路南腐乳中優(yōu)勢(shì)菌株的篩選及其前發(fā)酵工藝優(yōu)化

摘要：以云南路南腐乳為研究對(duì)象，對(duì)毛坯樣品中的優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行分離純化，采用優(yōu)勢(shì)菌株對(duì)腐乳進(jìn)行單菌和雙菌混合發(fā)酵，以蛋白酶活力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行前發(fā)酵工藝優(yōu)化，旨在提升路南腐乳的品質(zhì)。研究結(jié)果：采用獲得的5株優(yōu)勢(shì)菌株對(duì)腐乳進(jìn)行單菌、雙菌混合接種發(fā)酵，得到單菌株R1與R2分別接種發(fā)酵時(shí)第3天的蛋白酶活力較高，分別為160.5 U/g和156.05 U/g。后續(xù)選擇R1與R2菌株進(jìn)行混菌發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)當(dāng)R1∶R2為2∶1時(shí)，第3天時(shí)蛋白酶活力最高，為197.17 U/g。R1菌株與R2菌株經(jīng)形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)分別鑒定為白地霉和巢狀毛霉。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析對(duì)菌液濃度、接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，以蛋白酶活力為指標(biāo)，得到最佳發(fā)酵條件為菌液濃度106 CFU/mL、接種量2%、發(fā)酵溫度28.3 ℃、發(fā)酵時(shí)間3 d，此時(shí)蛋白酶活力達(dá)到215.5 U/g。該研究可為路南腐乳品質(zhì)的提升提供一定理論指導(dǎo)和數(shù)據(jù)參考。

關(guān)鍵詞：腐乳；混菌發(fā)酵；前發(fā)酵；工藝優(yōu)化

中圖分類號(hào)：TS214.2 """""文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A """"文章編號(hào)：1000-9973（2024）12-0030-06

Screening of Dominant Strains in Lunan Sufu and Optimization of Pre-Fermentation Technology

CHEN Chen， REN Yan-lin， CHEN Zhong-ai， PI Yu-ran， TIAN Juan， HU Yong-jin*

（College of Food Science and Technology， Yunnan Agricultural University， Kunming 650201， China）

Abstract： Taking Yunnan Lunan sufu as the research object， the dominant strains in the blank samples are isolated and purified， and the dominant strains are used for single strain and double strains mixed fermentation of sufu， and the protease activity is used as the evaluation index for the optimization of pre-fermentation process， aiming to improve the quality of Lunan sufu. Research results： the five dominant strains obtained are used for fermentation of sufu inoculated with single strain and double strains， it is determined that the protease activity on the 3rd day of fermentation is 160.5 U/g and 156.05 U/g for inoculation with single strain R1 and R2 respectively，" and then R1 and R2 strains are selected for mixed fermentation， it is found that when R1∶R2 is 2∶1， the protease activity is the highest of 197.17 U/g on the 3rd day of fermentation. R1 and R2 strains are identified as Geotrichum candidum and Mucor nidus respectively by morphology and molecular biology. On the basis of single factor test， response surface analysis is used to optimize the concentration of bacterial solution， inoculation amount， fermentation temperature and fermentation time.Taking protease activity as the index， it is determined that the optimal fermentation conditions are bacterial solution concentration of 106 CFU/mL， inoculation amount of 2%， fermentation temperature of 28.3 ℃， and fermentation time of 3 d. At this time， the protease activity reaches 215.5 U/g. This study can provide some theoretical guidance and data references for the improvement of the quality of Lunan sufu.

Key words： sufu; mixed bacteria fermentation; pre-fermentation; process optimization

收稿日期：2024-05-16

基金項(xiàng)目：科技人才與平臺(tái)計(jì)劃（202105AF150049）；云南省高校食品微生物資源與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（云教發(fā)［2018］135號(hào)）

作者簡(jiǎn)介：陳晨（2000—），女，碩士研究生，研究方向：食品微生物學(xué)。

*通信作者：胡永金（1971—），男，教授，博士，研究方向：食品微生物學(xué)。

腐乳是以大豆為原料制成豆腐后接種微生物發(fā)酵制得的，其主要營(yíng)養(yǎng)成分類似于大豆［1］。在歐美，許多人將其稱作“中國(guó)干酪”［2］。大豆制成腐乳后，不僅保留了大豆中的天然營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而且大量降低了大豆中的胰蛋白酶抑制物［3］，成熟的腐乳還消除了大豆本身的豆腥味以及大豆中的抗?fàn)I養(yǎng)因子（如腹瀉因子、脹氣因子等），使得大豆中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)更易被人體吸收［4］。腐乳的發(fā)酵過(guò)程涉及微生物群落的演替過(guò)程［5］，其生產(chǎn)過(guò)程主要包括前期發(fā)酵和后期發(fā)酵兩個(gè)階段［6］。腐乳的前期發(fā)酵是整個(gè)生產(chǎn)的關(guān)鍵步驟，菌株在豆腐坯體上生長(zhǎng)，形成茂密的菌絲后包裹坯體，使得蛋白質(zhì)部分降解［7］，且前期發(fā)酵分泌的酶系直接影響腐乳后期發(fā)酵產(chǎn)香物質(zhì)的降解與酯化［8］，所以腐乳的前酵工藝將直接影響腐乳的品質(zhì)［9］。

路南腐乳作為云南本地特色產(chǎn)品，是自然發(fā)酵而成的，開(kāi)放式的生產(chǎn)環(huán)境和不可控的發(fā)酵方式會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品安全問(wèn)題［10］。腐乳的營(yíng)養(yǎng)和風(fēng)味受多種因素的影響，如原料類型、生產(chǎn)工藝和發(fā)酵菌株等［11］。20世紀(jì)八九十年代以來(lái)，我國(guó)便已廣泛使用人工接菌的方式發(fā)酵腐乳［12］。在自然界中，微生物與微生物、環(huán)境之間密切相聯(lián)，混合發(fā)酵更符合自然規(guī)律［13］?；旌习l(fā)酵能提高發(fā)酵效率［14］和縮短發(fā)酵周期［15］。與傳統(tǒng)發(fā)酵相比，基于微生物調(diào)控的現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)可以精確控制腐乳的發(fā)酵過(guò)程，該結(jié)果對(duì)提高產(chǎn)品質(zhì)量和安全性至關(guān)重要［16］。基于以上原因，本課題擬從云南路南當(dāng)?shù)貍鹘y(tǒng)自然發(fā)酵的腐乳中篩選出高產(chǎn)蛋白酶活性的優(yōu)良菌株，將篩選出的菌株進(jìn)行復(fù)配接種發(fā)酵，提升路南腐乳的品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

路南腐乳：云南省昆明市石林彝族自治縣某農(nóng)家傳統(tǒng)自然發(fā)酵腐乳；福林酚試劑：北京索萊寶科技有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、無(wú)水碳酸鈉、硼酸、硫酸鉀：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；三氯乙酸：廣東光華科技股份有限公司；酪氨酸、干酪素：上海源葉生物科技有限公司；37%甲醛溶液：成都金山化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 翱藝儀器（上海）有限公司；PHS-3C臺(tái)式pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；101-2電熱鼓風(fēng)干燥箱 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；HH-B11-BS-Ⅱ電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；GL-6250A磁力攪拌器 海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司；TF-B60超低溫冰箱 廣州瑞合化工科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 路南腐乳發(fā)酵菌株的篩選純化及鑒定

1.3.1.1 采樣與菌株分離純化

稱取1 g自然發(fā)酵而成的不同時(shí)間階段（3，5，7 d）的腐乳毛坯樣品于10 mL無(wú)菌生理鹽水中搖蕩，調(diào)節(jié)菌液濃度為102～108 CFU/mL。吸取0.5 mL不同濃度梯度的稀釋液于凝固的孟加拉紅平板內(nèi)，并使用涂布棒進(jìn)行涂布，使其在平板內(nèi)混合均勻?；靹蚝蟮怪闷桨澹ú煌♂尪茸?個(gè)平行），于28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2～3 d。挑選生長(zhǎng)良好的單菌落，采用平板劃線法在孟加拉紅培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，然后于28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2～3 d。菌株純化3代后，轉(zhuǎn)接到試管斜面上培養(yǎng)2 d。

1.3.1.2 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

在菌株生長(zhǎng)過(guò)程中，觀察菌株的生長(zhǎng)形態(tài)，初步確定菌株的屬。為觀察菌絲形態(tài)，使用接種環(huán)挑取少量菌絲體，使用乳酸酚棉藍(lán)染色液進(jìn)行染色處理后，在電子顯微鏡下觀察其菌絲形態(tài)并拍照記錄。

1.3.1.3 菌株的分子生物學(xué)鑒定

選取能夠挑選單菌落并無(wú)雜菌生長(zhǎng)的平板送至北京擎科生物科技股份有限公司進(jìn)行DNA提取，R1菌株和R2菌株分別以IT（TCCGTAGGTGAACCTGCGG）和ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，進(jìn)行18S rDNA基因測(cè)序。

將菌株的基因測(cè)序結(jié)果與NCBI網(wǎng)站中的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)經(jīng)BLAST程序進(jìn)行基因?qū)Ρ确治?，確定菌株的種屬后，選取同源性高的10株菌株，利用同源性高的10株菌株的基因序列進(jìn)行同源性分析，通過(guò)MEGA-X構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.2 優(yōu)勢(shì)發(fā)酵菌株的篩選

1.3.2.1 菌懸液的制備

使用接種環(huán)挑取培養(yǎng)良好且無(wú)污染的菌株于無(wú)菌生理鹽水中，制備成一定濃度的菌懸液。

1.3.2.2 毛坯的制備

將豆腐切成2 cm×2 cm×2 cm的小方塊，將制備好的一定濃度的菌懸液均勻地噴灑在豆腐坯體的表面，于28 ℃培養(yǎng)5 d，每天觀察豆腐表面菌絲的生長(zhǎng)情況并測(cè)定不同菌株發(fā)酵毛坯的蛋白酶活力。

1.3.2.3 蛋白酶活力的測(cè)定

蛋白酶活力參照GB/T 23527—2009進(jìn)行測(cè)定［17］。

1.3.2.4 前發(fā)酵階段發(fā)酵條件優(yōu)化的單因素試驗(yàn)

以蛋白酶活力為指標(biāo)，以菌液濃度（104，105，106，107，108 CFU/mL）、接種量（1%、2%、3%、4%、5%）、發(fā)酵溫度（24，26，28，30，32 ℃）、發(fā)酵時(shí)間（1，2，3，4，5 d）為單因素，研究不同發(fā)酵條件下混合菌株發(fā)酵腐乳的前發(fā)酵情況。

1.3.2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化腐乳前發(fā)酵條件

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以蛋白酶活力為指標(biāo)，合理選取對(duì)腐乳前發(fā)酵階段腐乳毛坯的蛋白酶活力影響較顯著的幾個(gè)因素，并選取合理的水平，采用響應(yīng)面分析法對(duì)毛霉腐乳前發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，研究混菌發(fā)酵腐乳前酵階段的最優(yōu)發(fā)酵條件。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Design-Expert 11進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用Origin 9.0、Excel 2020、MEGA-X進(jìn)行制表繪圖，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與鑒定

從采集的3種不同發(fā)酵階段的路南腐乳毛坯樣品中共篩選出5株優(yōu)勢(shì)菌株，其中包括3株霉菌和2株酵母菌。

2.2 單菌發(fā)酵腐乳蛋白酶活力的測(cè)定

將分離得到的5株菌株進(jìn)行單菌發(fā)酵制成腐乳毛坯，測(cè)定一定發(fā)酵時(shí)間內(nèi)的蛋白酶活力，見(jiàn)圖2。

蛋白酶可將豆腐中的大豆蛋白等分解成肽和氨基酸等小分子物質(zhì)，并促進(jìn)生成氨基酸態(tài)氮和水溶性蛋白質(zhì)等［18］，其酶活越高表示蛋白酶水解大豆蛋白的速率越快［19］。通過(guò)對(duì)5株菌株進(jìn)行單菌發(fā)酵，所得毛坯的蛋白酶活力均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，5株菌株的蛋白酶活力均在第3天時(shí)達(dá)到最大值。其中R1和R2菌株的蛋白酶活力較高，在第3天時(shí)分別達(dá)到160.5 U/g和156.05 U/g，另外兩株酵母菌（R3、R4）的酶活力分別為141.06 U/g和146.06 U/g。霉菌的蛋白酶活力高于酵母菌的蛋白酶活力，故選取R1和R2菌株為主要發(fā)酵菌株進(jìn)行后續(xù)的混菌發(fā)酵。

2.3 混菌發(fā)酵腐乳蛋白酶活力的測(cè)定

將R1和R2菌株設(shè)置成10種不同的比例進(jìn)行混菌發(fā)酵，另外包括R1、R2單菌發(fā)酵組和空白對(duì)照組，測(cè)定其不同發(fā)酵階段的蛋白酶活力，見(jiàn)圖3。

與單菌發(fā)酵腐乳相比，混菌發(fā)酵腐乳可以明顯提高腐乳前酵階段毛坯的蛋白酶活力，這是因?yàn)榛旌习l(fā)酵的菌株酶系更全面，彌補(bǔ)了單菌發(fā)酵腐乳中蛋白酶系較單一的不足。當(dāng)R1與R2的比例為2∶1時(shí)，在第3天時(shí)蛋白酶活力達(dá)到最高，為197.17 U/g，當(dāng)R1與R2的比例為3∶1、3∶2、2∶1、1∶2、2∶3時(shí)，蛋白酶活力均高于單菌發(fā)酵，但當(dāng)R1與R2的比例為1∶1、1∶3時(shí)，其蛋白酶活力不及單菌發(fā)酵時(shí)的蛋白酶活力，這可能是由于菌株之間存在爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)的關(guān)系，而不同菌株的競(jìng)爭(zhēng)能力不同，毛霉生長(zhǎng)旺盛，抑制了白地霉的生長(zhǎng)［20］，導(dǎo)致酶活力不升反降。因此，選取R1與R2的比例為2∶1進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵條件試驗(yàn)。

2.4 菌株基因序列測(cè)定

以菌株的基因序列為模板，R1和R2菌株分別以ITS1和ITS4為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳分離，18S rDNA PCR電泳結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可以看出菌株有較清晰明亮的特異性條帶，由此可進(jìn)行基因序列測(cè)定。

2.5 菌株發(fā)育樹(shù)的建立

根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)合同源性比對(duì)，確立菌株R1為Geotrichum candidum，菌株R2為Mucor nidicola。根據(jù)同源性比對(duì)結(jié)果，采用MAGE-X對(duì)菌株建立相對(duì)應(yīng)的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，R1和R2 菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分別見(jiàn)圖5和圖6。

2.6 腐乳前酵階段單因素試驗(yàn)

2.6.1 菌液濃度對(duì)前酵階段蛋白酶活力的影響

由圖7可知，當(dāng)菌液濃度為104 CFU/mL時(shí)，腐乳的蛋白酶活力偏低，隨著菌液濃度的升高，蛋白酶活力也相應(yīng)上升，當(dāng)菌液濃度為106 CFU/mL時(shí)蛋白酶活力最高，達(dá)到203.83 U/g；當(dāng)菌液濃度持續(xù)上升時(shí)，蛋白酶活力開(kāi)始下降，原因可能是菌液濃度較低時(shí)，分泌酶系的微生物數(shù)量較少，所以測(cè)得的蛋白酶活力偏低，當(dāng)達(dá)到較高酶解率時(shí)，盡管菌液濃度有所增加，但能夠在豆腐坯上正常生長(zhǎng)繁殖的生物數(shù)量基本達(dá)到飽和，單位時(shí)間內(nèi)酶活力不再明顯提升，而接種量過(guò)多可能會(huì)影響菌株之間的營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，從而影響蛋白酶的分泌量，因此，確定最佳菌液濃度為106 CFU/mL。

2.6.2 接種量對(duì)前酵階段蛋白酶活力的影響

由圖8可知，當(dāng)接種量為1%～2%時(shí)，蛋白酶活力呈逐漸上升的趨勢(shì)，當(dāng)接種量為2%時(shí)，蛋白酶活力達(dá)到最大值，為207.72 U/g。當(dāng)接種量持續(xù)增加時(shí)，蛋白酶活力開(kāi)始呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，原因可能是微生物菌群只有處于一定量級(jí)水平才具有較旺盛的生長(zhǎng)代謝能力，如果超過(guò)菌群最佳生長(zhǎng)時(shí)期的數(shù)量水平，菌株之間會(huì)爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)，出現(xiàn)拮抗作用，致使蛋白酶活力呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。特別是在菌株較復(fù)雜時(shí)，不同菌株之間競(jìng)爭(zhēng)能力不同，多種菌群共同爭(zhēng)奪營(yíng)養(yǎng)，導(dǎo)致酶活力下降幅度明顯。因此，確定最佳接種量為2%。

2.6.3 發(fā)酵溫度對(duì)前酵階段蛋白酶活力的影響

由圖9可知，溫度過(guò)低或過(guò)高都將影響微生物的生長(zhǎng)代謝，從而使微生物分泌的酶也相應(yīng)減少。當(dāng)溫度為24 ℃時(shí)，菌株生長(zhǎng)較緩慢，不能正常分泌酶系，因此蛋白酶活力處于較低水平。隨著溫度的升高，蛋白酶活力開(kāi)始逐漸上升。當(dāng)溫度為26～30 ℃時(shí)，蛋白酶活力較高，只有溫度接近最適溫度時(shí)，菌株才能迅速生長(zhǎng)，從而大量產(chǎn)酶。當(dāng)溫度升至28 ℃時(shí)，蛋白酶活力達(dá)到最高，為211.05 U/g。當(dāng)超過(guò)最適溫度時(shí)，一定數(shù)量的菌株死亡，使得部分酶失活，隨著溫度繼續(xù)升高，死亡和變性失活越發(fā)明顯，另外，溫度太高會(huì)導(dǎo)致水分快速損失，加速菌絲的衰老，從而對(duì)蛋白酶活力產(chǎn)生影響［21］，導(dǎo)致發(fā)酵減緩甚至停止發(fā)酵。因此，確定最佳發(fā)酵溫度為28 ℃。

2.6.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)前酵階段蛋白酶活力的影響

由圖10可知，在5 d時(shí)間內(nèi)，蛋白酶活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在第3天時(shí)酶活力達(dá)到最高，為212.72 U/g。在前3 d蛋白酶活力呈現(xiàn)快速上升趨勢(shì)，這可能是由于腐乳毛坯上的霉菌在發(fā)酵初期至60 h期間處于旺盛期，霉菌和其菌絲不斷地進(jìn)行代謝繁殖，從而影響蛋白酶活力的持續(xù)增長(zhǎng)［22］，而4～5 d內(nèi)酶活力趨于平緩下降的趨勢(shì)。隨著發(fā)酵時(shí)間的增加，菌群容易出現(xiàn)老化衰退、難以合成蛋白酶以及代謝副產(chǎn)物增加的現(xiàn)象，酶分泌減慢［22］，導(dǎo)致蛋白酶活力出現(xiàn)下降趨勢(shì)，原因可能是不同微生物屬間協(xié)同生長(zhǎng)需要適應(yīng)過(guò)程，達(dá)到一定適應(yīng)階段才能發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)。因此，1～2 d為適應(yīng)階段，2～3 d為協(xié)同階段，超過(guò)3 d為老化階段。因此，確定最佳發(fā)酵時(shí)間為3 d。

2.7 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化發(fā)酵條件

根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，以蛋白酶活力為指標(biāo)，以菌液濃度、接種量和發(fā)酵溫度為因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平見(jiàn)表1。

根據(jù)表1的因素水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表2。

采用Design-Expert 11分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行多元二次回歸擬合，建立回歸方程：Y=202.06－0.735X1－7.22X2+16.63X3－2.03X1X2－0.777 5X1X3+1.81X2X3－1.75X12－5.28X22－50.59X32。

回歸方程及偏回歸系數(shù)方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，此模型極顯著（Plt;0.01）。模型失擬項(xiàng)的P值為0.056 9（Pgt;0.05），差異不顯著，即該方程對(duì)試驗(yàn)的擬合性較好，因此該模型的選擇和建立具備合理性。

由回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果可知，一次項(xiàng)X3對(duì)蛋白酶活力的影響極顯著（Plt;0.01），X2對(duì)蛋白酶活力的影響顯著（Plt;0.05），X1對(duì)蛋白酶活力的影響不顯著（Pgt;0.05）；二次項(xiàng)X32對(duì)蛋白酶活力的影響極顯著（Plt;0.01）；交互項(xiàng)X1X2、X1X3、X2X3對(duì)蛋白酶活力的影響均不顯著（Pgt;0.05）。根據(jù)F值分析影響腐乳前發(fā)酵階段蛋白酶活力的因素主次順序?yàn)榘l(fā)酵溫度＞接種量＞菌液濃度。

根據(jù)試驗(yàn)得到的響應(yīng)曲面圖見(jiàn)圖11，其直接反映了各因素對(duì)腐乳前發(fā)酵階段蛋白酶活力的影響。響應(yīng)面曲面變化越快，表明交互作用越明顯。

整體來(lái)看，菌液濃度和接種量對(duì)蛋白酶活力的影響不及發(fā)酵溫度的影響。由圖11中a可知，當(dāng)發(fā)酵溫度保持一定時(shí)，接種量的持續(xù)增加抑制了腐乳前發(fā)酵階段的蛋白酶活力；菌液濃度的升高對(duì)蛋白酶活力的影響也從促進(jìn)轉(zhuǎn)變?yōu)橐种?，但菌液濃度?duì)酶活力的影響不太明顯。由圖11中b可知，當(dāng)接種量保持一定時(shí)，菌液濃度和發(fā)酵溫度對(duì)蛋白酶活力的影響呈拋物線形狀，當(dāng)菌液濃度保持一定時(shí)，蛋白酶活力隨著發(fā)酵溫度的升高在28 ℃左右達(dá)到最大值。蛋白酶活力變化顯示，發(fā)酵溫度對(duì)酶活力的影響大于菌液濃度的影響。由圖11中c可知，當(dāng)菌液濃度保持一定時(shí)，發(fā)酵溫度對(duì)前發(fā)酵階段蛋白酶活力的影響也是先促進(jìn)后抑制，接種量的遞增對(duì)前發(fā)酵階段蛋白酶活力的影響也與菌液濃度類似。綜合以上結(jié)果可以分析得到3個(gè)因素對(duì)腐乳前發(fā)酵階段蛋白酶活力的影響程度為發(fā)酵溫度＞接種量＞菌液濃度。

綜上所述，經(jīng)過(guò)分析得到混合發(fā)酵腐乳的較優(yōu)發(fā)酵條件為發(fā)酵溫度28.3 ℃、接種量2.31%、菌液濃度2.53×10 6 CFU/mL，此時(shí)蛋白酶活力為214.74 U/g。為檢驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果與真實(shí)情況的一致性，對(duì)上述條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，并將較優(yōu)結(jié)果修正為發(fā)酵溫度28.3 ℃、接種量2%、菌液濃度10 6 CFU/mL，此時(shí)蛋白酶活力為215.5 U/g。

3 結(jié)論

對(duì)云南路南腐乳的生產(chǎn)菌株進(jìn)行篩選后共得到5株菌株，通過(guò)單菌發(fā)酵腐乳并在第2，3，4天分別測(cè)定其蛋白酶活力，可初步確定R1與R2為其優(yōu)勢(shì)發(fā)酵菌株且兩株菌株均屬于霉菌。其單菌發(fā)酵蛋白酶活力在發(fā)酵第3天時(shí)達(dá)到最高，分別為160.5，156.05 U/g。當(dāng)R1∶R2為2∶1時(shí)，在第3天時(shí)蛋白酶活力最高，為197.17 U/g，表明雙菌混合發(fā)酵的蛋白酶活力遠(yuǎn)高于單菌發(fā)酵的蛋白酶活力，故雙菌混合發(fā)酵相比單菌發(fā)酵有較大優(yōu)勢(shì)。對(duì)路南腐乳前酵階段的發(fā)酵條件設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行工藝優(yōu)化，以蛋白酶活力為指標(biāo)，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果分析得到最優(yōu)發(fā)酵條件為菌液濃度106 CFU/mL、接種量2%、發(fā)酵溫度28.3 ℃、發(fā)酵時(shí)間3 d，此時(shí)蛋白酶活力達(dá)到215.5 U/g。

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