富氫水對急性肝損傷小鼠模型的保護作用研究

摘要：目的" 研究富氫水對小鼠急性肝損傷的保護作用。方法" 60只雄性KM小鼠隨機分為空白組、模型組、陽性對照組、富氫水低劑量組、富氫水中劑量組和富氫水高劑量組。除空白組外，各組小鼠腹腔注射0.3%的CCl4制備急性肝損傷模型。觀察肝臟的形態(tài)變化，計算肝指數(shù)，HE染色觀察肝臟病理變化并進行病理評分。檢測小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽紅素（TBIL-F）、直接膽紅素（DBIL-F）的濃度。此外，分別收集空白組、模型組和富氫水中劑量處理組小鼠的肝臟組織（n=5）進行轉(zhuǎn)錄組測序。結(jié)果" 與空白組相比，模型組肝組織顏色變淺，表面出現(xiàn)紋理，病理評分增高。與模型組相比，富氫水組肝組織損傷評分降低，肝指數(shù)降低，血清中ALT、AST、TBIL-F、DBIL-F濃度降低，富氫水組有100個基因上調(diào)，194個基因下調(diào)，共計294個差異基因。結(jié)論" 富氫水可通降低血清中ALT、AST、TBIL-F、DBIL-F的濃度，使肝臟組織中的基因表達特征向空白組靠近，降低肝損傷程度，最終在急性肝損傷小鼠模型中起到保肝作用。

關(guān)鍵詞：富氫水;急性肝損傷;保護;轉(zhuǎn)錄組測序

中圖分類號：R575;R-332" " " " " " " " " " " " " " "文獻標識碼：A" " " " " " " " " " " " " " "DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2024.19.003

文章編號：1006-1959（2024）19-0019-08

Study on the Protective Effect of Hydrogen-rich Water on Acute Liver Injury Model in Mice

SUI Jianliang1，2，3，WANG Zhen1，LIU Huiyun2，3，ZHAO Feiyue2，3，JIA Ruikang2，3，SHI Yuxiang1

（1.School of Life Sciences and Food Engineering，Hebei University of Engineering，Handan 056000，Hebei，China;

2.Hebei Provincial Key Laboratory of Innovative Research on Chinese Traditional Patent Stomach Medicine，

Handan，056000，Hebei，China;

3.Handan Pharmaceutical Co.， Ltd.，Handan 056000，Hebei，China）

Abstract：Objective" To study the protective effect of hydrogen-rich water on acute liver injury in mice.Methods" Sixty male KM mice were randomly divided into blank group， model group， positive control group， hydrogen-rich water low dose group， hydrogen-rich water dose group and hydrogen-rich water high dose group. Except for the blank group， mice in each group were intraperitoneally injected with 0.3% CCl4 to prepare acute liver injury model. The morphological changes of the liver were observed， the liver index was calculated， and the pathological changes of the liver were observed and scored by HE staining. The concentrations of alanine aminotransferase （ALT）， aspartate aminotransferase （AST）， total bilirubin （TBIL-F） and direct bilirubin （DBIL-F） in serum of mice were detected. In addition， the liver tissues （n=5） of mice in the blank control group， model group and hydrogen-rich water dose treatment group were collected for transcriptome sequencing.Results" Compared with the blank group， the color of liver tissue in the model group became lighter， the surface appeared texture， and the pathological score increased. Compared with the model group， the liver tissue injury score of the hydrogen-rich water group decreased， the liver index decreased， and the concentrations of ALT， AST， TBIL-F， and DBIL-F in the serum decreased. In the hydrogen-rich water group， 100 genes were up-regulated and 194 genes were down-regulated， a total of 294 differentially expressed genes.Conclusion" Hydrogen-rich water can reduce the concentration of ALT， AST， TBIL-F and DBIL-F in serum， make the gene expression characteristics in liver tissue close to the blank control group， reduce the degree of liver injury， and finally play a protective role in the mouse model of acute liver injury.

Key words：Hydrogen-rich water;Acute liver injury;Protection;RNA-seq

氫氣（H2）是非極性、疏水性的，是最小的分子，因此它可快速擴散通過細胞膜，到達線粒體、細胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和其他亞細胞室。富氫水（hydrogen-rich water， HRW）是將一定濃度的氫氣溶于水中制成的，為氫氣在疾病預防和治療中的廣泛應用奠定了更方便、安全可行的基礎(chǔ)[1]。富氫水中的H2極易被人體吸收利用。H2的潛在治療作用現(xiàn)已在多種不同的人類和動物疾病模型中得到證實[2]。研究表明[3]，富氫水可選擇性清除過量羥自由基，有效減輕機體氧化損傷，在不同病理狀態(tài)下減輕組織的炎性損傷。急性肝損傷（acute liver injury， ALI）是一個嚴重的健康問題，是肝病的最主要原因之一，發(fā)病率和死亡率都很高[4]，包括病毒、脂質(zhì)沉積和藥物在內(nèi)的多種肝毒性因素可導致急性肝損傷，全世界3.5%的死亡由肝病引起[5，6]。四氯化碳（CCl4）是一種典型的肝毒性化合物，廣泛用于誘導急性肝損傷模型，用于機制和治療研究[7]。本研究旨在分析富氫水對小鼠急性肝損傷的保護作用，為肝病的治療提供參考。

1材料與方法

1.1材料與儀器" 富氫水購于北京活力氫源飲品有限公司;溶解氫濃度測定試劑（日本），四氯化碳（CCl4）、無水乙醇、二甲苯試劑購于生工;注射用橄欖油、中性樹膠購于索萊寶;4%多聚甲醛、HE染色試劑盒購于碧云天。獨立通氣籠盒系統(tǒng)購于山東新華醫(yī)療;正置白光拍照顯微鏡購于Nikon（Japan）;轉(zhuǎn)輪式石蠟切片機購于泰維科技;高速離心機、移液器購于Eppendorf;電子天平購于梅特勒多利多;高壓滅菌鍋購于上海博訊;全自動血生化分析儀購于山東博科。

1.2實驗動物" 4周齡雄性昆明實驗小鼠80只，體重（25±2）g，購自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司[許可證號：SCXK（京）2019-0010]。本動物實驗方案經(jīng)過河北工程大學附屬醫(yī)院實驗動物福利倫理委員會同意，符合動物保護、動物福利和倫理原則（編號：IACUC-Hebeu-2023-0009）。

1.3實驗方法

1.3.1氫濃度測定" 取出溶解氫濃度測定試劑盒中的量杯，加自來水至刻度線。第1滴溶解氫濃度測定試劑，搖晃量杯，結(jié)果自來水呈藍色。打開1罐富氫水，加富氫水至量杯刻度線，第1滴溶解氫濃度測定試劑，搖晃量杯，富氫水無色透明。繼續(xù)滴加溶解氫濃度測定試劑并搖晃量杯，一直到第5滴，量杯里的富氫水出現(xiàn)淺藍色。證明量杯里富氫水中的氫已耗盡。根據(jù)說明書，富氫水的濃度在0.4～0.5 ppm之間。為確保富氫水中氫的濃度一致，每次實驗新拆封富氫水1罐。使用注射用橄欖油將CCl4配制成0.3%的CCl4溶液。

1.3.2急性肝損傷模型的制備預實驗" 將20只4周齡的雄性昆明實驗小鼠，隨機分成預實驗空白組和預實驗模型組，每組10只，適應性飼養(yǎng)1周。預實驗空白組實驗小鼠腹腔注射橄欖油10 ml/kg，預實驗模型組實驗小鼠腹腔注射0.3%的CCl4溶液（10 ml/kg），16 h后取材，觀察肝臟組織外觀變化，隨后將肝組織固定于多聚甲醛固定液中，做HE染色并進行病理評分。根據(jù)HE染色結(jié)果，從肝臟變性、炎性細胞浸潤、壞死和出血4個方面進行病理評分，采用四級定級系統(tǒng)評分標準[8]，見表1。

1.3.3實驗分組" 60只4周齡雄性KM小鼠，隨機分為空白組、模型組、聯(lián)苯雙酯組、富氫水低劑量組、富氫水中劑量組、富氫水高劑量組，共6組，每組10只。聯(lián)苯雙酯組連續(xù)灌胃聯(lián)苯雙酯150 mg/（kg·d），共7 d;富氫水低中高劑量組分別連續(xù)灌胃不同劑量富氫水5、10、20 ml/（kg·d），共7 d。第7天灌胃1 h后，空白組腹腔注射橄欖油（10 ml/kg），其余各組腹腔注射0.3%的CCl4（10 ml/kg），16 h后取材。取材后收集血液，離心后將血清置于-20 ℃保存，檢測各組實驗小鼠的血生化指標，包括谷草轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（AST）、總膽紅素（TBIL-F）、直接膽紅素（DBIL-F）。肝臟稱重后與多聚甲醛固定液中固定，做HE染色并進行病理評分。柱狀圖采用Graph Prism8.0軟件繪制，以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.4轉(zhuǎn)錄組測序" 為了分析富氫水處理對肝臟組織基因表達變化的影響，取肝臟組織進行高通量測序。分別收集空白組、模型組和富氫水處理組小鼠的肝臟組織（n=5）進行RNA-seq。使用DESeq2[9]進行組間的基因表達差異分析，計算基因LFC，并設(shè)定|LFC|gt;1，padjlt;0.05閾值作為差異基因篩選標準。使用pheatmap進行基因表達熱圖的繪制。使用clusterProfiler[10]進行基因功能富集分析（基于GO和KEGG數(shù)據(jù)庫）。其中GO數(shù)據(jù)庫分為生物過程（biological process， BP）、細胞組成（cellular component， CC）和分子功能（molecular function， MF）3個部分。通過設(shè)定padjlt;0.05作為顯著功能的篩選標準。

2結(jié)果

2.1小鼠急性肝損傷模型觀察" 兩組實驗小鼠肝臟的形態(tài)如圖1所示，預實驗空白組實驗小鼠肝臟色澤暗紅，外表光滑;預實驗模型組肝臟色澤變淺，外表有明顯不規(guī)則紋路。HE染色結(jié)果如圖2所示，預實驗空白組肝臟組織被膜由厚薄均勻的富含彈性纖維致密結(jié)締組織構(gòu)成，肝小葉分界明顯，排列規(guī)則，肝小葉中央為中央靜脈，周圍是大致呈放射狀排列的肝細胞和肝血竇，肝細胞圓潤、飽滿;肝板排列規(guī)則、整齊，肝竇無明顯擴張或擠壓;相鄰肝小葉之間的門管區(qū)無明顯異常。預實驗模型組肝臟組織可見大量肝細胞水樣變性，胞質(zhì)疏松淡染（箭頭A），可見少量壞死灶，少量肝細胞壞死，核固縮（箭頭B），伴少量淋巴細胞浸潤（箭頭C）。病理評分結(jié)果為預實驗空白組平均得分0.3分，預實驗模型組平均得分6.3分。

2.2實驗結(jié)果

2.2.1各組實驗小鼠肝臟的形態(tài)學觀察" 各組實驗小鼠肝臟的形態(tài)如圖3所示，空白組實驗小鼠肝臟色澤暗紅，外表光滑;模型組肝臟色澤淡紅，外表有明顯不規(guī)則紋路，腫脹明顯;聯(lián)苯雙酯組肝臟外觀與空白組相似;富氫水低劑量組肝臟外觀與模型組接近，腫脹不明顯;富氫水中劑量組肝臟顏色變深，表面紋路變淺，腫脹不明顯;富氫水高劑量組肝臟外觀與空白組接近。

2.2.2各組實驗小鼠的肝指數(shù)變化" 取材前對實驗小鼠稱量體重，并稱量肝臟的質(zhì)量，計算每只實驗小鼠肝臟與體重的比值。發(fā)現(xiàn)CCl4致急性肝損傷模型組的肝指數(shù)（5.40±0.67）%高于空白組（4.08±0.13）%，聯(lián)苯雙酯組和富氫水組均可使肝指數(shù)降低，如圖4所示。

2.2.3 HE染色結(jié)果及病理評分" HE染色結(jié)果顯示，與空白組相比，急性肝損傷模型組中可見較大量的肝細胞變性，細胞腫脹，胞質(zhì)疏松，大量中央靜脈周圍可見肝細胞壞死，核溶解，伴有中度出血，及散在的淋巴細胞浸潤。與急性肝損傷模型組相比，聯(lián)苯雙酯組得到較大改善，僅出現(xiàn)少量中央靜脈周圍肝細胞脂肪變性，富氫水低劑量組和中劑量組有一定的改善效果，富氫水高劑量組得到顯著的改善，見圖5。

如圖6所示，CCl4致急性肝損傷模型組以肝臟壞死、變性和出血為主要特征，炎性細胞浸潤并不明顯。病理總分顯示，模型組評分最高8.7分，即肝臟出現(xiàn)嚴重的病變;聯(lián)苯雙酯組為1.7分，富氫水高劑量組為1.3分，評分顯著降低，富氫水低劑量組為4.3分，富氫水中劑量組為4.3分。

2.2.4血生化分析" 各組實驗小鼠的血生化指標檢測結(jié)果如圖7所示。急性肝損傷模型組小鼠血液中ALT、AST、TBIL-F和DBIL-F水平顯著升高，聯(lián)苯雙酯和低、中、高劑量的富氫水均可顯著降低ALT水平，聯(lián)苯雙酯和高劑量的富氫水可有效降低AST和TBIL-F的水平，聯(lián)苯雙平酯組和富氫水中劑量組、高劑量組可有效降低DBIL-F水平。

2.3轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果" 三組肝臟組織樣本的基因表達差異分析結(jié)果如圖8所示，模型組和空白組之間的基因表達差異分析結(jié)果顯示，相比于空白組，模型組中有187個基因上調(diào)，179個基因下調(diào)，共計366個差異基因。肝臟組織中這些基因的表達變化與病理密切相關(guān)。相比于模型組，在富氫水處理后有100個基因上調(diào)，194個基因下調(diào)，共計294個差異基因。肝臟組織中這些基因的表達在富氫水的影響下發(fā)生了顯著的變化，表明其與富氫水的功能密切相關(guān)。

為了評估這些基因在三組樣本之間的變化，將兩部分差異基因合并，獲得了635個無重復的差異基因，并通過繪制熱圖分析其變化，結(jié)果如圖9所示，除富氫水處理組的一個樣本外，其它所有樣本均與同組樣本聚為一類。整體來看相比于模型組，富氫水處理組樣本與空白對照組樣本更為相似，表明富氫水處理后，肝臟組織中的基因表達特征向空白對照組靠近。

基于GO和KEGG數(shù)據(jù)庫對這些差異基因涉及的功能進行富集分析。首先針對富氫水處理組相對于模型組的差異基因進行了功能富集分析，基于GO功能富集分析的結(jié)果如圖10所示，其中上調(diào)基因總計富集到了17條GO功能，主要涉及晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)、甘油三酯生物合成和中性脂質(zhì)生物合成等生物過程，具有ATP酶活性、磷酸酶活性和跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性。下調(diào)基因總計富集到了358條GO功能，主要涉及病毒防御、干擾素β反應和脂多糖反應等生物過程，對應活性分子主要定位于炎癥小體，具有GTP酶活性和細胞因子受體活性。

基于KEGG通路富集分析的結(jié)果如圖11所示，總計富集到了37條KEGG通路。這些差異基因主要涉及細胞因子-受體相互作用、破骨細胞分化、TNF信號通路、甲型流感等通路。表明富氫水可能通過影響機體的這些功能和通路發(fā)揮作用。

3討論

急性肝損傷是最常見的臨床肝病之一，如果不及時治療，很容易發(fā)展為急性肝衰竭、慢性肝損傷或肝細胞癌，嚴重威脅人類的生活質(zhì)量和健康。急性肝損傷的機制和特征非常復雜，包括肝細胞死亡、氧化應激、炎癥等[11]。在肝臟炎癥發(fā)展為肝硬化、肝纖維化和肝細胞癌的過程中，肝細胞焦亡對肝損傷起到重要的作用[12-15]。目前治療急性肝損傷的主要方式是抗氧化、消炎和降酶藥物等，大量藥物代謝本身就加重了肝臟的負擔，延長治療時間。富氫水抗炎抗氧化作用及對肝臟無代謝負擔特點，成為治療肝損傷的理想產(chǎn)品。

有研究發(fā)現(xiàn)[16]，富氫水可以通過IL-10和Sirt-1信號增強HO-1預防非酒精性脂肪性肝炎的肝損傷。本研究中觀察肝臟組織的外觀形態(tài)發(fā)現(xiàn)，急性肝損傷組小鼠肝臟組織顏色變淺，出現(xiàn)不規(guī)則紋路。富氫水低中高劑量組小鼠肝臟組織顏色逐漸恢復正常，紋路減弱，說明富氫水可改善CCl4誘導的急性肝損傷，且呈劑量依賴型。模型組中肝指數(shù)顯著升高，富氫水各組肝指數(shù)均降低，說明富氫水可改善急性肝損傷造成的肝臟組織腫大。各組實驗小鼠肝組織HE染色和病理評分結(jié)果可知，CCl4誘導實驗小鼠產(chǎn)生嚴重肝損傷，富氫水低、中、高劑量可不同程度減輕實驗小鼠的肝損傷，特別是富氫水高劑量組，明顯改善了肝損傷程度。ALT、AST、TBIL-F和DBIL-F是肝臟功能性重要的血生化檢測指標[17]，富氫水同陽性藥聯(lián)苯雙酯效果相近，可顯著降低其含量，即有效減輕肝功能損傷。表明富氫水對小鼠急性肝損傷中有一定的保護作用。

近年來疾病在基因水平也得到廣泛關(guān)注，有研究指出激活Nrf2/ARE信號通路可增強抗氧化防御系統(tǒng)，從而緩解肝毒性和肝細胞凋亡[18]。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示，富氫水組調(diào)節(jié)了急性肝損傷小鼠的一些基因表達，基于GO數(shù)據(jù)庫的功能富集分析，上調(diào)基因涉及晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)、甘油三酯生物合成和中性脂質(zhì)生物合成等生物過程，具有ATP酶活性、磷酸酶活性和跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性。下調(diào)基因涉及病毒防御、干擾素β反應和脂多糖反應等生物過程，對應活性分子主要定位于炎癥小體，具有GTP酶活性和細胞因子受體活性?；贙EGG通路富集分析，這些差異基因主要涉及細胞因子-受體相互作用、破骨細胞分化、TNF信號通路、甲型流感等通路。表明富氫水可能通過影響機體的這些功能和通路發(fā)揮保肝作用。

Si Y等[19]研究發(fā)現(xiàn)，富氫水具有抗氧化、抗炎和抗纖維化作用，能通過抑制PI3K/AKT、NF-κB和TGF-β通路，減輕草酸誘導的腎損傷。急性四氯化碳后小鼠肝臟的組織修復取決于損傷誘導的Wnt/β-catenin信號傳導[20]。至于富氫水對于急性肝損傷的保護具體機制，可能是通過抗氧化等信號通路等起到調(diào)節(jié)肝功生化指標作用，有待進一步研究。

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收稿日期：2023-09-21;修回日期：2023-10-10

編輯/肖婷婷

作者簡介：睢建亮（1990.9-），男，河北邯鄲人，碩士研究生，主要從事藥理學研究

通訊作者：石玉祥（1972.10-），男，山東聊城人，博士，教授，主要從事畜禽營養(yǎng)免疫調(diào)控研究