西番蓮屬25個種（品種）花粉活力檢驗方法篩選及其花粉活力和柱頭可授性比較分析

摘" " 要：【目的】探究25種西番蓮（包括8個地方品種、15個引進品種/品系和2個選育品種/品系）的花粉活力和柱頭可授性，為西番蓮雜交親本的選擇提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳?5種西番蓮為試材，采用花粉離體培養(yǎng)、TTC染色和I2-KI染色方法檢測西番蓮花粉活力，利用聯(lián)苯胺-過氧化氫法檢測柱頭可授性。【結(jié)果】25種西番蓮均具有柱頭可授性，但可授性存在差異。在TN、HX No.1、W-1、KSTS、XG和GH等6種具有代表性的西番蓮中，花粉離體培養(yǎng)的最適條件僅蔗糖濃度存在差異，分別為10%和15%?；ǚ垭x體培養(yǎng)和TTC染色法均可用于25種西番蓮花粉活力的檢測?；诨ǚ刍盍Φ木垲惙治隹煞譃?個類群，其中第Ⅰ類群和第Ⅱ類群共22個種，均屬于正?？捎愋停冖箢惾喊?個種，均屬于高不育類型?！窘Y(jié)論】花粉離體培養(yǎng)是最能呈現(xiàn)25種西番蓮花粉活力的檢測方法，TTC染色法可作為西番蓮花粉活力的快速檢測方法。除ZL、LX和RX適宜作雜交母本外，其余種均可作雜交父本或母本。

關(guān)鍵詞：西番蓮屬；花粉活力；柱頭可授性；雜交育種

中圖分類號：S667.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1009-9980（2024）10-1947-14

Screening of pollen viability test methods and comparative analysis of pollen viability and stigma acceptability from 25 species of Passiflora L.

WU Bin1， WANG Jiazhi2#， XING Wenting1， SONG Shun1， HUANG Haijie1， LI Hongli1， HU Wenbin1， MA Funing1， HUANG Dongmei1*

（1Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China， Ministry of Agriculture and Rual Affairs/Key Laboratory of Tropical Crops Germplasm Resources Genetic Improvement and Innovation of Hainan Province/Germplasm Repository of Passiflora， Hainan Province， Danzhou 571101， Hainan， China; 2College of Tropical Crop Science， Yunnan Agricultural University， Puer 665099， Yunnan， China）

Abstract： 【Objective】 The study aimed to test the pollen viability and stigma receptivity of 25 species [including 8 local varieties are Tainong （TN）， Xintainong （XTN）， Qinmi No. 9 （QM No. 9）， Fengmihuangjinbaixiangguo （FMHJ）， Yuanyangmi （YYM）， Juwubabaixiangguo （D1-A1）， Tianhuangxing （THX）， Zhuangxiangmibao （ZXMB）， 15 introduced varieties/strains are Guanhua （GH）， Kangsitansi（KSTS）， W-1， Honghuaxifanlian （XG）， Jingchixifanlian （MGMX）， Ruixiang （RX）， Zilian （ZL）， Zhangyexifanlian （JMCH）， Lüpi （LP）， Qingpi （QP）， Hongguan （HG）， ZZ-B1， Lüpixifanlian （Ⅱ-Y）， Wulaguireqingguo （ULGRQG）， Lanxiang （LX）， and 2 selected varieties/strains are Huangxiang No. 1 （HX No. 1）， Xiaohuagnjin （D2-11）.] of Passiflora L.， and provide theoretical basis for the selecting parents for crossing in Passiflora L. 【Methods】 Using six representative species of Passiflora L. as test materials， including TN， HX No. 1， GH， W-1， XG and KSTS a single-factor experiment was conducted using a basic medium containing 0.02% boric acid （H3BO3）， 15% sucrose， 15% PEG-4000， 0.08% calcium nitrate [Ca（NO3）2·4H2O]， and 0.02% MgSO4·7H2O to screen optimal conditions for pollen viability test in vitro. The 25 species of Passiflora L. were used as materials， the basic floral morphological parameters were measured. Pollen vitality was detected using pollen culture in vitro， TTC staining， and I2-KI staining methods to compare differences of pollen vitality of different species with different detection methods. Additionally， the stigmatic receptivity of the 25 species of Passiflora L. was compared and analyzed using the benzidine-hydrogen peroxide method. 【Results】 The results showed that all the 25 species of Passiflora L. exhibited different stigma receptivity. Among them， the 19 species including TN， HX No. 1， W-1， XG， XTN， QM No. 9， MGMX， LP， QP， FMHJ， HG， YYM， ZZ-B1， D1-A1， THX， ZXMB， D2-11， Ⅱ-Y and ULGRQG exhibited strong stigma receptivity. The 3 species， GH， KSTS and JMCH had moderate stigma receptivity， while another 3 species， RX， ZL and LX showed weaker stigma receptivity. Only the optimal sucrose concentration for different species was different in pollen culture in vitro. Aong the 6 species tested， the optimal sucrose concentration for TN， HX No. 1， GH and KSTS was 15%， while the optimal sucrose concentration for W-1 and XG was 10%. The optimal concentrations of boric acid， PEG-4000， and calcium nitrate were 0.02%， 15%， and 0.08%， respectively， with an optimal incubation temperature of 25 ℃. The pollen culture in vitro was the most effective method for demonstrating the pollen vitality of the 25 species， followed by TTC staining， which could serve as a rapid detection method. The I2-KI staining was not suitable for detecting the pollen vitality of Passiflora L. Based on pollen culture in vitro and TTC staining methods， the 25 species of Passiflora L. was classified into three groups by cluster analysis. GroupⅠ consisted of 21 species， including FMHJ， ZXMB， W-1， Ⅱ-Y， LP， XTN， TN， THX， QM No. 9， ULGRQG， HX No. 1， D1-A1， D2-11， YYM， XG， MGMX， QP， HG， ZZ-B1， KSTS and JMCH with pollen vitality above 70%， being considered as normally fertile. Group Ⅱ consisted of only one species， GH with pollen vitality between 50% and 70%， also being considered as normally fertile. Group Ⅲ included three species， ZL， LX and RX which belonged to the high sterile category. 【Conclusion】 Among the three detection methods， pollen vitro-culture is the most effective method for evaluating the pollen vitality of the 25 species of Passiflora L.， while the TTC staining method could serve as a rapid alternative. Among the 25 species （varieties） of Passiflora L.， ZL， LX and RX could be only used as female parents for hybridization， while the other 22 species could be used as either male or female parents for hybridization.

Key words： Passiflora L.; Pollen viability; Stigma acceptability; Cross breeding

西番蓮屬（Passiflora L.）是西番蓮科（Passiflorine）的草質(zhì)藤本植物，兼具花型美觀、氣味芬芳、果實美味、營養(yǎng)豐富等優(yōu)點于一身。近年來國際市場對西番蓮果汁的需求以每年15%～20%的速度增長，盡管西番蓮產(chǎn)業(yè)發(fā)展速度較快，產(chǎn)業(yè)鏈日益健全，但仍然處于發(fā)展的初級階段，存在較多的問題亟須解決。在西番蓮的規(guī)?；a(chǎn)中，商業(yè)主栽品種雖然被廣泛種植，但在某些遺傳特性方面仍然存在著不少缺陷，如果實性狀不穩(wěn)定、果實風(fēng)味較差等，而那些尚未進行商業(yè)化栽培的種質(zhì)卻表現(xiàn)出某些性狀的優(yōu)異特性，這說明了不同西番蓮種質(zhì)間在遺傳上具有一定的差異，并有望在育種上加以利用[1]。從20世紀(jì)60年代起，科研工作者就開始對西番蓮的遺傳與育種進行研究，國外西番蓮的雜交育種較為活躍[2]，尤其是觀賞西番蓮的種間雜交[3-4]。而中國西番蓮種質(zhì)資源評價與育種起步較晚，原始品種創(chuàng)新的突破則需加速開展雜交育種工作[5-6]。

體外花粉萌發(fā)是評估花粉活力最常用的方法，能夠模擬體內(nèi)條件[7]，并能夠展示成功萌發(fā)和發(fā)育、花粉授粉和受精所需的生理和生化條件[8]，在花粉活力研究中已得到廣泛應(yīng)用。前人對西番蓮花粉活力和柱頭可授性做了一定的研究，陳媚等[9]對6個西番蓮品種（小黃金1號、大黃金1號、臺農(nóng)、滿天星、紅花、紫花）進行花粉活力的動態(tài)分析和比較，發(fā)現(xiàn)不同品種花粉活力持續(xù)時間不同，除紫花西番蓮?fù)?，其他品種花粉活力均在花朵完全開放前后達(dá)到峰值。蔡昭艷等[10]探討了臺農(nóng)一號西番蓮花不同發(fā)育階段的花粉活力、柱頭可授性及其對坐果的影響，并通過培養(yǎng)基組分、光照、溫度等因素，探究其對西番蓮花粉體外萌發(fā)的影響，篩選獲得西番蓮花粉離體萌發(fā)的最適培養(yǎng)基組分、pH和培養(yǎng)時間。前人對西番蓮花粉離體萌發(fā)的研究取得了一定的進展，為其進一步研究西番蓮花粉活力提供了基礎(chǔ)，但現(xiàn)有研究主要集中在一種培養(yǎng)條件下，忽略了不同種質(zhì)間的差異性，使用同一種培養(yǎng)基難以反映出不同種質(zhì)的真實花粉活力。這在Soares等[11]對17個西番蓮品種進行的花粉體外萌發(fā)實驗中得以驗證，發(fā)現(xiàn)不同品種的西番蓮花粉萌發(fā)存在差異，且在很大程度上受同一物種的基因型變異影響，也可能是遺傳物質(zhì)的發(fā)育條件和用于萌發(fā)的培養(yǎng)基導(dǎo)致，而國內(nèi)這類研究還未見報道。

花粉活力和柱頭可授性強弱是植物生殖生長的關(guān)鍵，了解西番蓮的花粉活力和柱頭可授性對西番蓮雜交育種具有重要意義。目前西番蓮屬植物的花粉活力和柱頭可授性研究多集中在對不同種（品種）西番蓮的花粉形態(tài)、花生物學(xué)和行為等方面[12-14]，很少涉及與生殖系統(tǒng)、花粉活力相關(guān)的研究。筆者進一步優(yōu)化西番蓮花粉離體萌發(fā)培養(yǎng)基組分濃度及培養(yǎng)溫度，并對25種西番蓮（包括8個地方品種、15個引進品種/品系和2個選育品種/品系）進行柱頭可授性分析，同時采用不同方法測定花粉活力，尋找測定西番蓮屬花粉活力的快速有效檢測方法，探究25種西番蓮花粉活力的差異性，為提高西番蓮坐果率以及在不同西番蓮種間開展遠(yuǎn)緣雜交育種提供研究依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試材及取樣

西番蓮屬25個種（包括8個地方品種、15個引進品種/品系和2個選育品種/品系）均來自海南省西番蓮種質(zhì)資源圃（儋州），根據(jù)資源圃編號及花形態(tài)學(xué)信息對25個種進行梳理（表1、圖1）。

花粉離體培養(yǎng)以TN、HX No. 1、GH、W-1、XG和KSTS等6種具有代表性的西番蓮為供試材料；柱頭可授性、花粉離體培養(yǎng)、TTC和I2-KI染色等試驗以西番蓮屬25個種為供試材料。西番蓮屬每個種各采集5枚盛花期即將開放的花蕾，待花藥自然裂開，在25 ℃下將花藥和柱頭用鑷子輕輕取下，放置于稱量紙上備用。

1.2 柱頭可授性檢測

采用聯(lián)苯胺-過氧化氫法測定柱頭可授性。取下柱頭浸入盛有聯(lián)苯胺-過氧化氫溶液（1%聯(lián)苯胺∶3%過氧化氫∶蒸餾水=4∶11∶22，體積比）的培養(yǎng)皿中，20 min 后觀察柱頭染色情況和氣泡的產(chǎn)生，柱頭呈深褐色同時有大量氣泡不斷冒出，可認(rèn)定為該柱頭具有可授性。若柱頭呈深褐色并有少的氣泡冒出，說明柱頭可授性較弱，用+表示；若柱頭呈深褐色并有較多氣泡冒出，說明柱頭可授性中等，用++表示；若柱頭呈深褐色并有大量氣泡冒出，說明柱頭可授性較強，用+++表示。

1.3 花粉離體培養(yǎng)

花粉離體培養(yǎng)采用液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)方法。具體方法為：用鑷子取下適量花粉放入載玻片的凹槽中，然后放入相應(yīng)濃度培養(yǎng)基，輕輕將載玻片放入培養(yǎng)皿中，覆上保鮮膜，并將培養(yǎng)皿放置于預(yù)先設(shè)置好的人工氣候培養(yǎng)箱中。所有濃度梯度試驗均在黑暗、25 ℃下進行培養(yǎng)，培養(yǎng)時間均為4 h。

以0.02%（w，后同）H3BO3 +15% 蔗糖+15% PEG-4000+0.08% Ca（NO3）2·4 H2O+0.02% MgSO4·7 H2O為基礎(chǔ)培養(yǎng)基開展單因素試驗。分別設(shè)置以下濃度梯度，蔗糖濃度：5%、10%、15%、20%、25%；H3BO3濃度：0%、0.02%、0.04%、0.06%、0.08%；PEG-4000濃度：0%、5%、10%、15%、20%；硝酸鈣[Ca（NO3）2·4H2O]濃度：0%、0.02%、0.04%、0.08%、0.16%；溫度：20、25、30、35、40、45 ℃。每個處理設(shè)置5次重復(fù)。

1.4 TTC和I2-KI染色

TTC染色。待花粉干燥后用軟毛筆將花粉輕輕掃入5 mL離心管中，使其充分混勻。使用50%蔗糖溶解TTC至終濃度為1%的TTC染色液，并使其浸沒花粉，然后迅速將離心管放入預(yù)先設(shè)置好溫度的37 ℃恒溫箱中，避光染色15 min后用移液槍將染色花粉移至載玻片凹槽中。在ZEISS顯微鏡下觀察統(tǒng)計6個視野中紅色花粉粒的比例，設(shè)置5次重復(fù)，統(tǒng)計不少于500?；ǚ鄣娜旧壤?/p>

I2-KI染色。取適量花粉放入載玻片的凹槽中，滴加1滴30%蔗糖溶液，使花粉充分散開后滴加1～2滴I2-KI染色液，染色5～10 min。在ZEISS顯微鏡下觀察統(tǒng)計6個視野中藍(lán)色花粉粒的比例，設(shè)置5次重復(fù)，統(tǒng)計不少于500粒花粉的染色比例。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用IBM SPSS Statistics 22軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和差異顯著性分析，采用最遠(yuǎn)鄰元素法進行花粉聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 柱頭可授性比較分析

采用聯(lián)苯胺-過氧化氫法對25種西番蓮進行柱頭可授性檢測，結(jié)果（表2）表明，25種西番蓮的柱頭在浸沒于聯(lián)苯胺-過氧化氫溶液中均產(chǎn)生不同程度的氣泡，且柱頭顏色變化也有明顯差異。其中，TN、HX No. 1、W-1、XG、XTN、QM No. 9、MGMX、LP、QP、FMHJ、HG、YYM、ZZ-B1、D1-A1、THX、ZXMB、D2-11、Ⅱ-Y和ULGRQG等19種西番蓮的柱頭可授性較強，GH、KSTS、JMCH等3種的柱頭可授性中等，RX、ZL、LX等3種的柱頭可授性較弱。由此說明，25種西番蓮均具有可授性，但可授性強度存在差異。

2.2 蔗糖、硼酸、PEG-4000、硝酸鈣和培養(yǎng)溫度對6種具有代表性的西番蓮花粉萌發(fā)的影響

2.2.1 蔗糖 蔗糖是花粉離體萌發(fā)的碳源，西番蓮花粉離體萌發(fā)率受培養(yǎng)基中蔗糖濃度的顯著影響（表3）。6種西番蓮花粉萌發(fā)率隨著蔗糖濃度的增加均呈先上升后下降的趨勢，在蔗糖濃度分?jǐn)?shù)為15%時，TN、HX No. 1、KSTS和GH等4種西番蓮花粉萌發(fā)率達(dá)到最高，分別為87.81%、91.17%、70.12%和67.03%。而W-1和XG在蔗糖濃度為10%時達(dá)到最高，分別為86.67%和92.22%。由此說明單一的蔗糖濃度并不適宜25種西番蓮花粉萌發(fā)的檢測，不同種的西番蓮花粉離體培養(yǎng)對培養(yǎng)基蔗糖濃度的適宜程度不同，具有顯著的差異性。

2.2.2 硼酸 西番蓮花粉離體萌發(fā)率受培養(yǎng)基中硼酸濃度的顯著影響（表4）。6種西番蓮的花粉萌發(fā)率隨著硼酸濃度的增加均呈出先上升后下降的趨勢，當(dāng)硼酸濃度為0.02%時，TN、HX No. 1、W-1、KSTS、XG和GH等6種西番蓮的花粉萌發(fā)率均達(dá)到最高，分別為88.70%、90.92%、77.86%、71.91%、88.53%和68.76%。

2.2.3 PEG-4000 PEG-4000是西番蓮花粉離體萌發(fā)的必要組分之一，主要維持滲透壓平衡，西番蓮花粉離體萌發(fā)率受培養(yǎng)基中PEG-4000濃度的顯著影響（表5）。6種西番蓮花粉萌發(fā)率隨PEG-4000濃度的增加均呈出先上升后下降的趨勢，當(dāng)PEG-4000濃度為15%時，TN、HX No. 1、W-1、KSTS、XG和GH等6種西番蓮的花粉萌發(fā)率均達(dá)到最高，分別為87.64%、91.10%、86.10%、71.20%、91.49%和65.82%。

2.2.4 硝酸鈣 硝酸鈣雖不是西番蓮花粉體外萌發(fā)的必需組分，但硝酸鈣濃度對6種西番蓮花粉萌發(fā)率均有顯著影響（表6）?；ǚ勖劝l(fā)率隨著硝酸鈣濃度的增加均呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)硝酸鈣濃度為0.08%時，TN、HX No. 1、W-1、KSTS、XG和GH等6種西番蓮的花粉萌發(fā)率均達(dá)到最高，分別為87.55%、90.60%、86.13%、70.46%、91.06%和68.75%，均與濃度為0.04%硝酸鈣無顯著差異，因此也可使用0.04%的硝酸鈣濃度為培養(yǎng)基組分。

2.2.5 培養(yǎng)溫度 溫度對西番蓮花粉萌發(fā)率生長具有顯著影響（表7），6種西番蓮花粉萌發(fā)率隨著溫度的升高均呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)培養(yǎng)溫度達(dá)到25 ℃時，TN、HX No. 1、W-1、KSTS、XG和GH等6種西番蓮的花粉萌發(fā)率均達(dá)到最高，分別為88.38%、90.58%、85.81%、71.22%、91.28%和65.55%。當(dāng)培養(yǎng)溫度為45 ℃時，TN、HX No. 1和GH花粉均不萌發(fā)，而W-1、KSTS和XG在此條件下花粉仍能萌發(fā)，萌發(fā)率分別為21.46%、12.04%和53.01%。由此可見，KSTS、W-1和XG的花粉具有一定的耐高溫特性，其中XG的花粉耐高溫程度最高。

2.3 3種花粉活力測定方法對25種西番蓮花粉活力的比較分析

通過對花粉離體培養(yǎng)、TTC染色和I2-KI染色等3種方式進行對比，發(fā)現(xiàn)這3種花粉活力檢測方法均檢測出西番蓮的花粉活力，但不同檢測方法的西番蓮花粉活力存在顯著差異（表8），相較TTC和I2-KI染色法而言，花粉離體培養(yǎng)是最能呈現(xiàn)25種西番蓮花粉活力的檢測方法，TTC染色法與花粉離體培養(yǎng)法對花粉活力的檢測結(jié)果相接近，可作為西番蓮花粉活力的快速檢測方法，因此，在進行花粉活力研究過程中可以將TTC染色法與花粉離體培養(yǎng)法作對比，而I2-KI染色法的結(jié)果與前兩者差異較大，并不適用于西番蓮花粉活力的檢測。

2.4 基于花粉活力的聚類分析

基于25種西番蓮花粉離體培養(yǎng)和TTC染色法的花粉活力數(shù)據(jù)，采用最遠(yuǎn)鄰元素法對25種西番蓮進行聚類，在遺傳距離5處，可將25種西番蓮分為3個類群，第Ⅰ類群包含21個種類，分別為FMHJ、ZXMB、W-1、Ⅱ-Y、LP、XTN、TN、THX、QM No. 9、ULGRQG、HX No. 1、D1-A1、D2-11、YYM、XG、MGMX、QP、HG、ZZ-B1、KSTS、JMCH，花粉活力均在70%以上；第Ⅱ類群包含1個種類GH，花粉活力在50%～70%之間；第Ⅲ類群包含3個種類，分別為ZL、LX、RX，花粉活力均在10%以下（圖2）。由此說明西番蓮屬的花粉活力具有多樣性。

3 討 論

柱頭和花粉是植物進行有性生殖的重要組成部分，研究柱頭可授性及花粉活力，不僅能夠提高坐果率，而且對人工授粉、提高雜交育種的效率也具有重要意義。柱頭可授性的強弱是決定育種工作成功與否的指標(biāo)之一[15]，可通過柱頭可授性的強弱進而明確雜交父母本的選擇，減少雜交的盲目性。采用聯(lián)苯胺-過氧化氫溶液處理后的西番蓮柱頭會發(fā)生氧化還原反應(yīng)，通過柱頭顏色的變化和氣泡的產(chǎn)生判斷柱頭可授性的強弱。25種西番蓮中的TN、HX No. 1、W-1、XG、XTN、QM No. 9、MGMX、LP、QP、FMHJ、HG、YYM、ZZ-B1、D1-A1、THX、ZXMB、D2-11、Ⅱ-Y和ULGRQG等19種柱頭可授性較強，可作為雜交父本。

除柱頭可授性外，花粉活力是影響雜交成功率的關(guān)鍵因素。筆者對TN、HX No. 1、GH、W-1、XG和KSTS等6種在花型、果實性狀、葉片形狀等具有代表性的西番蓮進行花粉離體萌發(fā)最適培養(yǎng)基組分、濃度和培養(yǎng)溫度的篩選研究。6種西番蓮的花粉離體培養(yǎng)最適硼酸、PEG-4000和硝酸鈣濃度的需求一致，分別為0.02%、15%、0.08%，僅PEG-4000濃度與前人在西番蓮上的研究結(jié)果相一致[10，16]，而硼酸、濃度和蔗糖濃度均存在差異。

硼酸被認(rèn)為是花粉萌發(fā)及花粉管生長的關(guān)鍵物質(zhì)，鈣是作物花粉管生長中所必需的營養(yǎng)物質(zhì)。本研究結(jié)果表明，硼酸和硝酸鈣濃度顯著影響25種西番蓮花粉離體萌發(fā)率，是西番蓮花粉體外萌發(fā)的必需物質(zhì)，適當(dāng)濃度可促進花粉管萌發(fā)，但濃度過高會產(chǎn)生抑制作用。不同植物花粉離體萌發(fā)對硼酸和硝酸鈣濃度的需求存在較大差異，火龍果花粉離體萌發(fā)最適硼酸質(zhì)量濃度為500 mg·L-1[17]，蘋果花粉離體萌發(fā)最適硼酸和硝酸鈣質(zhì)量濃度分別為40 mg·L-1和20 mg·L-1 [18]，茶樹花粉離體萌發(fā)最適硼酸和硝酸鈣質(zhì)量濃度分別為150 mg·L-1和100 mg·L-1 [19]，甘蔗花粉離體萌發(fā)最適硼酸和硝酸鈣質(zhì)量濃度分別為400 mg·L-1和100 mg·L-1[20]。本研究中西番蓮花粉的最適硼酸和硝酸鈣質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.02%和0.08%，與蔡昭艷等[10]報道的硼酸質(zhì)量濃度25 mg·L-1、硝酸鈣質(zhì)量濃度300 mg·L-1存在一定差異，可能是不同時期、不同種植環(huán)境所造成的，因此在雜交育種和生產(chǎn)中，對授粉后的花噴施適當(dāng)濃度的硼酸和硝酸鈣可促進花粉管萌發(fā)。

蔗糖作為花粉離體萌發(fā)的必不可少的碳源和能源物質(zhì)，其最適濃度因物種而異。李范[21]在探究不同培養(yǎng)條件對錦帶花粉萌發(fā)的影響中表明，蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%有利于錦帶花花粉萌發(fā)，較低或較高質(zhì)量分?jǐn)?shù)對花粉萌發(fā)有抑制作用，而在葡萄[22]、桃[23]、梨[24]等物種中，花粉離體萌發(fā)的最適蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%。此外，朱江華等[25]研究表明，6個藍(lán)莓品種花粉萌發(fā)所需的最適蔗糖濃度不盡相同，萊格西、布里吉塔、密斯梯在蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時，花粉萌發(fā)率均最高，當(dāng)蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%時，夏普藍(lán)、粉藍(lán)、梯芙藍(lán)等3個藍(lán)莓品種的萌發(fā)率均達(dá)到最高。這一結(jié)果與本研究中TN、HX No. 1、KSTS和GH等4種西番蓮最適蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%，W-1和XG等2種西番蓮最適蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的研究結(jié)論相一致，表明同一作物不同種間離體培養(yǎng)對蔗糖濃度的需求也存在差異，可能是西番蓮基因型的差異所造成的，其中TN、HX No. 1、KSTS和GH的葉片類型為掌狀三裂，W-1和XG葉片呈單裂，遺傳差異較大。因此在后續(xù)開展花藥離體培養(yǎng)試驗時需要進行蔗糖濃度梯度分析。

溫度是影響花粉萌發(fā)、坐果率的主要因素[26]。前人研究表明，不同作物的花粉最適萌發(fā)溫度差異較大，海仙花花粉萌發(fā)最適溫度為20 ℃[27]，綿帶花花粉萌發(fā)最適溫度為25 ℃[21]，獼猴桃花粉萌發(fā)最適溫度為30 ℃[28]。筆者在本研究中發(fā)現(xiàn)不同溫度對西番蓮花粉萌發(fā)具有顯著影響，但6種具有代表性的西番蓮最適溫度均為25 ℃。蔡昭艷等[16]用擬合方程預(yù)算出臺農(nóng)一號西番蓮花粉離體萌發(fā)的溫度范圍為6.19～45.13 ℃，最適溫度為25.69 ℃，這與本研究結(jié)果一致。當(dāng)培養(yǎng)溫度達(dá)到45 ℃時，TN、HX No. 1、GH的花粉已不萌發(fā)，而KSTS、W-1和XG在此條件下花粉仍能萌發(fā)，這與前人在杧果、榛子等作物上的研究結(jié)果相一致[29-30]。由此可說明，KSTS、W-1和XG可用于以耐高溫為育種目標(biāo)的雜交親本材料。

前人在對花粉活力的研究中使用不同的檢測方法，主要有花粉離體培養(yǎng)和染色法[31]?；ǚ垭x體培養(yǎng)法是反映花粉活力的最好方式，被廣泛使用于各類作物中，而染色法以TTC、I2-KI、MTT和醋酸洋紅染色為主[32]，但并不適用于所有物種。在云杉中使用I2-KI染色法和醋酸洋紅染色法染色效果不佳，而TTC染色法和花粉離體培養(yǎng)法效果較好[33]，而在通關(guān)藤中最適合花粉活力的測定方法為I2-KI染色法[34]。筆者在對25種西番蓮進行花粉離體培養(yǎng)、TTC和I2-KI染色的對比結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，花粉離體培養(yǎng)法結(jié)果最佳，這與前人的研究結(jié)果一致，TTC染色法也能較好地反映花粉活力，可作為西番蓮屬花粉活力快速檢測方法。而I2-KI染色法結(jié)果與前兩者差異過大，并不適用于西番蓮花粉活力的檢測。25種西番蓮的花粉活力存在明顯差異，這與在葡萄[35]、三角梅[36]、萱草[37]、桃[38]、獼猴桃[39]等植物中的研究結(jié)果相一致。Soares等[40]研究表明，西番蓮不同種之間的差異可能受到同一物種基因型差異的影響，駱東靈等[41]和Kakani等[42]分別在薔薇和棉花中觀察到花粉離體萌發(fā)因品種而異。由此可見，不同種西番蓮花粉活力產(chǎn)生差異的原因，可能與選育、進化過程中的遺傳變異相關(guān)。

花粉活力能夠反映種間特異性，可以運用于種與品種之間的區(qū)分[43]，為物種分類提供重要的依據(jù)。張良英等[44]在不同軟棗獼猴桃雄株花粉離體培養(yǎng)條件及花粉性狀比較的研究中，依據(jù)單花花粉量、萌發(fā)率與花粉管長度進行聚類分析，將15份雄株分為4個類群。杜文文等[45]采用最短距離法對30種秋海棠花粉活力進行聚類，可將30種秋海棠分為6個類群。筆者基于25種西番蓮花粉離體培養(yǎng)和TTC染色法的花粉活力，將25種西番蓮分為3個類群。從遺傳角度分析，花粉萌發(fā)率為花粉育性的重要指示指標(biāo)，可以直接反映雄配子的育性發(fā)育狀況，與雜交育種中父母本的選擇密切相關(guān)。對花粉活力進行分級，可以劃分為不同等級的育性，一般花粉可育率為0，定為全不育；小于5%，為高不育；≥5%～30%，為半不育；＞30%～50%，為低不育；＞50%，為正?？捎齕46]。由此可將25種西番蓮分為正?？捎?、高不育兩類，其中聚類的第Ⅰ類群和第Ⅱ類群共22個種均屬于正常可育類型，雜交時可以作父本；第Ⅲ類群中含3個種均屬于高不育類型，適宜作母本。

4 結(jié) 論

花粉離體培養(yǎng)是最能呈現(xiàn)25種西番蓮花粉活力的檢測方法，TTC染色法與花粉離體培養(yǎng)法相比，可作為西番蓮花粉活力的快速檢測方法。25種西番蓮屬中，ZL、LX和RX適宜作雜交母本，而FMHJ、ZXMB、W-1、Ⅱ-Y、LP、XTN、TN、THX、QM No.9、ULGRQG、HX No. 1、D1-A1、D2-11、YYM、XG、MGMX、QP、HG、ZZ-B1、KSTS、JMCH、GH等22種西番蓮均可作雜交父本或母本。

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