低能離子注入誘變法選育新硫肽類抗生素166A高產(chǎn)菌株

摘要：目的 為進(jìn)一步提高產(chǎn)量，以小單孢菌Micromonospora sp.TMD166-MU1為出發(fā)菌株，采用低能離子注入技術(shù)，研究不同離子注入?yún)?shù)對菌株存活率、正負(fù)突變率的影響，通過突變株抑菌活性變勢參數(shù)分析，初步探討N+離子注入對166A生產(chǎn)菌所產(chǎn)生的誘變效果，并結(jié)合卡那霉素抗性篩選及牛津杯固體發(fā)酵高通量篩選，獲得高產(chǎn)菌株。方法 利用低能N+離子注入技術(shù)對出發(fā)菌株TMD166-MU1的孢子進(jìn)行輻照誘變，以卡那霉素耐受性為選擇壓力，不同誘變條件處理的菌懸液涂布在含有卡那霉素培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)后獲得單菌落，并以牛津杯固體發(fā)酵高通量篩選方法進(jìn)行高產(chǎn)菌株初篩，之后對高產(chǎn)菌株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，利用高效液相法檢測突變株搖瓶發(fā)酵的化學(xué)效價。結(jié)果 通過研究30和60 keV能量下不同注入劑量與小單孢菌正突變率的生物學(xué)效應(yīng)關(guān)系，確定了在注入能量為30 keV、注入劑量4×1013 ions/cm2、卡那霉素抗性篩選濃度為6 mg/L條件下，可獲得最高達(dá)36.33%的正突變率。復(fù)篩效價是出發(fā)菌株1.5倍以上的有4株，其中突變株IK-3的166A產(chǎn)量是菌株TMD166-MU1的1.8倍。結(jié)論 采用低能N+離子注入誘變方式，再結(jié)合抗生素抗性篩選及牛津杯固體發(fā)酵高通量篩選的集成方法能簡單、高效地獲得166A高產(chǎn)突變菌株。

關(guān)鍵詞：新硫肽類抗生素166A；低能離子注入；誘變；抗生素抗性篩選；高通量篩選；高產(chǎn)菌株

中國分類號：R978 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Breeding of new thiopeptide antibiotics 166A high-yield strains

by low-energy ion implantation mutagenesis method

Dai Jianlu1，2， Li Yanqing3，4， Li Xin1，3， Jiang Zhongke1，3， He Weiqing1，2， and Sun Chenghang1，3

（1 State Key Laboratory of Bioactive Substances and Functions of Natural Medicines， Institute of Medicinal Biotechnology， Chinese Academy of Medical Sciences amp; Peking Union Medical College， Beijing 100050; 2 Key Laboratory of Antibiotic Biotechnology， National Health Commission of the People's Republic of China， Institute of Medicinal Biotechnology， Chinese Academy of Medical Sciences amp; Peking Union Medical College， Beijing 100050; 3 Department of Microbial Chemistry and Beijing Key Laboratory of Antimicrobial Agents， Institute of Medicinal Biotechnology， Chinese Academy of Medical Sciences amp; Peking Union Medical College， Beijing 100050; 4 Southern Marine Science and Engineering Guangdong Laboratory （Zhanjiang）， Guangdong Medical University， Zhanjiang 524023）

Abstract Objective To further increase the production of 166A and to obtain high-yield strains of 166A， Micromonospora sp. TMD166-MU1 was used as the starting strain to be investigated by low-energy ion implantation mutagenesis breeding technology. Through the analysis of the variable capacity parameters of the antibacterial activity of mutant strains， It was preliminarily explored that the mutagenic" effects of different N+ ion implantation parameters， including energy and doses， on the survival rate and positive and negative mutation rate of the strain TMD166-MU1， which combined with kanamycin resistance screening and Oxford Cup solid-state fermentation high-throughput screening， to obtain the high yield strains. Methods Strain TMD166-MU1 was implanted by Low-energy N+ ion beam technology， the treated strain TMD166-MU1 was spread on agar medium plates containing kanamycin as selection pressure to obtain a single colony. The colonies were evaluated through the first high throughput screening with Oxford Cup method and the following second screening with flask culture， positive mutant strains were screened out by comparison of inhibitory zone against Bacillus subtilis with the starting strain. Finally， HPLC was used to determine the fermentation titer of positive mutant strains. Results By investigating the relationship between the implantation dose of 30 keV or 60 keV energy and the positive mutation rates of 166A producing strains， the parameters of N+ ion implantation with the highest positive mutation rate （36.33%） were confirmed as 4×1013 ions/cm2 of 30 keV nitrogen ions （N+） energy with 6 mg/L of kanamycin. Four high-yield mutant strains were obtained by the shake flask culture， and the 166A yields of these strains were at least 1.5-fold higher than that of the strain TMD166-MU1. A mutant strain coded as IK-3 was finally screened out and the 166A yield of the mutant strain IK-3 is 1.8-fold higher than that of TMD166-MU1 strain. Conclusion Low-energy N+ ion implantation mutagenesis combined with antibiotic pressure and oxford cup high throughput screening model can effectively screen out 166A high-yield mutant strains， the integrated method was proved to be a simple and effective breeding approach to improve the yield of industrial microbes.

Key words New thiopeptide antibiotic 166A; Low-energy ion implantation; Mutagenesis; Antibiotic resistance selection; High throughput screening; High-yield strains

166A是塔克拉瑪干沙漠來源小單孢菌（Micromonospora sp.）TMD166產(chǎn)生的硫肽類新結(jié)構(gòu)抗生素，體外抗菌活性研究表明[1]，其對革蘭陽性菌有強(qiáng)抑制活性，尤其是對耐萬古霉素的糞腸球菌，體外最低抑菌濃度（MIC）在0.125～0.5 μg/mL之間，靜脈注射對小鼠腹腔感染的耐萬古霉素糞腸球菌（VRE，Enterococcus faecalis）ATCC700802的半數(shù)有效量（ED50）約為3 mg/kg。因此，166A作為抗耐藥新抗生素，具有潛在開發(fā)前景。前期，本實驗室對其實施了常壓室溫等離子體-紫外復(fù)合誘變育種，獲得了產(chǎn)量提高的突變菌株TMD166-MU1[2]，但其產(chǎn)量還不能滿足后續(xù)開發(fā)的需要，因此有必要以菌株TMD166-MU1為出發(fā)株，進(jìn)一步誘變育種以獲得166A高產(chǎn)菌株。

誘變育種因其簡單、快速、高效等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)菌種的選育，但長時期采用單一誘變會導(dǎo)致菌種產(chǎn)生“疲勞效應(yīng)”[3]，不僅會降低突變率，而且會出現(xiàn)抗性飽和和突變譜窄的現(xiàn)象。因此，利用誘變劑之間的協(xié)同效應(yīng)彌補(bǔ)單一誘變的缺陷，是取得誘變效果提高篩選效率的有效途徑。低能離子注入技術(shù)可通過能量及電離作用引起生物體中的染色體畸形或DNA鏈斷裂，同時又因存在特有的能量、質(zhì)量及電荷三因子協(xié)同效應(yīng)，使其與生物體的相互作用更為復(fù)雜，在誘變過程中還可通過引起受體原子的重組、位移等多重?fù)p傷誘發(fā)基因突變[3]。

由于離子注入具有能量沉積、動量傳遞、質(zhì)量沉積和電荷的中和與交換的誘變優(yōu)勢，因此它具有突變譜寬、突變率高和損傷輕等優(yōu)良特點，利于新品種選育[4]。蔡作新等[5]通過對恩拉霉素NL629-3菌株進(jìn)行低能N+離子注入誘變，獲得一株恩拉霉素高產(chǎn)菌株N3-643，其搖瓶發(fā)酵水平較對照提高了41%，放大發(fā)酵生產(chǎn)后平均發(fā)酵水平提高25.8%；蔣益等[6]

應(yīng)用低能N+離子注入金耳酵母狀分生孢子菌株進(jìn)行誘變，確定了低能N+離子注入的適宜參數(shù)：注入劑量為60×1014 ions/cm2，注入能量20 keV，靶室真空度10-3 Pa。在此條件下，篩選到了一株金耳多糖高產(chǎn)菌株，其產(chǎn)量較對照菌株提高了12.3%，液體發(fā)酵多糖產(chǎn)量（包括菌體多糖與發(fā)酵液多糖）達(dá)2.7 g/L；劉勝男等[7]利用N+離子注入誘變，并采用馬來酰肼抗性篩選和紅四氮唑（TTC）法相結(jié)合對突變株進(jìn)行篩選，獲得一株遺傳穩(wěn)定的高產(chǎn)突變株F312，其γ-亞麻酸產(chǎn)量為1236 mg/L，比出發(fā)菌株提高了157.5%。

核糖體工程表明抗生素抗性篩選是高產(chǎn)菌株選育的方法之一[8]?？股禺a(chǎn)生菌的抗性基因與抗生素合成基因和調(diào)控基因緊密連鎖，某些核糖體突變可以反映為作用于核糖體上的抗生素的抗性變化[9]，因此通過篩選抗性突變，可獲得核糖體功能突變的菌株，進(jìn)而獲得次生代謝產(chǎn)物合成能力提高的菌株。因此本研究對TMD166-MU1菌株進(jìn)行低能離子注入誘變處理后，以卡那霉素抗性作為選擇壓力，不僅減少了非突變菌株的干擾和篩選工作量，而且結(jié)合牛津杯固體發(fā)酵高通量篩選法，加速了166A高產(chǎn)突變菌株的選育。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

出發(fā)菌株：166A產(chǎn)生菌小單孢菌（Micromono-spora sp.） TMD166-MU1由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所微生物化學(xué)研究室保藏?？咕钚詸z定菌株：枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis）CPCC 100029由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所國家衛(wèi)生健康委員會抗生素生物工程重點實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

（1）平板及發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）

38#培養(yǎng)基：葡萄糖4.0，酵母粉4.0，麥芽浸粉5.0，ZnSO4·7H2O 0.001，MnCl2·4H2O 0.001，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.002，苯丙氨酸0.001，丙氨酸0.0003，維生素B1 0.001，維生素B2 0.001，維生素B6 0.001，煙酸0.001，生物素0.001，pH 8.5。固體培養(yǎng)基加瓊脂15.0，115 ℃滅菌20 min。

（2）生物檢定培養(yǎng)基（g/L）

牛肉膏1.5 ，酵母膏6.0，蛋白胨（F403）6.0，葡萄糖2.0，瓊脂13.0，pH8.0。

1.2 儀器與試劑

島津高效液相色譜儀（LC-20AT）（島津（中國）有限公司）；分析色譜柱Capcell MGII C-18（4.6 mm×

250 mm，5 μm）（日本資生堂公司）；離子注入機(jī)（HEV 400 kV型）：高壓工程公司（安裝放置于北京師范大學(xué)核科學(xué)與技術(shù)學(xué)院射線束技術(shù)教育部重點實驗室amp;北京市輻射中心），ZHWY-3212型臺式振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）；離心機(jī)（Centrifuge 1-14）（德國Sigma公司）；抑菌圈測量儀（Z9）（杭州迅數(shù)科技有限公司）；EZ-2型真空離心濃縮儀（英國Genevac公司）；卡那霉素（kanamycin， Km）（EDM Millipore公司）；HPLC所用試劑為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 單孢子懸液的制備

參照文獻(xiàn)[9]進(jìn)行單孢子懸液的制備。將出發(fā)菌株平板上的孢子用適量的無菌水洗脫，置于裝有玻璃珠的無菌三角瓶中，28 ℃、210 r/min振蕩15～

20 min使孢子分散，再經(jīng)無菌脫脂棉過濾，至鏡檢為分散的單孢子，制成濃度約為106個/mL的單孢子懸液備用。

1.3.2 離子注入

取制備好的單孢子懸液50 μL均勻涂抹于直徑為50 mm的不銹鋼載片上，于超凈臺中以無菌空氣風(fēng)干，制成菌膜后，無菌條件下，攜帶至北京師范大學(xué)核科學(xué)與技術(shù)學(xué)院射線束技術(shù)教育部重點實驗室amp;北京市輻射中心。將不銹鋼載片置于靶室進(jìn)行N+離子脈沖式注入，注入靶室的真空度為10-3 Pa，離子束注入能量為30 keV和60 keV，注入劑量分別為2×1013、4×1013、6×1013和8×1013 ions/cm2。然后取出載片，以2 mL無菌水洗脫孢子并稀釋到適宜濃度，涂布于平板培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)7～10 d，用于單菌落的挑選。以載片置于靶室真空中，不經(jīng)離子注入作為對照組。

1.3.3 抗性平板中卡那霉素濃度的確定

用無菌水將出發(fā)菌株TMD166A-MU1的平板菌苔洗下制成孢子懸液，用無菌水將其適度稀釋后取0.1 mL分別涂布在含有0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0和7.0 mg/L卡那霉素的固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10 d，以不含抗生素平板上菌體的生長情況為對照，觀察未長菌落的抗生素最低濃度，即為卡那霉素的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration， MIC），參考該MIC值配制卡那霉素抗性篩選平板。

1.3.4 篩選方法

（1）基于牛津杯固體發(fā)酵的菌株初篩：將經(jīng)離子注入誘變后獲得的處理液用無菌水稀釋后涂布于含一定濃度卡那霉素的固體培養(yǎng)基上，置于28 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)10 d。挑取單菌落至含有固體發(fā)酵培養(yǎng)基的牛津杯中，28 ℃培養(yǎng)7 d，將融化的檢定培養(yǎng)基冷卻至48 ℃～50 ℃，加入枯草芽胞桿菌檢定菌[A600=1.0，加入量0.5%（V/V）]，混勻后取55 mL加入直徑為150 mm的無菌平皿中，凝固后備用。將牛津杯轉(zhuǎn)移至檢定平板上，37 ℃培養(yǎng)12～15 h進(jìn)行166A抗菌活性檢測。初篩共篩選1617株突變株，從中選取抑菌圈直徑高于出發(fā)菌株的正突變株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩。誘變篩選流程見圖1。

（2）搖瓶復(fù)篩：將初篩獲得的正突變菌株挖塊，取4～6 cm2的菌苔接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中（250 mL三角瓶，裝量50 mL），28 ℃、210 r/min搖床發(fā)酵96～120 h。

發(fā)酵液離心后取上清液270 μL，采用杯碟法進(jìn)行生物活性檢定。選取抑菌圈直徑顯著高于出發(fā)菌株的發(fā)酵液樣品進(jìn)一步進(jìn)行HPLC分析。

1.3.5 分析方法

（1）誘變存活率計算：利用活菌計數(shù)法（CFU）計算誘變菌株的存活率。誘變菌株的存活率（%） =（離子注入存活菌落數(shù)/真空對照存活菌落數(shù)）×100%。

（2）突變率的計算：以誘變菌株的抑菌圈直徑大小為標(biāo)準(zhǔn)計算突變率，以抑菌圈直徑大于出發(fā)菌株抑菌圈直徑10%以上的誘變株定義為正突變株，抑菌圈直徑小于出發(fā)菌株抑菌圈直徑10%以上的誘變株定義為負(fù)突變株。因此，正突變率（%）=正突變株數(shù)/總誘變菌株數(shù)×100%，負(fù)突變率（%）=負(fù)突變株數(shù)/總誘變菌株數(shù)×100%。

（3）分析樣品的制備：待檢測發(fā)酵液經(jīng)3000 r/min離心10 min，取25 mL上清液以等體積乙酸乙酯萃取，所獲酯相經(jīng)真空濃縮儀抽干。取250 μL甲醇溶解樣品，以12000 r/min離心10 min取上層有機(jī)相。

（4）166A高效液相檢測方法：取上述制備好的分析樣品，采用高效液相色譜法[10]進(jìn)行166A的含量測定。HPLC檢測條件：流動相 68%甲醇-水溶液，檢測波長 300 nm，流速 0.8 mL/min，進(jìn)樣量15 μL，柱溫 25 ℃，Capcell MGII C-18 色譜柱（4.6 mm×

250 mm， 5 μm）檢測166A。

1.3.6 統(tǒng)計學(xué)分析及作圖

采用Origin 2019b統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析及作圖，數(shù)據(jù)以（x±s）表示，s表示標(biāo)準(zhǔn)差。組間比較采用t檢驗，當(dāng)Plt;0.05時，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 N+離子注入誘變對菌株存活率的影響

實驗選擇的注入能量為30 keV和60 keV，劑量范圍為2×1013～8×1013 ions/cm2劑量，無卡那霉素添加的平板開展菌落計數(shù)，不經(jīng)離子注入作為對照組，所獲不同離子注入劑量下菌株存活率曲線，如圖2所示。設(shè)定菌株在真空條件而無離子注入的情況下，存活率為100%，30和60 keV兩種不同能量處理條件下，菌株存活率的變化趨勢一致，如在2×

1013 ions/cm2低劑量下，兩種能量均出現(xiàn)了存活率驟降，分別達(dá)到7.11%和6.09%；在4×1013 ions/cm2劑量下均出現(xiàn)了存活率的回升，分別為48.73%和21.07%；在6×1013 ions/cm2劑量下又均出現(xiàn)了存活率的下降，分別達(dá)到14.22%和4.06%。以上結(jié)果表明在0～6×1013 ions/cm2劑量范圍內(nèi)，隨著N+離子注入劑量增加，存活率均呈現(xiàn)先降低、后升高、再降低的“馬鞍型”變化趨勢，這與相關(guān)文獻(xiàn)報道基本一致[6]，

而與γ射線等一般電離輻射情況下的“指數(shù)型”或“肩型”劑量-效應(yīng)曲線有本質(zhì)的差異[11]，這種特有的變化被認(rèn)為是能量沉積、動量傳遞作用下的損傷效應(yīng)和質(zhì)量沉積、電荷交換作用下的保護(hù)和刺激綜合作用的結(jié)果[11-14]。然而當(dāng)劑量繼續(xù)增加到8×

1013 ions/cm2時，兩種注入能量條件在此劑量下的存活率均再次顯著升高，分別達(dá)到26.40%和21.32%，表明該菌株在高劑量下抗性再次加強(qiáng)[15]。針對圖2出現(xiàn)存活率的兩個回復(fù)峰，可能是菌體內(nèi)修復(fù)酶的激活及注入電荷積累形成的“保護(hù)屏障”在時間上存在先后差別，從而使存活率出現(xiàn)兩個回復(fù)峰[16]。

2.2 抗性平板中卡那霉素濃度的確定

抗生素抗性篩選是基于微生物對抗生素產(chǎn)生耐藥性發(fā)展起來的菌株選育改良技術(shù)。由于低能離子注入和抗生素抗性篩選法對DNA分子進(jìn)行誘變的作用原理不同，因此引起的突變位點也有區(qū)別，將其與抗性基因突變篩選相結(jié)合，通過大幅度淘汰野生型并濃縮突變型來提高篩選效率，可以在很大程度上克服誘變隨機(jī)篩選的盲目性和不定向性，具有廣譜性、正突變率和增產(chǎn)百分率高等特點 [17]。

本實驗以卡那霉素作為篩選壓力，對TMD166-MU1的突變菌株進(jìn)行篩選，卡那霉素是一種廣譜氨基糖苷類抗生素，通過與細(xì)菌的核糖體30 S亞基結(jié)合，影響微生物蛋白質(zhì)合成的多個環(huán)節(jié)。取濃度為

106個/mL TMD166-MU1孢子液0.1 mL涂布于含不同濃度卡那霉素分離培養(yǎng)基平板中，觀察菌株對不同濃度卡那霉素的耐受情況，平板中菌株的生長情況如圖3所示。結(jié)果表明，菌株對卡那霉素敏感，在低濃度（1.0～3.0 mg/L）時，無明顯抑制作用，致死率為1.96%～28.76%，當(dāng)卡那霉素的濃度達(dá)到4.0 mg/L

時，菌落數(shù)減少顯著，生長受到明顯的抑制，此時致死率為99.61%，菌落數(shù)大幅度減少；若繼續(xù)增大卡那霉素的濃度至6.0 mg/L及以上時，菌落生長極少，菌株致死率接近100%。此濃度接近卡那霉素對出發(fā)菌株的MIC。因此，采用在培養(yǎng)基中添加

6.0 mg/L卡那霉素的亞致死劑量，作為低能離子注入后耐藥突變株的抗性篩選濃度。

2.3 氮離子注入能量30和60 keV結(jié)合卡那霉素抗性的誘變選育結(jié)果

因突變本身具有隨機(jī)性，其致死率和正突變之間的關(guān)系因不同的誘變方法和菌株特性不同而不同，為獲得盡可能多的突變單菌落，本實驗將暴露于30 keV能量和60 keV，N+離子不同劑量即2、4、6、8×1013 ions/cm2處理后的孢子懸液，經(jīng)稀釋分別涂布于含6.0 mg/L卡那霉素的培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，第一批次分別挑選出了259和203個菌落。利用前期建立的高通量牛津杯固體發(fā)酵篩選方法進(jìn)行初篩，結(jié)果如圖4所示。以166A抑菌圈直徑為指標(biāo)，與出發(fā)菌株比較，對誘變菌株的初篩結(jié)果按“1.3.5（1）”方法進(jìn)行統(tǒng)計，得到各劑量組突變率（表1）。

由表1可見，30 keV能量條件4×1013 ions/cm2劑量下，正突變率最高，達(dá)到36.33%。經(jīng)統(tǒng)計，在各劑量下總共有45個突變株抑菌圈直徑高于出發(fā)菌株TMD166-MU1（圖5中CK1）約10%以上，其中高于出發(fā)菌株20%以上的有23株（圖5中K1-K23），占正突變株的55%。60 keV能量條件6×1013 ions/cm2劑量下，正突變率最高，達(dá)到26.32%；2×1013ions/cm2劑量下，正突變率亦達(dá)到25.44%。經(jīng)統(tǒng)計，在各劑量下總共有42個突變株抑菌圈直徑高于出發(fā)菌株TMD166-MU1（圖5中CK2）10%以上，其中高于出發(fā)菌株20%以上的有21株（圖5中K24-K44），占正突變株的50%。

2.4 突變株抑菌活性變勢參數(shù)分析

對上述30和60 keV能量N+離子注入結(jié)合卡那霉素抗性篩選分別得到的45和42共87株陽性突變株進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，并以出發(fā)菌株TMD166-MU1作對照（control），采用杯碟法進(jìn)行發(fā)酵液生物活性檢測，結(jié)果如圖6所示。

統(tǒng)計表2中30和60 keV N+離子注入條件下，抑菌圈直徑大于18.0 mm（對照株16.54 mm）的突變株分別為23和25株，占比分別達(dá)到51.1%和59.5%，其中30 keV N+離子注入條件下抑菌圈直徑達(dá)到

20.0 mm以上的有3株，占該條件復(fù)篩菌株的6.7%。

突變株抑菌活性參數(shù)分析[18]結(jié)果顯示（表2），

30和60 keV N+離子注入突變株抑菌圈直徑平均值分別為17.96和18.03 mm，標(biāo)準(zhǔn)差S為1.31、1.51，穩(wěn)度Ct為13.71、11.94，雖然均出現(xiàn)了負(fù)偏，依然使變勢B分別達(dá)到15.31和15.57，表明30和60 keV兩種低能離子注入處理均改變了出發(fā)菌株TMD166-MU1基因群的產(chǎn)量限定性，對菌株TMD166-MU1 166A發(fā)酵產(chǎn)量的提高均有良好誘變效果，同時表明在以抑菌圈直徑作為抑菌活性評價指標(biāo)下，30和60 keV兩種不同注入能量條件總體上對菌株的誘變效果并無顯著性差異。

2.5 高產(chǎn)菌株發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC檢測

按圖1所示誘變篩選流程，對3批次30和60 keV能量N+離子注入獲得的1617個突變株開展基于牛津杯固體發(fā)酵的高通量初篩，獲得277個正突變菌株。進(jìn)一步開展搖瓶復(fù)篩，所獲發(fā)酵液采用杯碟法進(jìn)行生物活性檢測，根據(jù)抑菌圈直徑選擇出52株正突變菌株發(fā)酵液的乙酸乙酯提取樣品進(jìn)行HPLC分析，測定突變株的化學(xué)效價（圖7A）。結(jié)果顯示，復(fù)篩效價是出發(fā)菌株1.5倍以上的有4株，最終篩選出1株高產(chǎn)菌株IK-3，其166A產(chǎn)量是出發(fā)菌株的1.8倍[（18±

2.5） μg/mL]，HPLC分析見圖7B。

3 討論與結(jié)論

優(yōu)良的菌種是實現(xiàn)沙漠來源微生物藥物開發(fā)利用的根本，而在沙漠來源的微生物菌株選育中，高突變率的誘變手段及高通量的篩選方法至關(guān)重要。本研究首次將低能N+離子注入誘變技術(shù)結(jié)合卡那霉素抗性篩選及牛津杯固體發(fā)酵高通量篩選的集成方法綜合應(yīng)用于沙漠來源的小單孢菌產(chǎn)166A的高產(chǎn)菌株選育。以作用于核糖體的卡那霉素作為選擇壓力，定向篩選核糖體變異菌株，減少了菌株傳統(tǒng)篩選的盲目性和不定向性[19]。采用基于牛津杯固體發(fā)酵166A高產(chǎn)菌種的高通量篩選方法，與傳統(tǒng)搖瓶篩選方法相比，該方法操作簡便，縮短了菌株篩選周期，加大了菌株初篩數(shù)量，可高效、低成本、快速篩選沙漠來源小單孢菌166A的高產(chǎn)菌株。通過研究注入能量為30和60 keV，不同注入劑量與小單孢菌正突變率的生物學(xué)效應(yīng)關(guān)系，確定了在注入能量為30 keV、注入劑量4×1013 ions/cm2、卡那霉素抗性篩選濃度為6 mg/L條件下，以突變株發(fā)酵效價為指標(biāo)的正突變率最高可達(dá)36.33%，能快速有效地提高166A產(chǎn)生菌的生物合成能力。最終獲得1株發(fā)酵單位是出發(fā)菌株1.8倍的高產(chǎn)菌株IK-3，為該菌株的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定了良好基礎(chǔ)。

相比傳統(tǒng)輻射在育種工作中的優(yōu)缺點，低能離子注入具有其獨特的優(yōu)點。X、γ-rays等光子級的電離輻射對生物體產(chǎn)生的輻射生物學(xué)損傷主要是單一的能量沉積作用的結(jié)果，它們本身既無靜止質(zhì)量，又不帶電荷，而離子注入不僅具有能量沉積效應(yīng)，還具有動量傳遞所產(chǎn)生的離子濺射、電子濺射和化學(xué)濺射效應(yīng)，這些作用直接導(dǎo)致對生物膜的刻蝕損傷，而且注入離子所帶的電荷也將對生物膜的跨膜電位產(chǎn)生重要影響，這些都會導(dǎo)致離子注入下生物膜的輻射損傷與γ-rays等電離輻射有著重要的不同[11]，從而較好地彌補(bǔ)了傳統(tǒng)誘變方法的不足。龔加順等[20]利用離子束輻照黑曲霉孢子進(jìn)行誘變，驗證了離子注入后，離子劑量與孢子細(xì)胞表面刻蝕程度呈正相關(guān)。注入離子后的孢子有明顯破壁現(xiàn)象，孢子上有明顯的凹陷區(qū)，離子破壞細(xì)胞壁 、膜后到達(dá)細(xì)胞表面或內(nèi)部，進(jìn)行動量交換，影響胞內(nèi)物質(zhì)的運動，導(dǎo)致染色體結(jié)構(gòu)的重排和其他變化，從而產(chǎn)生穩(wěn)定的遺傳變化。

本研究也證實低能離子注入在誘變的生物學(xué)效應(yīng)上與其他輻射誘變源相比確有不同。菌株的存活率曲線在30和60 keV注入能量條件下均呈現(xiàn)出特異的雙回復(fù)峰；這種特異的存活率曲線與γ射線等其他射線輻照生物有機(jī)體后呈現(xiàn) “指數(shù)型”或“肩型”的存活劑量關(guān)系相比有明顯不同[11]；2～8×1013 ions/cm2

劑量范圍內(nèi)與曾報道過的“馬鞍型”曲線也不完全相同[6]。盡管“雙回復(fù)峰”與“馬鞍型”曲線不同，但是它的確能夠反映離子注入這種特異的誘變源所具有的獨特誘變效果，說明離子注入的誘變效應(yīng)具有出現(xiàn)反常損傷的特性?；诘湍茈x子注入致微生物突變機(jī)制的復(fù)雜性，以及其與生物內(nèi)部相互作用的不確定性，其誘變效應(yīng)的機(jī)制還需進(jìn)一步研究，使其在微生物育種中發(fā)揮更大的作用。

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文章編號：1001-8689（2024）09-0995-09

收稿日期：2024-02-05

基金項目：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程項目（No. 2021-1-I2M-028）

作者簡介：戴劍漉，男，生于1975年，碩士，副主任技師，研究方向為放線菌代謝工程，E-mail： daijianlu6511@aliyun.com

*通信作者，E-mail： sunchenghang@imb.pumc.edu.cn