云杉芽銹病病原菌鑒定

摘要

2017年-2021年在甘肅南部的白龍江林區(qū)發(fā)現(xiàn)云杉Picea asperata感染一種銹病， 為了進一步了解病原菌的發(fā)生規(guī)律和生活史， 制定合理的防治策略， 本研究對引起銹病的病原菌進行了鑒定。首先在光學顯微鏡和掃描電鏡下觀察銹孢子形態(tài)特征并測量其大小，進行初步鑒定;隨后通過擴增、測序獲得ITS序列，在NCBI上進行序列同源性比對分析， 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹， 進一步鑒定病原菌。結(jié)果表明， 在白龍江林區(qū)3個保護站（林場）發(fā)現(xiàn)的云杉銹病病原菌為伏魯寧金銹菌Chrysomyxa woroninii Tranz.， 銹病為云杉芽銹病， 這是首次發(fā)現(xiàn)伏魯寧金銹菌侵染云杉。

關鍵詞

云杉;" 芽銹病;" 伏魯寧金銹菌

中圖分類號：

S 763.15

文獻標識碼：" A

DOI：" 10.16688/j.zwbh.2024009

收稿日期：" 20240104""" 修訂日期：" 20240409

基金項目：

甘肅省林業(yè)和草原局科技創(chuàng)新項目（2021kjcx011）; 甘肅省林業(yè)科技計劃（2017kj042）

致" 謝：" 感謝西北農(nóng)林科技大學林學院曹支敏教授在病原菌鑒定和文章撰寫過程給予的幫助和建議。

* 通信作者

E-mail：

GSCAOXW@126.com

#

為并列第一作者

Identification of pathogen causing spruce bud rust

XU Hongxia1，2，" ZHANG Ruike1，2，" YANG Shan1，2，" CAO Xiuwen1，2*

（1. Gansu Bailongjiang Forestry Research Institute， Lanzhou" 730000， China; 2. Gansu Bailongjiang

National Forest Ecosystem Research Station， Zhouqu" 746300， China）

Abstract

A suspected spruce rust was found in Bailongjiang forest in southern Gansu province. The pathogen was identified in order to understand the occurrence rule and life cycle of the rust fungus， and formulate the reasonable control measure. The samples were collected from Bailongjiang forest， and pathogen was primarily identified by spore morphological characteristics observed with light microscopy and scanning electron microscopy， and ITS sequence analysis. The results showed that the pathogen causing rust on Picea asperata was identified as Chrysomyxa woroninii Tranz.. This is the first report of spruce bud rust caused by C.woroninii on P.asperata.

Key words

spruce;" bud rust;" Chrysomyxa woroninii

云杉Picea asperata是四川西北部、甘肅東南部、陜西西南部和青海東部亞高山地區(qū)森林演替的頂級群落和重要的生態(tài)林及工業(yè)用材樹種， 也是國內(nèi)生長最快的云杉樹種［1］， 自然分布區(qū)和引種發(fā)展區(qū)均位于長江和黃河的源頭地區(qū)， 在天然林保護和林業(yè)生態(tài)建設中具有不可替代的作用［2］。

2017年-2021年在白龍江林區(qū)調(diào)查云杉病蟲害時發(fā)現(xiàn)一種銹病， 病害發(fā)生時新梢上的針葉全部罹病， 呈系統(tǒng)性感染， 感病后針葉畸形、腫大、彎曲， 癥狀與伏魯寧金銹菌Chrysomyxa woroninii引起的云杉芽銹病相似。為了進一步明確引起的云杉銹病的病原菌， 了解病原菌的發(fā)生規(guī)律和生活史， 本論文通過形態(tài)特征比較和ITS序列比對鑒定病原菌， 以期為制定合理的病害防治策略提供依據(jù)。

1" 材料與方法

1.1" 樣本采集

2017年-2021年每年6月-8月， 分別在甘肅南部白龍江林區(qū)的沙灘國家森林公園、茶崗林場和鐵壩林場（甘南州舟曲縣）、冶力關國家森林公園（甘南州臨潭縣）、臘子口國家森林公園（甘南州迭部縣）， 洮河國家級自然保護區(qū)卡車保護站（甘南州卓尼縣）和尕海國家級自然保護區(qū)則岔保護站（甘南州碌曲縣）按照樣線法， 尋找并觀察不同云杉樹種上銹病發(fā)生情況， 用高枝剪采集部分感病新梢， 帶回室內(nèi)觀察， 采集樣本記錄如表1。

1.2" 病原菌形態(tài)學觀察

采集云杉感病針葉進行銹菌孢子形態(tài)特征觀察。在體視顯微鏡（SMZ1500， Nikon， 日本）下觀察銹子器的形狀等特征。銹孢子樣本做成臨時裝片， 在光學顯微鏡（E2000， Nikon， 日本）下觀察銹孢子的形態(tài)等特征并拍照， 每樣本隨機選取30個銹孢子， 測量孢子的長、寬等［35］。采集的病葉制成干葉標本后， 取有銹子器的針葉部分用導電膠粘貼到樣品臺上， 噴金后用電子顯微鏡（SU8020， Hitachi， 日本）觀察銹孢子的表面特征并拍照。

1.3" 病原菌ITS序列分析

DNA提取方法和擴增方法采用Tian等［6］和Cao等［7］ 的方法。5.8S rDNA 和 28S rDNA 基因間隔序列（ITS）用引物ITS1（5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）［8］和ITS4 （5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）［9］擴增。PCR擴增體系（25 μL）： DNA 模板1 μL， 上、下游引物（2 μmol/L）

各2.5 μL， 2×Es Taq Master mix 12.5 μL， ddH2O補足25 μL。 擴增程序：94℃ 預變性3 min; 94℃ 30 s， 50℃ 1 min， 72℃ 1 min， 循環(huán)35次; 72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物由擎科生物科技有限公司（北京）純化后雙向測序。

獲得的序列在NCBI上進行BLAST同源性比對， 使用MEGA11軟件， 采用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 病害發(fā)生與危害

2017年-2021年， 每年6月底到7月中旬， 在甘肅南部白龍江林區(qū)海拔2 790～3 257 m的范圍內(nèi)、共3個保護站（林場）的云杉上發(fā)現(xiàn)銹病， 沙灘國家森林公園、冶力關國家森林公園和洮河國家級自然保護區(qū)（卡車保護站）云杉新梢銹病零星發(fā)生。病害發(fā)生后， 引起新梢枯死， 嚴重時云杉苗木形成多頭苗。

2.2" 云杉芽銹病癥狀

病原菌主要侵染幼樹和大樹的頂芽， 偶爾侵染側(cè)芽（圖1a）， 被系統(tǒng)性侵染的芽提前萌發(fā)， 產(chǎn)生的

針葉全部罹病或一側(cè)針葉發(fā)病， 針葉腫大， 畸形， 彎曲成香蕉狀， 有時病葉發(fā)黃， 發(fā)紅或全部變?yōu)榧t色（圖1a～c）， 病葉端部形成透明、黃色或淡紅色的點狀突起， 即病原菌的性子器（圖1b）， 幾天后， 性孢子飛散， 性子器漸變?yōu)楹诤稚?后期病葉上伸出白色或淡黃色的銹子器（圖1c～d）， 銹子器破裂散出大量黃色粉末（圖1e）， 即病原菌的銹孢子。銹孢子飛散后， 感病新梢變?yōu)楹谏?不脫落。

2.3" 銹子器及銹孢子的形態(tài)特征

銹子器著生在當年生針葉上， 散生或相互融合， 部分銹子器延伸至整個葉片， 白色或淡黃色。銹孢子黃色或橘色， 倒卵形， 橢圓形， 部分銹孢子伸長呈梨形、棍棒狀或一面鼓形（圖2a～c）， 大小為（25.3～47.3）μm×（12.2～24.4）μm ［x-=（36.9±5.9）μm×（19.1±3.1）μm］， 表面具有環(huán)紋的疣狀突起， 疣狀突起端部平（圖2d）。銹子器、銹孢子的形態(tài)特征與伏魯寧金銹菌Chrysomyxa woroninii相符［1011］， 病原菌初步鑒定為伏魯寧金銹菌。

2.4" 病原菌ITS序列分析

從舟曲沙灘林場云杉銹菌樣本獲得ITS序列2條，在GenBank中的登錄號分別為OL989139和OL989140， 構(gòu)建的系統(tǒng)樹中它們與C.woroninii的3條序列GU049456.1、GU049459.1和GU0495458.1聚為一支（圖3）， 進一步鑒定為伏魯寧金銹菌。

3" 結(jié)論與討論

觀察銹孢子形態(tài)特征時發(fā)現(xiàn)， 銹孢子的大小為（25.3～47.3）μm×（12.2～24.4）μm， 與何秉章等［12］測量的結(jié)果基本一致， 但明顯小于McBeath［10］從阿拉斯加白云杉P.glauca和黑云杉P.mariana上獲得的銹孢子， 其大小為（26～72）μm×（15～36）μm， 同時也沒有發(fā)現(xiàn)大型的棍棒形或一面鼓形銹孢子［（86～136）μm×（38～55）μm］， 這可能是因為觀察的孢子數(shù)量有限， 也可能是因為寄主和環(huán)境不同。另外， 在采集和觀察樣本時發(fā)現(xiàn)， 病原菌產(chǎn)生的銹孢子量非常大， 銹孢子的形狀和大小差異明顯， 這與以前的研究一致［11］， McBeath［10］認為銹孢子形狀和大小變化很大可能是伏魯寧金銹菌銹孢子的特征之一。

Crane等［4］通過接種試驗證明， 伏魯寧金銹菌為轉(zhuǎn)主寄生， 缺少夏孢子階段， 冬孢子寄生在格陵蘭杜香Ledum groenlandicum叢枝狀枝條抽出的新葉上。但何秉章等［12］用銹孢子接種到杜香、杜鵑等可疑寄主后， 并沒有發(fā)病， 伏魯寧金銹菌在我國的轉(zhuǎn)主寄主仍需進一步研究。

伏魯寧金銹菌在北半球分布， 包括加拿大、阿拉斯加、歐洲、西伯利亞、堪察加半島、日本和我國東北亞高山地區(qū)林線附近［4］， 主要侵染云杉幼樹和大

樹的頂芽， 偶爾侵染側(cè)芽， 引起新梢枯死， 影響苗木質(zhì)量和云杉人工林的正常生長［12］。此外， 伏魯寧金銹菌還侵染云杉球果， 感病球果停止生長， 不形成種子［13］。伏魯寧金銹菌在加拿大、美國和俄羅斯侵染黑云杉、白云杉、歐洲云杉P.abies和杜香， 在我國主要侵染紅皮云杉P.koraiensis和魚鱗云杉P.jezoensis［12，14］， 這是首次報道伏魯寧金銹菌侵染云杉。

參考文獻

［1］" 羅建勛. 云杉天然群體遺傳多樣性研究［D］. 北京： 中國林業(yè)科學研究院， 2004.

［2］" FARJON A. World checklist and bibliography of conifers" ［M］. 2nd ed. Royal Botanic Gardens， Kew， England， 2001.

［3］" JI Jingxin， LI Zhuang， LI Yu， et al. Life cycle and taxonomy of Chrysomyxa succinea in China and phylogenetic positions of Caeoma species on Rhododendron ［J/OL］. Forest Pathology， 2020， 50： e12585. DOI： 10.1111/efp.12585.

［4］" CRANE P E， HIRATSUKA Y， CURRAW S R. Clarification of the life-cycle of Chrysomyxa woroninii on Ledum and Picea ［J］. Mycological Research， 2000， 104（5）： 581586.

［5］" WANG R， TSUI K M C， YOU C J. Cryptic species diversity and phylogenetic relationship in the rust genus Chrysomyxa from China ［J/OL］. Journal of Fungi， 2022， 8： 83. DOI： 10.3390/jof8010083.

［6］" TIAN Chengming， SHANG Yanzhong， ZHUANG Jianyun， et al. Morphological and molecular phylogenetic analysis of Melampsora species on poplars in China ［J］. Mycoscience， 2004， 45： 5666.

［7］" CAO Jing， TIAN Chengming， LIANG Yingmei， et al. Two new Chrysomyxa rust species on the endemic plant， Picea asperata in western China and expanded description of C.succinea ［J］. Phytotaxa， 2017， 292（3）： 218230.

［8］" GARDES M， BRUNS T D. ITS primers with enhanced specificity for basidiomycetes-application to the identification of mycorrhizae and rusts ［J］. Molecular Ecology， 1993， 2（2）： 113118.

［9］" WHITE T J， BRUNS T， LEE S， et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics ［M］∥INNIS M A， GELFAND D H， SNINSKY J J， et al. PCR protocols： A guide to the methods and applications. New York： Academic Press， 1990.

［10］MCBEATH J H. Symptomatology of spruce trees and spore characteristics of a bud rust pathogen ［J］. Phytopathology， 1984， 74（4）： 456461.

［11］SAVILE D B O. North American species of Chrysomyxa ［J］. Canadian Journal of Research， 1950， 28（3）： 318330.

［12］何秉章， 侯偉宏， 劉乃誠， 等. 云杉芽銹病的研究［J］. 東北林業(yè)大學學報， 1995， 23（4）： 111114.

［13］MEREATH J H. Rust diseases on white spruce in Alaska ［J］. Agroborealis， 1981， 13： 4143.

［14］莊劍云， 鄭曉慧. 中國金銹菌屬 Chrysomyxa Unger （銹菌目， 金銹菌科）已知種［J］. 西昌學院學報（自然科學版）， 2017， 31（4）： 19.

（責任編輯：田" 喆）