生物體重要的抗氧化酶， 作為抗氧化防御系統(tǒng)的第一道防線， 其首先發(fā)揮作用將超氧物質(zhì)通過歧化反應(yīng)清除超氧自由基O-2， 以減輕有害物質(zhì)對生物體的損傷［30］。CAT和POD是生物重要的防御酶， 能夠?qū)⑵缁a(chǎn)物H2O2分解生成H2O和O2， 避免H2O2和O-2在鐵螯合物的作用下生成更具毒害作用的·OH， 并保持細(xì)胞體內(nèi)氧自由基的動態(tài)平衡［31］。作為抗氧化防御體系中的關(guān)鍵酶， SOD、POD和CAT在細(xì)胞遭受外界脅迫時發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［3233］。有研究報道， 內(nèi)生真菌聚多曲霉Aspergillus sydowii SDYS180菌體的代謝產(chǎn)物可以顯著抑制楊樹葉斑病菌Phyllosticta sp.的POD、SOD、CAT活性［34］。本研究結(jié)果表明， 經(jīng)裂褶菌菌株HJ-18發(fā)酵濾液處理后的三線鐮刀菌菌絲SOD活性降低， 處理誘導(dǎo)了活性氧的累積， POD和CAT的酶活性隨之升高， 表明該菌株發(fā)酵濾液通過改變菌體抗氧化酶活性對正常病原菌代謝產(chǎn)生不利影響， 導(dǎo)致細(xì)胞遭受死亡脅迫。裂褶菌菌株HJ-18發(fā)酵濾液處理使得酶活性出現(xiàn)先上升后下降的趨勢， 可能是隨著脅迫程度的加深， 氧自由基過度積累， SOD、POD和CAT抗氧化酶活性隨之升高， 細(xì)胞則通過增強(qiáng)自身對該脅迫的抵御能力來應(yīng)對外界的脅迫。但細(xì)胞在抵御這種變化的過程中又受到損害， 所以后期酶活性下降， 細(xì)胞死亡， 從而達(dá)到抑菌效果。

本研究結(jié)果表明， 裂褶菌菌株HJ-18發(fā)酵濾液處理降低了三線鐮刀菌的生物量和產(chǎn)孢量， 誘導(dǎo)了堿性磷酸酶和幾丁質(zhì)酶活性的增加， 導(dǎo)致電導(dǎo)率升高、蛋白質(zhì)和核酸發(fā)生泄漏， MDA含量增加。此外， 還加速了三線鐮刀菌O-2向H2O2的轉(zhuǎn)化、誘導(dǎo)了H2O2的累積， 導(dǎo)致了CAT和POD活性增加。由此表明， 裂褶菌菌株HJ-18發(fā)酵濾液對三線鐮刀菌的抑制作用可能與抑制其正常生長、破壞細(xì)胞壁完整性、細(xì)胞膜通透性以及擾亂活性氧代謝有關(guān)。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）