云南芒果枯萎病病原菌鑒定

摘要

2016年-2022年， 采集云南省臨滄市永德縣主要芒果種植基地疑似枯萎病樣品60份， 通過對疑似樣品的分離、純化， 結(jié)合形態(tài)學(xué)特征、多基因系統(tǒng)發(fā)育分析及柯赫氏法則驗證， 對8株代表性分離物（MG-1-1， MG-1-3， MG-1-7， MG-1-10， MG-2-1， MG-2-4， MG-2-8， MG-2-10）進行鑒定。結(jié)果表明： 8株分離物在MYEA培養(yǎng)基上散發(fā)出果香味， 形成大量子囊殼和子囊孢子團， 子囊孢子帽盔狀;序列同源性分析顯示：分離物的βT1、RPBII、MS204和FG1093序列與長喙殼屬真菌Ceratocystis manginecans菌株序列相似性為100%， 4個基因片段串聯(lián)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹顯示， 8株分離物與源自阿曼和印度尼西亞的C.manginecans聚為一支， ML和BI分析支持率分別為93和0.98。選取2個分離物（MG-1-10和MG-2-8）進行致病性測定， 均能引起芒果幼苗發(fā)病且癥狀與田間相似。綜上， 本研究明確了引起云南芒果枯萎病的病原菌為Ceratocystis manginecans。

關(guān)鍵詞

芒果;" 枯萎病;" 病原鑒定;" Ceratocystis manginecans

中圖分類號：

S 432.1

文獻標(biāo)識碼：" A

DOI：" 10.16688/j.zwbh.2024037

收稿日期：" 20240116""" 修訂日期：" 20240202

基金項目：

國家自然科學(xué)基金（31571958）;云南省李健強專家工作站（202105AF150046）;

云南省“興滇英才支持計劃”青年人才（XDYC-QNRC-2022-0710）;

云南農(nóng)業(yè)大學(xué)科研啟動基金（KY2022-64）

致" 謝：" 參加本試驗部分工作的還有江代禮、譚翰杰、張能和紀(jì)燁斌等同學(xué)，特此一并致謝。

* 通信作者

E-mail：

lijq231@cau.edu.cn

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為并列第一作者

Identification of the pathogen causing mango wilt disease in Yunnan

ZHANG Zhiping1，" ZHANG Zhuqing1，" DOU Min2，" FAN Fuyuan2，" REN Yungui1，" LIU Bo1，SHA Sufei1，" LI Jianqiang3*

（1. College of Landscape and Horticulture， Yunnan Agricultural University， Kunming" 650201， China;

2. College of Plant Protection， Yunnan Agricultural University， Kunming" 650201， China;

3. College of Plant Protection， China Agricultural University， Beijing" 100193， China）

Abstract

From 2016 to 2022， sixty suspected mango wilt disease samples were collected from the main mango cultivation base in Yongde county， Lincang city， Yunnan province. Using pathogen isolation， purification， morphological characterization， multi-gene phylogenetic analysis， and Koch’s postulates verification， eight representative isolates （MG-1-1， MG-1-3， MG-1-7， MG-1-10， MG-2-1， MG-2-4， MG-2-8 and MG-2-10） were identified. All isolates emitted a fruity aroma on MYEA medium， formed prominent perithecia and ascospore masses， and displayed hat-shaped ascospores. Sequence homology analysis revealed 100% similarity in βT1， RPBII， MS204 and FG1093 gene sequences between

isolates and Ceratocystis manginecans strains from Oman and Indonesia. A phylogenetic tree constructed from these gene sequences grouped the eight isolates with C.manginecans with a bootstrap support of 93 and a Bayesian support value of 0.98. Pathogenicity tests on mango seedlings using isolates MG-1-10 and MG-2-8 revealed that they caused symptoms consistent with those observed in the field. This study thus confirms C.manginecans as the pathogen responsible for mango wilt disease in Yunnan.

Key words

mango;" wilt disease;" pathogen identification;" Ceratocystis manginecans

芒果Mangifera indica屬漆樹科Anacardiaceae杧果屬Mangifera， 因其果肉風(fēng)味鮮美、營養(yǎng)豐富而深受喜愛， 素有“熱帶果王”之美譽［1］。中國種植芒果歷史悠久， 據(jù)2021年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)墾局統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示， 我國芒果種植規(guī)模居世界第二位［2］， 主要分布于海南、云南、廣西、廣東、福建、四川、臺灣等省（自治區(qū)）［34］。

芒果作為世界五大水果之一， 生產(chǎn)過程中受到多種病原菌危害。如炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides、白粉病菌Oidium mangiferae、枯萎病菌Ceratocystis fimbriata、流膠病菌Diplodia mangiferae、煤污病菌Tripospermum acerinum、蒂腐病菌Botryodiplodia theobromae、細菌性黑斑病菌Xanthomonas campestris pv. mangiferaeindicae等［58］。其中， 由長喙殼屬Ceratocystis真菌引起的芒果樹枯萎病是生產(chǎn)上一大重要土傳病害［9］。該屬真菌屬于子囊菌門Ascomycota核菌綱Pyrenomycetes球殼目Sphaeriales長喙殼科Ceratocystidaceae， 寄主廣泛， 可侵染14個屬31種木本植物及塊根作物， 如梧桐、芒果、桉樹、石榴樹、椰子、甘薯、芋屬、萵苣等［10］。由長喙殼屬真菌引起的芒果枯萎病最早于1930年發(fā)現(xiàn)， 至今已在巴西、阿曼、巴基斯坦等多個國家陸續(xù)發(fā)生， 病原菌種類包括C.fimbriata、C.omanensis、C.manginecans、C.mangivora等［1114］。2017年， 我國云南首次報道由長喙殼屬真菌引起的芒果枯萎?。?］， 基于ITS序列將病原菌鑒定為Ceratocystis fimbriata復(fù)合種， 但未對病原菌的狹義種進行鑒定。

自2016年-2022年期間， 本研究通過對云南省芒果枯萎病害的持續(xù)追蹤調(diào)查， 從多點采集枯萎病樣品60份， 對疑似病原菌進行了分離純化、致病性測定、形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定， 為芒果枯萎病的診斷和防治提供了基礎(chǔ)的科學(xué)依據(jù)。

1" 材料與方法

1.1" 供試培養(yǎng)基

麥芽酵母培養(yǎng)基（MYEA）： 2 g酵母浸粉， 20 g麥芽提取物干粉， 16 g瓊脂， 加蒸餾水至1 L， 121℃滅菌20 min。

1.2" 病樣采集及疑似病原菌的分離與純化

2016年-2022年期間， 在我國云南省臨滄市永德縣的芒果種植基地隨機選取芒果植株表現(xiàn)枯萎、死亡癥狀較為典型的芒果種植園， 采集芒果植株及枝條有明顯枯萎、莖桿或枝條流膠、木質(zhì)部褐變現(xiàn)象的病樣60份， 觀察并記錄病害癥狀特征。

采用胡蘿卜誘導(dǎo)法對病樣進行病原菌分離［15］。5 d后挑取胡蘿卜碟片上富集的長喙殼屬分離物的子囊殼喙頂端的單個子囊孢子團， 劃線培養(yǎng)， 隨后采用單孢純化的方法獲取分離物的純培養(yǎng)物，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3" 致病性測定

采用芒果幼苗活體接種法進行分離物的致病性測定。取一年生健康的芒果幼苗（品種為‘三年芒’）， 以莖基部向上50 cm處設(shè)置接種點， 用直徑為5 mm的打孔器打孔， 暴露其木質(zhì)部;制備分離物的孢子懸浮液濃度為106個/mL;將制備好的孢子懸浮液接種于芒果幼苗， 每個接種點接種菌液量為100 μL， 并用濕潤的棉花和保鮮膜包裹保濕， 每個分離物接種5株芒果幼苗， 對照組接種100 μL ddH2O;30 d后觀察、記錄芒果幼苗的發(fā)病情況， 測量病斑長度;以接種點兩側(cè)木質(zhì)部出現(xiàn)褐變， 形成褐色梭形病斑作為分離物致病性評價依據(jù)。

1.4" 形態(tài)學(xué)鑒定

將分離物接種于MYEA培養(yǎng)基， 25℃黑暗培養(yǎng)2周后， 采用十字交叉法測量菌落直徑， 并觀察各分離物的菌落顏色及形態(tài)、子囊孢子團顏色和形狀以及顯微結(jié)構(gòu)特征［16］。顯微結(jié)構(gòu)特征包括： 子囊殼形態(tài)（基部顏色及形狀、喙、喙端孔口菌絲形態(tài)）、子囊孢子形態(tài)、粉孢子形態(tài)、棒形分生孢子形態(tài)。每個分離物隨機選取100個子囊殼， 測量其基部高度和寬度、喙長、喙基部寬度、喙端寬度、喙端孔口菌絲長度;隨機選取子囊孢子、棒形分生孢子和粉孢子各100個， 分別測量其寬度和長度。

1.5" 多基因序列擴增與測序比對

分離物培養(yǎng)10 d后收集菌絲， 采用北京博邁德基因技術(shù)有限公司的快捷型植物基因組DNA提取試劑盒提取各分離物總DNA。參考Fourie等［17］的方法， 對 βT1、FG1093、MS204和RPBII 4個基因部分序列進行擴增， 引物信息見表1。

PCR 反應(yīng)體系均為25 μL， 包含10 μmol/L正反向引物各1.0 μL、10×Taq reaction buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2.4 μL、Taq DNA polymerase 0.25 μL、DNA模板1 μL、ddH2O 16.85 μL。PCR擴增反應(yīng)程序： 1） βT1和FG1093反應(yīng)程序： 95℃預(yù)變性5 min;94℃變性40 s，58℃退火40 s，72℃延伸 1 min，35個循環(huán);72℃延伸10 min，4℃保持。2） MS204反應(yīng)程序： 95℃預(yù)變性5 min;94℃變性40 s， 57℃退火40 s， 72℃延伸90 s， 35個循環(huán);72℃延伸10 min， 4℃保持。3） RPBII反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min;94℃變性40 s， 53℃退火40 s， 72℃延伸90 s， 35個循環(huán);72℃延伸10 min， 4℃保持。擴增產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司進行測序。將獲得的4個基因片段序列在NCBI（http：∥www.ncbi.nlm. gov） GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST同源性對比分析， 隨后提交至GenBank數(shù)據(jù)庫， 獲取登錄號（表2）。

1.6" 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載世界范圍內(nèi)不同寄主、不同地理來源的長喙殼屬Ceratocystis菌株的βT1、FG1093、MS204及RPBII基因序列（表2），與本試驗獲得的芒果分離物的4個基因的DNA序列進行比對分析， 并選取代表性菌株的序列與上述不同寄主和地理來源的菌株基因DNA序列進行聚類分析， 采用最大似然法（maximum likelihood method， ML）和貝葉斯法（Bayesian inference method， BI）利用軟件MAGA 5.0、IQ-TREE、RAxML、MrBayes 3.2.2、Figtree v1.3.1等構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。ML分析設(shè)置bootstrap為1 000， BI分析設(shè)置2 000 000 generations（diagnosis frequency=100 000， sample frequency=1 000， burnifrac=0.25）。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 芒果枯萎病癥狀

田間病害調(diào)查發(fā)現(xiàn)， 在云南省臨滄市永德縣的芒果種植基地出現(xiàn)了類似長喙殼屬真菌侵染引起的典型的枯萎、死亡等癥狀， 部分芒果果園內(nèi)不同樹齡的樹木出現(xiàn)枯萎癥狀的病株率高達80%～90%。典型的病害癥狀表現(xiàn)為： 芒果植株根部及莖桿褐變并伴有流膠現(xiàn)象（圖1b， 1c， 1e）， 木質(zhì)部形成典型的梭形褐色病斑（圖1d）;隨著病情發(fā)展， 病株出現(xiàn)枝條枯萎、整株枯死等現(xiàn)象（圖1a）;此外， 大量發(fā)病植株莖桿伴有甲蟲和天牛幼蟲為害（圖1f）。

2.2" 病原菌的形態(tài)學(xué)特征

采用胡蘿卜誘導(dǎo)法分離病原菌， 共計獲得40株形態(tài)特征表現(xiàn)一致的分離物。選取8株代表性分離物（MG-1-1， MG-1-3， MG-1-7， MG-1-10， MG-2-1， MG-2-4， MG-2-8， MG-2-10）開展后續(xù)研究。分離物在MYEA培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周后， 菌落平均直徑為5.62 cm， 灰褐色至褐色（圖2a）。所有分離物在培養(yǎng)過程中均能散發(fā)出果香味， 形成大量棕色至黑色的子囊殼， 子囊孢子團淺黃色至黃色（圖2b、2c）。子囊殼直立生長于培養(yǎng)基上， 基部近球形， （128～334）μm×（113～323）μm（圖2d）;喙修長， 喙長240～1 013 μm， 喙基部寬20.3～47.3 μm， 喙頂部寬10.2～26 μm（圖2d）;喙端孔口菌絲透明， 呈聚合狀， 長24.3～87.8 μm（圖2e）;子囊孢子透明， 為典型的帽盔狀， （3.5～6.8）μm×（1.5～4.6）μm（圖2f）;分生孢子棒形， （12.6～41.2）μm×（3.0～7.6）μm（圖2g）;粉孢子厚壁， 單生或串生， （6.2～20.7）μm×（5.0～14.5）μm（圖2h）。綜合分析分離物形態(tài)學(xué)特征， 為典型的長喙殼屬真菌， 與已報道的C.manginecans形態(tài)特征相似［13］。

2.3" 致病性測定

2株代表性分離物（MG-1-10和MG-2-8）接種健康的‘三年芒’一年生幼苗5～7 d后， 在植株莖桿接種點觀察到有大量的子囊殼及子囊孢子團， 木質(zhì)部開始褐變， 30 d后測量平均褐變病斑長度分別為1.90 cm和1.54 cm（圖3）， 隨著病情進一步發(fā)展， 褐變組織擴展， 芒果幼苗出現(xiàn)葉片枯萎脫落現(xiàn)象， 而對照組（ddH2O）植株無癥狀。將接種分離物發(fā)病后的植物組織進行病原菌再分離， 獲得的分離物形態(tài)特征和分子生物學(xué)特征與原接種分離物一致。

2.4" 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

擴增并測序獲得8個分離物的βT1（550 bp）， FG1093（534 bp）， MS204（880 bp）和RPBII（1 129 bp）基因序列， 不同分離物的同一基因序列相似性為100%。NCBI 數(shù)據(jù)庫BLAST 比對結(jié)果顯示， 所有分離物均為長喙殼屬真菌， 與已報道的C.manginecans菌株的序列相似性最高， 為100%。將分離物的4個基因序列提交至GenBank（登錄號詳見表2）。以Ceratocystis pirilliformis為外群， 串聯(lián)各菌株的4個基因片段（βT1-FG1093-MS204-RPBII）， 采用ML和BI分析的方法（GTR + G模型）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示， ML和BI分析生成了具有相同拓撲結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)發(fā)育樹， 所有分離物均與源自阿曼、印度尼西亞的C.manginecans聚為一支， ML分析的Bootstrap值為93， BI分析的支持率為0.98（圖4）。綜合致病性測定、形態(tài)學(xué)特征及多基因系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果， 將云南芒果枯萎病的病原菌鑒定為C.manginecans。

3" 結(jié)論與討論

芒果枯萎病是芒果生產(chǎn)上重要病害之一。2017年， Zhang等發(fā)現(xiàn)云南臨滄有芒果枯萎病發(fā)生， 通過ITS基因序列將病原菌確定為長喙殼屬真菌［7］， 但未明確病原菌所屬的具體種。本研究綜合形態(tài)學(xué)、多基因系統(tǒng)發(fā)育分析和致病性測定，確定了引起云南臨滄永德縣芒果枯萎病的病原菌為C.manginecans， 這是該菌引起云南芒果枯萎病的首次報道， 為芒果枯萎病的診斷和防治提供了依據(jù)。

由長喙殼屬的C.fimbriata引起的芒果枯萎病最早報道于巴西［18］。此后， 陸續(xù)有分離自芒果的該屬真菌的新種被報道， 包括C.manginecans、C.acaciivora、C.omanensis、C.mangicola和C.mangivora等［1214， 19］。其中， C.manginecans分布較為廣泛， 普遍分布于阿曼和巴基斯坦［1213］、印度尼西亞［19］、馬來西亞［20］、泰國［21］、越南［2223］等國家。云南省地處我國邊境， 與緬甸、泰國、越南、印度等多個國家鄰近， 貿(mào)易往來頻繁， 且我國有從緬甸、泰國等多個國家引種芒果的歷史。因此推測， 危害我國云南臨滄芒果的C.manginecans可能是通過引種或昆蟲媒介傳入，這也提示在國際貿(mào)易往來中建立有效的有害生物檢疫法規(guī)的必要性。

Ceratocystis manginecans作為一種危害嚴(yán)重的病原菌， 寄主范圍廣泛， 包括芒果、桉樹、石榴、相思樹等［13，2324］。2013年， Chen等從我國華東地區(qū)的桉樹上分離到C.manginecans［25］。田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)， 大量枯萎的芒果植株莖桿有甲蟲和天牛幼蟲為害， 而昆蟲作為該病原菌重要的媒介， 可能參與C.manginecans的傳播［26］。一方面， 我國東南、西南地區(qū)大面積種植桉樹， C.manginecans可能通過昆蟲媒介， 由桉樹近距離傳播到芒果上， 從而引起芒果枯萎病發(fā)生。盡管目前還未見該菌危害我國云南桉樹的報道， 但這一潛在的威脅不容忽視。另一方面， 桉樹、石榴等作為C.manginecans的寄主植物， 在云南、四川等多個省份廣泛種植， 侵染芒果的菌株可能對桉樹和石榴樹構(gòu)成潛在威脅， 具有引發(fā)枯萎病的可能。隨著我國芒果種植面積的不斷擴大及其在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟中的重要地位， 生產(chǎn)上應(yīng)對長喙殼屬真菌引起的芒果枯萎病予以重視。此外， 可通過選育優(yōu)良抗病品種， 加強田間病蟲害防控來減少由芒果枯萎病害帶來的損失。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）