黃花菜莖葉與青貯玉米混合比例對(duì)青貯質(zhì)量和微生物多樣性的影響

摘要：為探索黃花菜（Hemerocallis citrina Baroni）莖葉飼料資源化利用的新途徑，本試驗(yàn)將黃花菜莖葉與青貯玉米按質(zhì)量比100∶0（T1），80∶20（T2），60∶40（T3），40∶60（T4），20∶80（T5），0∶100（T6）進(jìn)行混合青貯，發(fā)酵70 d后，對(duì)各樣品進(jìn)行感官鑒定、品質(zhì)評(píng)價(jià)和微生物多樣性分析。結(jié)果表明：與黃花菜莖葉單貯相比，黃花菜莖葉與青貯玉米混合青貯有利于改善青貯飼料的氣味和結(jié)構(gòu)，并且基于對(duì)16個(gè)青貯指標(biāo)的灰色關(guān)聯(lián)度分析發(fā)現(xiàn)，黃花菜莖葉與青貯玉米混合青貯品質(zhì)優(yōu)于黃花菜莖葉單貯。在細(xì)菌屬水平上，共有1192個(gè)類(lèi)群被分類(lèi)，其中，植物乳桿菌屬（Lactiplantibacillus）、泛菌屬（Pantoea）、未分類(lèi)的腸桿菌屬（unclassified_Enterobacteriacea）是所有混合青貯模式中的優(yōu)勢(shì)屬，結(jié)合冗余分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氨態(tài)氮含量對(duì)各樣品微生物群落組成影響更顯著。綜上考慮，從黃花菜莖葉利用最大化角度出發(fā)，以黃花菜莖葉與青貯玉米按質(zhì)量比40∶60進(jìn)行混合青貯為佳。

關(guān)鍵詞：黃花菜莖葉；青貯玉米；混合青貯；青貯質(zhì)量評(píng)價(jià)；微生物多樣性分析

中圖分類(lèi)號(hào)：S816.53""" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A""""" 文章編號(hào)：1007-0435（2024）12-3962-11

收稿日期：2024-03-08；修回日期：2024-04-23

基金項(xiàng)目：山西省牧草產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（2023CYJSTX11-08）；山西省農(nóng)業(yè)重大技術(shù)協(xié)同推廣計(jì)劃（2023XTTG03）資助

作者簡(jiǎn)介：

鄭敏娜（1983-），女，漢族，甘肅通渭人，副研究員，碩士，主要從事牧草生產(chǎn)與加工利用研究，E-mail：zhengminna@126.com

Effects of Ratio of Daylily Stem and Leaf Mixed with Corn Silage on the

Quality of Silage and Microbial Diversity

ZHENG Min-na1，3*， KANG Jia-hui1，3， ZOU Can-yang1，2， HOU Xiang-yang3，

LIANG Xiu-zhi1，3， HAN Zhi-shun1，3， CHEN Yan-ni1，3

（1.High Latitude Crops Institute， Shanxi Agricultural University， Datong， Shanxi Province 037008， China； 2.College of Agronomy，

Shanxi Agricultural University， Taigu， Shanxi Province 030800， China； 3.Key Laboratory for Model Innovation in Forage

Production Efficiency， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Taigu， Shanxi Province 030800， China）

Abstract：In order to explore a new way of utilization of daylily stem and leaf feed resource. In this experiment，daylily by-products were mixed with silage corn according to the mass ratios of 100∶0 （T1），80∶20 （T2），60∶40 （T3），40∶60 （T4），20∶80 （T5） and 0∶100 （T6） for 70 days of fermentation，sensory identification，nutrient composition analysis，quality evaluation and microbial diversity analysis were carried out on different proportions of mixed forage. The results showed that compared to daylily stem and leaf single silage，the mixed silage of daylily stem and leaf and silage corn was beneficial to improve the smell and structure of silage. Based on the grey correlation analysis of 16 silage indicators，it was found that the quality of mixed silage of daylily stem and leaf and silage corn was better than that of daylily stem and leaf silage. At the bacterial genus level，a total of 1192 groups were classified，among which Lactiplantibacillus，Pantoea and unclassified Enterobacter （unclassified_Enterobacteriacea） were the dominant genera in all the mixed silage patterns. Combined to the results of RDA analysis，it was found that Ammonium nitrogen content （ANC） had a more significant effect on the microbial community composition of each sample. To sum up，from the angle of maximizing utilization of stems and leaves of daylily，T4 proportion silage is the best.

Key words：Daylily stem and leaf;Silage corn;Mixed silage;Silage quality evaluation;Microbial diversity analysis

發(fā)展以草食牲畜為主的節(jié)糧型畜牧業(yè)，對(duì)于促進(jìn)現(xiàn)代復(fù)合農(nóng)業(yè)-畜牧業(yè)的整體進(jìn)步具有重要意義。然而，近年來(lái)，隨著國(guó)家農(nóng)業(yè)戰(zhàn)略調(diào)整和市場(chǎng)供需關(guān)系的快速變化，我國(guó)優(yōu)質(zhì)牧草資源的短缺問(wèn)題日益凸顯，飼料短缺已成為制約區(qū)域畜牧產(chǎn)業(yè)進(jìn)一步發(fā)展的關(guān)鍵因素。因此，積極尋找和開(kāi)發(fā)非常規(guī)飼料資源，對(duì)于緩解飼料短缺、保障畜牧業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展具有緊迫性和重要性。

黃花菜（Hemerocallis citrina Baroni）為萱草屬多年生草本植物，又名金針菜、忘憂(yōu)草［1-2］。截至2021年，全國(guó)黃花菜種植面積近7萬(wàn)hm2 ［3］，其中，山西大同市黃花菜產(chǎn)業(yè)規(guī)模發(fā)展迅速，種植面積達(dá)到了1.73萬(wàn)hm2，約占全國(guó)種植面積的24.8%。黃花菜產(chǎn)業(yè)已經(jīng)成為山西北部地區(qū)的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)和農(nóng)民脫貧致富的支柱產(chǎn)業(yè)，促進(jìn)了區(qū)域經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。但大面積的黃花菜種植產(chǎn)生的大量莖葉，未能被合理高效地利用，若將這類(lèi)資源通過(guò)科技創(chuàng)新進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用，不僅可以拓寬飼料來(lái)源，提高飼料的多樣性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還有助于促進(jìn)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的平衡和可持續(xù)發(fā)展。黃花菜莖葉是收獲黃花后剩余的莖稈部分，莖葉生物產(chǎn)量較高，具備飼草化利用的特點(diǎn)。因此，如何利用好黃花莖葉，讓其發(fā)揮更大的經(jīng)濟(jì)效益，成為其飼草化利用開(kāi)發(fā)中我們亟待思考和解決的新問(wèn)題。

隨著青貯技術(shù)的發(fā)展，在我國(guó)大部分地區(qū)，青貯飼料已成為緩解草畜矛盾的重要措施。青貯作為一種經(jīng)濟(jì)可行資源利用方式，不僅可以延長(zhǎng)飼草的貯存期，而且還提高飼草的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和適口性［4-6］。因此，將黃花菜進(jìn)行青貯化利用是新型飼草開(kāi)發(fā)利用的一個(gè)重要方向。目前，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)黃花菜莖葉飼草化利用的研究處于初步探索階段，相關(guān)領(lǐng)域的研究報(bào)道較少，王錦等［7］通過(guò)對(duì)飼糧中添加黃花菜莖葉青貯對(duì)灘羊瘤胃菌群多樣性的影響的研究，發(fā)現(xiàn)青貯中添加不超過(guò)20%的黃花菜莖葉能提升肉羊生產(chǎn)性能；梅寧安等［8］的研究結(jié)果表明，添加50%黃花菜莖葉與玉米混合青貯效果較好，對(duì)肉品質(zhì)的提升貢獻(xiàn)最明顯；楊宇為等［9］的研究結(jié)果表明，生產(chǎn)中黃花菜莖葉與檸條按2∶8混貯，可以提高青貯樣品中粗蛋白和揮發(fā)性脂肪酸的含量。以上學(xué)者們?cè)邳S花菜莖葉利用方式上的探索，為本研究的開(kāi)展奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)參考。

黃花菜莖葉雖然生物產(chǎn)量高，但纖維含量高、蛋白含量較低［9-11］，而青貯玉米作為一種能量飼料，既含有豐富的可溶性糖，又有較高的干物質(zhì)含量，與黃花莖葉混合能夠滿(mǎn)足青貯時(shí)的需求，更有利于提高青貯的成功率和品質(zhì)。因此，將黃花菜莖葉與玉米等其他作物混合制作成青貯將會(huì)是一種更好的利用方式。為更進(jìn)一步探索和研究黃花菜莖葉的青貯飼用價(jià)值，本研究以黃花菜莖葉和青貯玉米為研究對(duì)象，按不同比例將黃花菜莖葉與青貯玉米混合青貯，探討黃花菜莖葉與青貯玉米不同混合比例對(duì)青貯樣品的營(yíng)養(yǎng)成分、青貯品質(zhì)、安全系數(shù)以及微生物區(qū)系的影響，以期篩選出二者混貯的最適比例，從而為黃花菜莖葉等非常規(guī)類(lèi)飼料利用開(kāi)發(fā)提供堅(jiān)實(shí)的數(shù)據(jù)支撐，并為拓展山西乃至全國(guó)可利用的新型飼草資源種類(lèi)和來(lái)源提供參考。

1" 材料與方法

1.1" 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)以刈割收獲的黃花菜莖葉和青貯玉米秸稈為試驗(yàn)材料。其中，全株青貯玉米品種為‘強(qiáng)盛30’，取自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)高寒區(qū)作物研究所毛皂試驗(yàn)基地，在玉米乳熟中期至蠟熟期（4月下旬播種，9月上旬收獲），收獲包括果穗在內(nèi)的地上部植株，留茬高度10 cm，青貯玉米原料營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1；黃花菜品種為‘大同黃花’，取自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)高寒區(qū)作物研究所唐家堡試驗(yàn)基地，于黃花收獲后30～45 d刈割莖葉（4月上旬返青，9月上旬刈割），留茬高度5～8 cm，原料營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1。糖蜜購(gòu)于山西大同市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。青貯塑料袋由聚乙烯材料制成，裝有單向排氣閥，規(guī)格為 60 cm×90 cm，由河南侯氏塑料品廠生產(chǎn)。

1.2" 青貯發(fā)酵試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2023年9—11月進(jìn)行，采用單因素設(shè)計(jì)。將黃花菜莖葉、青貯玉米刈割收獲后迅速切至1～2 cm小段，并用9RZ-6D揉絲機(jī)（河南慶云中開(kāi)機(jī)械廠制造）揉絲，原料水分含量晾曬至65%左右后，將黃花菜莖葉與青貯玉米按質(zhì)量比100∶0（T1），80∶20（T2），60∶40（T3），40∶60（T4），20∶80（T5），0∶100（T6）進(jìn)行混合，共6個(gè)處理，分別添加等量的糖蜜，以15 kg為單位裝入青貯塑料袋中，抽真空密封，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，共計(jì)18個(gè)袋，其中，糖蜜的添加量為20 g·kg-1。發(fā)酵70 d后，測(cè)定青貯樣品的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量、發(fā)酵品質(zhì)、秋水仙堿含量以及微生物多樣性。

1.3" 樣品采集與測(cè)定

1.3.1" 感官質(zhì)量評(píng)定" 根據(jù)德國(guó)農(nóng)業(yè)協(xié)會(huì)的青貯質(zhì)量感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［12］，從青貯飼料的氣味、色澤和質(zhì)地3方面進(jìn)行評(píng)定，根據(jù)感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)可將青貯飼料分為四個(gè)等級(jí)，分別為：優(yōu)良（16～20分）、尚好（10～15分）、中等（5～9分）和腐?。?～4分）。

1.3.2" 常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分含量的測(cè)定 "青貯樣品發(fā)酵70 d后，開(kāi)袋取樣，每個(gè)樣品袋各取樣200 g，60℃烘干至恒重，測(cè)定各樣品常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分指標(biāo)。共測(cè)定8項(xiàng)指標(biāo)，包括：干物質(zhì)（Dry matter，DM），干物質(zhì)損失率（Loss rate of dry matter，LDM，%），粗蛋白質(zhì)（Crude protein，CP），粗脂肪（Ether extract，EE），粗灰分（Crude ash，ASH），中性洗滌纖維（Neutral detergent fiber，NDF），酸性洗滌纖維（Acid detergent fiber，ADF），酸性洗滌木質(zhì)素（Acid washing lignin，ADL）含量。其中：酸性洗滌木質(zhì)素（ADL）按照GB/T 20805-2006 飼料中酸性洗滌木質(zhì)素的測(cè)定方法［13］進(jìn)行測(cè)定；其余指標(biāo)參照鮑士旦［14］的分析方法進(jìn)行測(cè)定。干物質(zhì)損失率（%）＝青貯前干物質(zhì)含量（%）－青貯后干物質(zhì)含量（%）。

1.3.3" 發(fā)酵品質(zhì)和秋水仙堿含量的測(cè)定" 青貯樣品發(fā)酵70 d后，開(kāi)袋取樣60 g，與540 mL無(wú)菌水均勻混合，在4℃環(huán)境下靜置 24 h后，取浸提液測(cè)定各發(fā)酵品質(zhì)指標(biāo)，指標(biāo)主要包括：pH值，乳酸（Lactic acid，LA）、乙酸（Acetic acid，AA）、丙酸（Propionic acid，PA）、丁酸（Butyrate acid，BA）、氨態(tài)氮含量（Ammonium nitrogen content，ANC）以及秋水仙堿含量（Colchicine content，CC）等。其中，pH值采用玻璃電極法測(cè)定［15］；各有機(jī)酸含量采用HPLC法［16］測(cè)定；氨態(tài)氮含量（ANC）參照張麗軍［17］的方法測(cè)定。秋水仙堿含量（CC）采用HPLC法［18］測(cè)定。

1.3.4" 微生物多樣性分析" 開(kāi)袋后，將各樣品混合均勻，首先，使用MN NucleoSpin 96 Soil（MN，Germany）試劑盒進(jìn)行DNA的提?。黄浯?，在PacBio測(cè)序平臺(tái)上，以提取合格的土壤微生物DNA為模板，16SrRNA基因序列引物為擴(kuò)增體系，利用正向引物27F和反向引物1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用AxyPrep DNA Gel Extraction kit （Axygen，USA）提取擴(kuò)增產(chǎn)物，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將擴(kuò)增合格的樣品送北京百邁克生物公司，利用SMRTbell Express Template Prep Kit 2.0試劑盒構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)并在PacBio RS II上進(jìn)行測(cè)序。最后，對(duì)測(cè)序得到的高質(zhì)量CCS（Circular consensus sequencing）序列，應(yīng)用QIIME（v1.7.0）平臺(tái)，進(jìn)行生物信息學(xué)分析［19］。

1.4" 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用Microsoft Excel 2009進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 22.0軟件中的一般線(xiàn)性模型進(jìn)行單因素方差分析（Plt;0.05）；利用灰色關(guān)聯(lián)度理論［20］，進(jìn)行各樣品青貯質(zhì)量的綜合評(píng)價(jià)；利用Mothur v.1.30軟件和R語(yǔ)言工具進(jìn)行α多樣性分析［19］；利用軟件QIIME進(jìn)行β多樣性分析［19］。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 不同處理對(duì)青貯感官質(zhì)量的影響

通過(guò)感官鑒定（嗅、看、摸）可直觀地判斷青貯是否成功。德國(guó)農(nóng)業(yè)協(xié)會(huì)的青貯質(zhì)量感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［12］認(rèn)為，品質(zhì)優(yōu)良的青貯飼料莖葉結(jié)構(gòu)保持良好，無(wú)丁酸嗅味，有芳香果味，且色澤與原料相似。本試驗(yàn)結(jié)果表明（表4），T1，T2，T3，T4，T5，T6等 6個(gè)處理，總體上未發(fā)生霉變，莖葉結(jié)構(gòu)良好，色澤接近玉米莖稈或黃花莖葉原色，其中，T2和T5處理無(wú)丁酸嗅味，氣味芳香；T1和T6處理有微弱的丁酸嗅味，芳香氣味減弱，而T3和T4處理中除有微弱的丁酸嗅味外，伴有微弱的酸味。通過(guò)綜合得分（表2）可知，T5處理得分最高（20分），等級(jí)優(yōu)良。

2.2" 不同處理對(duì)青貯常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分的影響

2.2.1" 干物質(zhì)和干物質(zhì)損失率" 由圖1可以看出，6個(gè)處理青貯樣品的干物質(zhì)（DM）含量主要分布在22.64%～32.63%之間。從T1處理到T6處理，即混合青貯中隨著黃花莖葉質(zhì)量比的逐漸降低，青貯樣品中DM含量呈持續(xù)增加的變化趨勢(shì)，在T6處理（黃花莖葉質(zhì)量比為0）時(shí)到達(dá)最大，為32.63%。其中，T6與T1，T2，T3，T4，T5處理間差異顯著（Plt;0.05），T3，T4，T5與T1處理間也差異顯著（Plt;0.05）。

干物質(zhì)損失率（LDM）表示青貯過(guò)程中干物質(zhì)的減少量占總干物質(zhì)的比例。在本試驗(yàn)中，6個(gè)處理青貯樣品的LDM主要分布在32.02%～34.72%之間（圖1）。其中，T1處理的LDM最大，為34.72%，T4處理次之（34.03%），T1和T4處理與T2，T3，T5，T6處理間差異顯著（Plt;0.05）。

2.2.2" 粗灰分、粗脂肪、粗蛋白含量" 由表3可知，6個(gè)處理青貯樣品的粗灰分（ASH）含量最低的是T1處理，僅為6.36%，與T2，T3，T4，T5，T6處理間差異顯著（Plt;0.05）。6個(gè)處理青貯樣品的粗脂肪（EE）含量變化范圍為1.44%～3.00%，從T1處理到T6處理，即混合青貯中隨著黃花莖葉質(zhì)量比的逐漸降低，青貯樣品中EE含量呈持續(xù)降低的變化趨勢(shì)。其中，T1處理的EE含量最高為3.00%，與T3，T4，T5，T6處理間差異顯著（Plt;0.05）。6個(gè)處理青貯樣品的粗蛋白（CP）含量主要分布在8.48%～12.98%之間，其中，T4，T5，T6CP含量較高，均在12.01%以上，3個(gè)處理間差異不顯著；T1處理的CP含量最低，僅為8.48%，與T3，T4，T5，T6處理間差異顯著（Plt;0.05）。

2.2.3" 木質(zhì)纖維組分含量" 由表4可知，各處理青貯樣品的酸性洗滌纖維（ADF）值分布在31.19%～40.45%范圍內(nèi)，各處理間具有不同程度的差異。其中，T6處理的ADF含量最低，為31.19%，與T1處理間差異顯著（Plt;0.05）。

各處理的中性洗滌纖維（NDF）值分布在36.78%～48.21%之間，其中，含量以T6處理最低，為36.78%，T2處理的含量值最高，為48.21%。

酸性洗滌木質(zhì)素（ADL）是木質(zhì)素和酸不溶灰分的組合。在本試驗(yàn)中，ADL隨混合青貯中黃花莖葉質(zhì)量比的逐漸降低呈先下降后增加再下降的變化趨勢(shì)，在T1處理中含量最高，為33.95%，T4處理中次之，為32.40%，T6處理中含量最低，為22.78%，T6處理與T1，T2，T3，T4處理間差異顯著（Plt;0.05）。

2.3" 不同處理對(duì)青貯品質(zhì)和秋水仙堿含量的影響

pH值是反映青貯成功與否的重要指標(biāo)。若青貯樣品的乳酸發(fā)酵良好，pH值較低，而發(fā)生不良發(fā)酵，則pH值升高。多項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果表明［21-23］，全株青貯玉米的適宜pH值在3.8～4.5之間，酸度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致青貯飼料變質(zhì)，酸度過(guò)低則會(huì)影響青貯飼料的口感和消化吸收。本試驗(yàn)結(jié)果表明（表5），各處理樣品的pH值分布在4.13～4.51之間，其中，T3處理的pH值最低，為4.13，T6處理的pH值最高，為4.51，各處理間差異不顯著。

不同有機(jī)酸（LA，AA，PA，BA）含量可以反映青貯發(fā)酵過(guò)程及青貯飼料品質(zhì)的優(yōu)劣。由表5可知，隨著青貯樣品中青貯玉米含量增加、黃花莖葉含量減少，乳酸（LA）含量呈現(xiàn)出持續(xù)增加的變化趨勢(shì)，T6處理時(shí)達(dá)到峰值，T6處理與T1，T2，T3處理間差異顯著（Plt;0.05）；乙酸（AA）含量則呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì)，在T3處理達(dá)到峰值，為59.21 g·kg-1，與其他處理間差異顯著（Plt;0.05）；丙酸（PA）含量也呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢(shì)，在T4處理時(shí)達(dá)到峰值，為171.77 g·kg-1，與其他處理間差異顯著（Plt;0.05）；丁酸（BA）含量則呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律，其中，T6和處理T3BA含量較高，分別為1.01 g·kg-1和0.98 g·kg-1，T4和處理T1BA含量次之，分別為0.27 g·kg-1和0.24 g·kg-1，T2和T5處理BA含量為0 g·kg-1，且T2和T5處理與T1，T3，T4，T6處理間差異顯著（Plt;0.05）。

混合青貯樣品中氨態(tài)氮（ANC）含量代表青貯飼料發(fā)酵過(guò)程中蛋白的降解程度。由表5可知，T6處理的ANC最高，為3.29 g·kg-1，T3處理的ANC含量次之，為2.53 g·kg-1；T1處理的ANC含量最低，為1.27 g·kg-1，T1處理與T2處理間差異不顯著，與T3，T5，T6處理間差異顯著（Plt;0.05）。

由表5可知，經(jīng)青貯發(fā)酵后，各處理中秋水仙堿含量均為0 μg·g-1。

2.4" 不同處理對(duì)青貯質(zhì)量的綜合評(píng)價(jià)

采用灰色關(guān)聯(lián)度分析法對(duì)不同混合比例的黃花莖葉和青貯玉米混合青貯樣品進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，選取DM，LDM，CP，EE，ASH，NDF，ADF，ADL，pH，LA，AA，PA，BA，ANC，CC等15個(gè)指標(biāo)的加權(quán)關(guān)聯(lián)度值進(jìn)行排名，加權(quán)關(guān)聯(lián)度值越大表示青貯樣品質(zhì)量越高，其中，DM，CP，EE，ASH，LA，PA，CC含量等7個(gè)指標(biāo)為正向指標(biāo)，LDM，NDF，ADF，ADL，pH，AA，BA，ANC含量等 8個(gè)指標(biāo)為負(fù)向指標(biāo)。由表6可知，加權(quán)關(guān)聯(lián)度值排序依次為：T6gt;T4gt;T3gt;T5gt;T2gt;T1，即青貯品質(zhì)表現(xiàn)較好的混合比例是T6處理（黃花莖葉∶青貯玉米=0∶100），T4處理（黃花莖葉∶青貯玉米=40∶60）和T3處理（黃花莖葉∶青貯玉米=60∶40）次之。

2.5" 不同處理對(duì)青貯過(guò)程中微生物多樣性的影響

2.5.1" Alpha多樣性分析" 在本研究中，各青貯處理組的覆蓋度均為1.00，可以覆蓋樣本中的所有微生物，由圖2A和圖2B可知，ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)表現(xiàn)出相同的變化趨勢(shì)，即T1gt;T2gt;T6gt;T5gt;T4gt;T3，各處理間差異不顯著；由圖2C可知，Shannon指數(shù)值由高到低的順序依次為T(mén)1gt;T4gt;T5gt;T6gt;T2gt;T3，T2，T3與其他4個(gè)處理間差異顯著（Plt;0.05）；由圖2D可知，T3處理的Simpson多樣性指數(shù)最低，為0.261，與T1，T6處理間差異顯著（Plt;0.05）。

2.5.2" Bata多樣性分析" 通過(guò)主坐標(biāo)分析（PCA）可以直觀地解釋每個(gè)處理樣品中細(xì)菌間的系統(tǒng)發(fā)育距離。如圖3所示，在本研究中，6個(gè)不同處理形成的細(xì)菌群落主要分布在第三和第四象限，各處理之間的坐標(biāo)距離較小。其中，第1坐標(biāo)可以解釋88.90%的樣本間的物種差異，第2坐標(biāo)可以解釋4.94%的樣本間的物種差異，物種累積百分比方差達(dá)到93.84%。從PCA分析結(jié)果可以看出，不同混合比例的青貯樣品形成了不同的細(xì)菌群落，但各處理間的差異不顯著。

2.5.3" 青貯微生物相對(duì)豐度分析" 為了較詳細(xì)地了解6個(gè)不同處理青貯樣品的細(xì)菌分類(lèi)差異，本研究在屬水平上對(duì)細(xì)菌群落進(jìn)行了分類(lèi)（圖4），在屬水平上，共有1192個(gè)類(lèi)群被分類(lèi)，其中，T4，T5和T6 3個(gè)處理中類(lèi)群最豐富。在6組樣品中，相對(duì)豐富度占比前十位的菌屬依次為植物乳桿菌屬（Lactiplantibacillus）、泛菌屬（Pantoea）、未分類(lèi)的腸桿菌屬（unclassified_Enterobacteriacea）、腸球菌屬（Enterococcus）、未分類(lèi)Cyanobacteriales（unclassified_Cyanobacteriales）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、短促生乳桿菌屬（Levilactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、伴生乳桿菌屬（Companilactobacillus）、片球菌屬（Pediococcus）。其中，植物乳桿菌屬（Lactiplantibacillus）、腸球菌屬（Enterococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、短促生乳桿菌屬（Levilactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、伴生乳桿菌屬（Companilactobacillus）和片球菌屬（Pediococcus）等7個(gè)菌屬屬于乳酸菌屬。

從圖4和圖5中還可以看出，植物乳桿菌屬（Lactiplantibacillus）在T1-T6樣品中均占主導(dǎo)地位，為第一優(yōu)勢(shì)菌屬，在各處理中的相對(duì)豐度占比在51.4%以上，在T3處理甚至達(dá)到93.1%，顯著高于T1和T6處理（Plt;0.05）。泛菌屬（Pantoea）和未分類(lèi)的腸桿菌屬（unclassified_Enterobacteriacea）均在T1和T6處理中相對(duì)豐度較高，其中泛菌屬（Pantoea）在T1處理中相對(duì)豐度占比達(dá)到8.90%，在T6處理中為1.91%，而在其他4個(gè)處理中豐富度明顯降低，與T2，T3，T4和T5處理間差異顯著（Plt;0.05）。未分類(lèi)的腸桿菌屬（unclassified_Enterobacteriacea）則在T6處理中相對(duì)豐度占比最高，為6.56%，T1處理次之，為2.54%，二者與T2，T3處理間差異顯著（Plt;0.05）。腸球菌屬（Enterococcus）在T2，T3，T4，T5和T6處理中為優(yōu)勢(shì)菌群，相對(duì)豐度主要分布在1.3%～2.1%之間，而在T1處理中處于較低水平，僅為0.5%，與各處理間差異顯著（Plt;0.05）。此外，乳桿菌屬（Lactobacillus）在T6處理中處于較高水平，相對(duì)豐度為5.71%；短促生乳桿菌屬（Levilactobacillus）在T4和T1處理中處于較高水平，相對(duì)豐度分別為2.20%和1.19%，而其余各處理的乳桿菌屬（Lactobacillus）和短促生乳桿菌屬（Levilactobacillus）的相對(duì)豐度均在1%以下，且各處理間差異均不顯著。而魏斯氏菌屬（Weissella）、伴生乳桿菌屬（Companilactobacillus）相對(duì)豐度則均在T4和T5處理中處于較高水平（gt;1%），與其他各處理間差異均不顯著。

2.5.4" 青貯細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子的關(guān)系" 為了解影響青貯飼料中細(xì)菌群落組成的主導(dǎo)因子，以青貯飼料中細(xì)菌群落屬水平已分類(lèi)且相對(duì)豐度大于1.0% 的類(lèi)群為響應(yīng)變量，以DM，LDM，CP，EE，ASH，NDF，ADF，ADL，pH，LA，AA，PA，BA，ANC等指標(biāo)為解釋變量進(jìn)行冗余分析（圖6）。在屬水平上，RDA1和RDA2成分能夠解釋細(xì)菌菌群57.23%的變化。由圖6可知，植物乳桿菌屬（Lactiplantibacillus）、短促生乳桿菌屬（Levilactobacillus）、伴生乳桿菌屬（Companilactobacillus）相對(duì)豐度與PA，EE，BA，ADL，CP，LA，ASH，ADF，NDF含量呈正相關(guān)關(guān)系（Plt;0.05），與pH，DM，ANC，AA含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（Plt;0.05）；魏斯氏菌屬（Weissella）相對(duì)豐度與PA，AA含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（Plt;0.05），與其他含量間呈正相關(guān)關(guān)系（Plt;0.05）；片球菌屬（Pediococcus）、未分類(lèi)的腸桿菌屬（Unclassified_Enterobacteriacea）、腸球菌屬（Enterococcus）相對(duì)豐度與PA，EE含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（Plt;0.05）；未分類(lèi)Cyanobacteriales（unclassified_Cyanobacteriales）和乳桿菌屬（Lactobacillus）相對(duì)豐度則和BA，PA，EE含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系（Plt;0.05）。此外，RDA結(jié)果揭示出ANC，ADF，NDF，Ash，ADL含量對(duì)不同處理下的微生物群落組成有著更為顯著的影響。

3" 討論

3.1" 青貯常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分的影響

青貯原料是青貯質(zhì)量的優(yōu)良基礎(chǔ)保障?；旌习l(fā)酵后，飼料中各營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)含量直接表征其品質(zhì)的優(yōu)劣。干物質(zhì)（DM） 含量是青貯發(fā)酵的重要指標(biāo)之一［24］，青貯原料的特性及混合比例會(huì)引起DM含量的變化。在本研究中，隨著青貯飼料中青貯玉米含量增加、黃花莖葉含量減少，青貯樣品的干物質(zhì)（DM）含量呈現(xiàn)出持續(xù)增加的趨勢(shì)，T2，T3，T4，T5，T6處理中的DM含量顯著高于T1處理，這一結(jié)果表明青貯玉米的添加能夠顯著提高青貯飼料的DM含量，從而增強(qiáng)飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。同時(shí)，相對(duì)于黃花菜單貯（T1），青貯樣品中添加適量青貯玉米有助于減少青貯過(guò)程中的干物質(zhì)損失，提高飼料的貯存效果。楊宇為等［10］研究表明黃花菜莖葉青貯中適當(dāng)添加玉米有助于提高混合青貯樣品的干物質(zhì)含量，與本研究結(jié)果一致。

粗脂肪（EE）和粗灰分（ASH）是植物體營(yíng)養(yǎng)貯存物質(zhì)，是維生素、礦物質(zhì)吸收不可缺少的媒介［25-26］。本研究中隨著黃花莖葉質(zhì)量比的逐漸降低，青貯樣品中EE含量呈持續(xù)降低的變化趨勢(shì)，說(shuō)明將黃花莖葉應(yīng)用于青貯玉米中有助于提高飼料的EE含量；而粗灰分含量呈持續(xù)增加的趨勢(shì)，但各處理間差異不顯著。由此也可驗(yàn)證，通過(guò)向青貯玉米中加入不同原料進(jìn)行混合青貯，有助于青貯品質(zhì)改善［27］。

青貯飼料中，蛋白質(zhì)（CP）含量越高，其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值也越高［28］。同時(shí)，木質(zhì)纖維組分（ADF，NDF，ADL等）含量也是評(píng)價(jià)青貯飼料品質(zhì)好壞最直接的指標(biāo)［29］。梁小玉等［30］研究表明，全株玉米和菊苣以1∶1等比例混合青貯后其CP含量顯著升高，NDF和ADF含量顯著降低；鄭林峰等［31］研究發(fā)現(xiàn)青貯飼料中NDF與ADF含量呈現(xiàn)正相關(guān)變化規(guī)律，二者和CP含量呈負(fù)相關(guān)變化規(guī)律。本研究結(jié)果表明，相對(duì)于黃花菜莖葉單貯（T1），青貯樣品中添加適量的青貯玉米后，不但提高了飼料中粗蛋白的含量，而且也提高了飼料的消化率和利用率，從而適當(dāng)改善飼料的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和適口性。

3.2" 青貯發(fā)酵品質(zhì)和安全系數(shù)的影響

pH值的高低作為青貯成功與否的重要指標(biāo)，反映了青貯過(guò)程中的發(fā)酵程度。適宜的pH值范圍為3.8～4.5，不僅能夠有效抑制有害微生物的生長(zhǎng)，還能維持青貯飼料的口感和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值［32］。本試驗(yàn)中，各處理樣品的pH值均基本分布在這一理想范圍內(nèi)，且差異不顯著，表明各處理均實(shí)現(xiàn)了良好的乳酸發(fā)酵。

乳酸（LA）作為青貯發(fā)酵的主要產(chǎn)物之一，其含量高低與乳酸菌的活性強(qiáng)弱緊密相關(guān)，LA含量越高越有利于青貯飼料的保存和品質(zhì)提升［33］。本研究中，隨著青貯玉米比例的增加，乳酸含量持續(xù)增加，說(shuō)明青貯玉米表面附著的菌群更有利于青貯的發(fā)酵［25］，這一結(jié)論與其他學(xué)者［30-33］的結(jié)論是一致的。值得注意的是，在T4處理中丙酸（BA）含量顯著高于其他處理，這個(gè)可能是因?yàn)樵谇噘A過(guò)程中存在較多數(shù)量的腸桿菌，利用已糖和戊糖發(fā)酵生成丙酸，從而導(dǎo)致丙酸含量增加［29］；而丁酸（AA）含量在T2和T5處理中含量為0，這可能因?yàn)閜H值在4.32～4.38這個(gè)范圍內(nèi)抑制了能夠生成丁酸梭狀芽胞桿菌、酪酸菌的繁殖［23］。

氨態(tài)氮含量（ANC）作為反映青貯飼料發(fā)酵過(guò)程中蛋白降解程度的重要指標(biāo)，其高低直接關(guān)系到青貯飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值［34-35］。本試驗(yàn)中，T6處理的氨態(tài)氮含量最高，說(shuō)明相同發(fā)酵條件下，玉米單貯更容易造成蛋白質(zhì)的損失，若青貯玉米中適當(dāng)添加一些如黃花菜莖葉等原料有助于降低營(yíng)養(yǎng)成分的損耗，這與梅寧安等［8］研究結(jié)果類(lèi)似。

此外，秋水仙堿含量（CC）是評(píng)估黃花菜青貯飼料安全性的一項(xiàng)重要指標(biāo)。秋水仙堿主要存在于鮮黃花菜中，這是導(dǎo)致黃花菜中毒的主要原因。在黃花莖葉飼料的使用過(guò)程中，有必要控制秋水仙堿的含量，以避免對(duì)動(dòng)物造成危害。本試驗(yàn)中各處理均為0 μg·g-1，表明各處理?xiàng)l件下均未產(chǎn)生秋水仙堿，從而保證了青貯飼料的安全性。秋水仙堿在黃花莖葉飼料中雖然不是一個(gè)重要的營(yíng)養(yǎng)成分，但在飼料的生產(chǎn)和使用過(guò)程中，有必要檢測(cè)其含量，以確保飼料的安全性和有效性。

3.3" 青貯微生物多樣性的影響

青貯發(fā)酵是一個(gè)微生物群落動(dòng)態(tài)演變的過(guò)程［36］。大量研究已證實(shí)，青貯原料配比的改變都會(huì)不同程度地促使青貯飼料中微生物群落的多樣性和豐富度發(fā)生改變［37-39］，通常將微生物多樣性降低作為青貯發(fā)酵成功的標(biāo)志［40］。在本研究中，發(fā)酵70 d后，T1處理組的物種豐富度指數(shù)（ACE和Chao1）最高，而T3處理組的物種豐富度指數(shù)（ACE和Chao1）最低，結(jié)合細(xì)菌群落多樣性（Shannon指數(shù)）變化趨勢(shì)，發(fā)現(xiàn)T3處理組在物種豐富度上沒(méi)有顯著差異，但它們的均勻度卻顯著降低。這可能是由于T3處理組在發(fā)酵70 d后，乳酸菌群成為優(yōu)勢(shì)菌群（圖3），快速生長(zhǎng)和繁殖，從而降低了群落的均勻度，這也說(shuō)明了T3處理有利于提高青貯發(fā)酵成功率和品質(zhì)。

青貯飼料中微生物群落結(jié)構(gòu)和功能會(huì)在青貯原料配比和發(fā)酵時(shí)間的共同作用下表現(xiàn)出不同的響應(yīng)機(jī)制或響應(yīng)策略［39，41］。本研究中，在屬水平上植物乳桿菌屬（Lactiplantibacillus）作為第一優(yōu)勢(shì)菌屬，其相對(duì)豐度占比超過(guò)51.4%，甚至在T3處理中高達(dá)93.1%。植物乳桿菌作為乳酸菌的一種，其能夠利用多用種糖進(jìn)行發(fā)酵［42］，青貯玉米質(zhì)量比越高發(fā)酵環(huán)境中含糖量越高，這就為植物乳酸桿菌提供了更充足的能量來(lái)源和發(fā)酵底物，產(chǎn)生大量乳酸，這與研究中乳酸含量的變化趨勢(shì)相吻合。此外，其他乳酸菌屬如腸球菌屬（Enterococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）、短促生乳桿菌屬（Levilactobacillus）等也在不同處理中占據(jù)一定比例，這些乳酸菌的協(xié)同作用共同促進(jìn)了青貯發(fā)酵的進(jìn)行。泛菌屬（Pantoea）在T1處理中相對(duì)豐度占比較大，這可能與黃花莖葉的含量較高有關(guān)，更有利于其在有機(jī)物的分解和轉(zhuǎn)化過(guò)程中起到了相對(duì)主導(dǎo)作用，進(jìn)而對(duì)青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)產(chǎn)生一定影響。未分類(lèi)的腸桿菌屬（unclassified_Enterobacteriacea）在T6處理中相對(duì)豐度占比最高，這可能意味著在青貯玉米含量較高的條件下，其表面附著的菌群在發(fā)酵過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［42］。腸球菌屬（Enterococcus）作為一種常見(jiàn)的乳酸菌［36］，在青貯發(fā)酵過(guò)程中可能與其他乳酸菌共同作用，促進(jìn)乳酸的生成和有機(jī)物的轉(zhuǎn)化，在本研究中T2，T3，T4，T5，T6處理中的相對(duì)豐度遠(yuǎn)高于T1處理，這可能是由于青貯玉米中具有的營(yíng)養(yǎng)成分為腸球菌屬菌群提供了更多的能量來(lái)源。魏斯氏菌屬（Weissella）和伴生乳桿菌屬（Companilactobacillus）在T4和T5處理中相對(duì)豐度較高，這可能與這2個(gè)處理中黃花莖葉和青貯玉米的混合比例有關(guān)，不同的原料配比影響了微生物群落的組成和活性［37］。此外，雖然各處理間細(xì)菌群落的差異在PCA分析結(jié)果中并未顯示出顯著差異，但通過(guò)進(jìn)一步的分類(lèi)分析，我們發(fā)現(xiàn)了不同處理對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響差異。例如，如泛菌屬（Pantoea）在T1和T6處理中的相對(duì)豐度占比較大，而未分類(lèi)的腸桿菌屬（unclassified_Enterobacteriacea）在T6處理中的相對(duì)豐度占比最高，這些差異可能反映了不同處理?xiàng)l件下微生物群落的多樣性和功能差異。此外，混合青貯飼料中不同原料添加比例引起的環(huán)境因素變化對(duì)群落中不同微生物群的貢獻(xiàn)各不相同［19］，從本試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，木質(zhì)纖維組分（ADF，NDF，ADL等）含量對(duì)青貯的細(xì)菌群落有著更為顯著的影響。

4" 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，與黃花菜莖葉單貯相比，黃花菜莖葉與青貯玉米混合青貯有利于改善青貯飼料的氣味和結(jié)構(gòu)；基于對(duì)16個(gè)青貯指標(biāo)的灰色關(guān)聯(lián)度分析發(fā)現(xiàn)，青貯玉米單貯的青貯品質(zhì)最優(yōu)，黃花菜莖葉與青貯玉米以40∶60混合青貯的品質(zhì)次之。通過(guò)微生物多樣性分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌屬（Lactiplantibacillus）、泛菌屬（Pantoea）、未分類(lèi)的腸桿菌屬（unclassified_Enterobacteriacea）是所有混合青貯模式中的優(yōu)勢(shì)屬，并且ANC，ADF，NDF，ASH，ADL含量等對(duì)各樣品微生物群落組成有著更為顯著的影響。綜上考慮，從黃花菜莖葉利用最大化角度出發(fā)，以T4（黃花菜莖葉∶青貯玉米=40∶60）比例青貯為佳。

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（責(zé)任編輯" 閔芝智）