微小RNA-665表達變化對膠質(zhì)瘤細胞增殖、遷移及侵襲的影響

【摘要】目的 分析膠質(zhì)瘤組織中微小RNA（miR）-665表達變化對膠質(zhì)瘤細胞增殖、遷移及侵襲的影響，為臨床治療提供參考。方法 選取2010年12月至2019年4月遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院收治的113例膠質(zhì)瘤患者的臨床資料，進行回顧性分析。收集所有患者的癌組織樣本及癌旁組織的非癌性樣本，使用2-△△Ct法測定樣本中miR-665的相對表達量，分析miR-665的表達與臨床病理特征的關(guān)系；使用CCK-8法檢測miR-665表達對細胞增殖能力的影響；使用劃痕實驗、Transwell小室實驗檢測miR-665表達對細胞遷移能力、侵襲能力的影響。結(jié)果 癌組織樣本中miR-665的表達量低于癌旁組織，U251MG細胞、A172細胞、LN18細胞、T98G細胞中miR-665的表達量均低于正常組細胞。表達較高組患者卡氏功能狀態(tài)（KPS）評分gt;80分、TNM分級Ⅰ～Ⅱ級占比均高于表達較低組（均Plt;0.05）。細胞培養(yǎng)24～72 h內(nèi)，miR-665+質(zhì)粒pcDNA3.1組細胞的增殖率均低于NC組和對照組，且對照組細胞增殖率均低于NC組。細胞培養(yǎng)24 h后，miR-665+pcDNA3.1組細胞的相對遷移率和相對侵襲率均低于NC組和對照組，且對照組相對遷移率和相對侵襲率均低于NC組。

結(jié)論 miR-665可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮抑制作用，其表達水平與患者病情及細胞生物學(xué)行為密切相關(guān)，對miR-665的深入研究有望為膠質(zhì)瘤的診斷和治療提供新的方向和靶點。

【關(guān)鍵詞】微小RNA-665；膠質(zhì)瘤細胞；增殖；遷移；侵襲

【中圖分類號】R739.4 【文獻標識碼】A 【文章編號】2096-2665.2024.23.0009.04

DOI：10.3969/j.issn.2096-2665.2024.23.003

膠質(zhì)瘤是一種起源于神經(jīng)膠質(zhì)細胞的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，其惡性程度高、生長速度較快，易侵犯周圍的正常腦組織[1-2]。因此，深入研究膠質(zhì)瘤的發(fā)病機制并尋找新的治療靶點具有重要臨床意義。微小RNA（miR）屬于內(nèi)源性非編碼小RNA，可與靶基因的3'非翻譯區(qū)結(jié)合，通過抑制靶基因的翻譯過程或促使靶基因mRNA降解，在基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。有研究表明，miR-665在多種腫瘤中存在異常表達，但其在膠質(zhì)瘤中的作用機制尚不明確[4-5]?；诖耍狙芯刻接懩z質(zhì)瘤組織中miR-665表達變化對膠質(zhì)瘤細胞增殖、遷移及侵襲的影響，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年12月至2019年4月遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院收治的113例膠質(zhì)瘤患者的臨床資料，進行回顧性分析?；颊咧心行?9例，女性64例；年齡45～65歲，平均年齡（52.63±1.42）歲。本研究經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準。納入標準：⑴符合中膠質(zhì)瘤的診斷標準[6]，且經(jīng)臨床檢查確診；⑵低級別膠質(zhì)瘤；⑶臨床資料完整。排除標準：⑴近6個月內(nèi)接受過其他惡性腫瘤治療者；⑵合并其他重要臟器器質(zhì)性病變者；⑶合并認知功能障礙、癲癇等精神類疾病者。

1.2 研究方法 收集所有患者的癌組織樣本及癌旁組織的非癌性樣本，觀察并記錄患者臨床資料，包括年齡（≤50歲、 gt;50歲）、性別（男性、女性）、腫瘤最大直徑（≤5 cm、 gt;5 cm）、卡氏功能狀態(tài)（KPS）評分[7]（≤80分、gt;80分）、 TNM分級[8]（Ⅰ～Ⅱ級、Ⅲ～Ⅳ級）。出院后以網(wǎng)絡(luò)、門診、住院等方式隨訪4年，前2年每3個月進行1次隨訪，后2年每6個月進行1次隨訪，收集并統(tǒng)計患者生存信息。

⑴總RNA提取。取適量樣本組織，加入一定量的Trizol試劑，震蕩搖勻，細胞充分裂解后在溶液中加入氯仿溶液，混勻后置于室溫培養(yǎng)約3 min。在4 ℃的環(huán)境下以3 500 r/min的轉(zhuǎn)速（離心半徑12 cm）離心8 min，將上層RNA收集到EP管中，加入等體積的異丙醇溶液，混勻后于室溫下靜置15 min。棄上層清液，使用乙醇溶液清洗白色沉淀，采用焦碳酸二乙酯（DEPC）溶液進行水溶解后獲得RNA。通過實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（qRT-PCR），采用2-△△Ct法檢測組織細胞中miR-665的表達量（試劑盒及配套試劑均購自美國Invitrogen公司，嚴格按照說明書操作）。⑵細胞培養(yǎng)。人腦膠質(zhì)瘤細胞系選擇U251MG、A172、LN18、T98G、同組織正常細胞。所有細胞均購自中國科學(xué)院細胞庫/干細胞庫，細胞培養(yǎng)條件及時間均嚴格按照說明書操作，如正常細胞培養(yǎng)條件為氣相：空氣95%、CO2 5%；溫度：37 ℃；培養(yǎng)4 d?？俁NA提取與檢測方法同⑴，分析并統(tǒng)計U251MG、A172、LN18、T98G細胞中miR-665的表達情況。

選擇U251MG細胞展開miR-665表達量對膠質(zhì)瘤細胞增殖、遷移、侵襲的影響研究。⑴轉(zhuǎn)染試驗。取適量細胞接種至6孔板，分為對照組（不進行轉(zhuǎn)染試驗的等量U251MG細胞）、陰性對照（NC）組（加入miR-665抑制劑）、miR-665+質(zhì)粒pcDNA3.1組（加入miR-665+ pcDNA3.1）。⑵CCK-8法。取適量3組細胞接種于96孔板中，分別在各孔中加入CCK-8溶液，培養(yǎng)條件為氣相：空氣95%、CO2 5%；溫度：37 ℃；培養(yǎng)2 h。棄置CCK-8混合液，加入終止液，混勻10 min后，使用酶標儀（帝肯奧地利有限責(zé)任公司，國械注進20182221923，型號：Infinite F50）檢測細胞對450 nm波長吸光度（D450）值，記錄完畢后繼續(xù)放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h。⑶劃痕實驗。取適量3組細胞分別接種到24孔細胞培養(yǎng)板中，當細胞生長的融合度到達80%后，采用無菌槍頭在無血清培養(yǎng)基上劃出大小約2 cm×2 cm的方格，將3組細胞分別接種至方格中心，后放入培養(yǎng)箱，培養(yǎng)條件為氣相：空氣95%、CO2 5%；溫度：37 ℃；培養(yǎng)24 h。于培養(yǎng)開始時、培養(yǎng)24 h后拍照記錄。⑷Transwell小室實驗。取適量3組細胞分別接種于Transwell上室（未填充血清培養(yǎng)基），下室填充10%小牛血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為氣相：空氣95%、CO2 5%；溫度：37 ℃；培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)完成后分別取3組細胞相同位置大小約1 cm×1 cm的培養(yǎng)基，使用結(jié)晶紫染液進行染色，于顯微鏡下觀察細胞數(shù)量。

1.3 觀察指標 ⑴miR-665的表達情況。比較癌組織與癌旁組織中miR-665的表達量，比較正常組細胞、U251MG細胞、 A172細胞、 LN18細胞、 T98G細胞中miR-665的表達量。⑵miR-665的表達與臨床病理特征的關(guān)系。以癌組織中miR-665表達量的中位數(shù)為界，分為表達較高組（miR-665表達量≥中位數(shù)，58例）和表達較低組（miR-665表達量lt;中位數(shù)，55例），比較兩組患者臨床病理特征。⑶miR-665在膠質(zhì)瘤組織細胞中的增殖作用。于CCK-8法培養(yǎng)24、 48、 72 h后，采用酶標儀進行檢測，記錄并計算細胞增殖率。細胞增殖率=[（不同時間點的D450值-2 h的D450值）/對應(yīng)時間點的D450值]×100%。⑷miR-665在膠質(zhì)瘤組織細胞中的遷移、侵襲作用。采用劃痕實驗評估3組細胞遷移情況，相對遷移率=[（培養(yǎng)24 h后細胞遷移面積-開始培養(yǎng)時細胞占用面積）/培養(yǎng)24 h后細胞遷移面積]×100%；采用Transwell小室實驗評估3組細胞侵襲情況，于顯微鏡下取染色情況較好的區(qū)域進行觀察，相對侵襲率=細胞侵襲面積/觀察視野面積×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 25.00統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料以[例（%）]表示，采用χ2檢驗。以Plt;0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-665的表達與臨床病理特征的關(guān)系 兩組患者年齡、性別、腫瘤最大直徑比較。差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均Pgt;0.05）。表達較高組患者KPS評分gt;80分、 TNM分級Ⅰ～Ⅱ級的占比均高于表達較低組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均Plt;0.05），見表1。

2.2 miR-665的表達情況 癌組織樣本中miR-665的表達量低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05），見圖1-A。 U251MG細胞、 A172細胞、 LN18細胞、 T98G細胞中miR-665的表達量均低于正常組細胞，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05），見圖1-B。

2.3 miR-665在膠質(zhì)瘤組織細胞中的增殖作用 細胞培養(yǎng)

24～72 h內(nèi)， miR-665+pcDNA3.1組細胞的增殖率均低于NC組和對照組，且對照組細胞增殖率均低于NC組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均Plt;0.05），見圖2。

2.4 miR-665在膠質(zhì)瘤組織細胞中的遷移、侵襲作用 細胞培養(yǎng)24 h后， miR-665+pcDNA3.1組細胞的相對遷移率和相對侵襲率均低于NC組和對照組，且對照組相對遷移率和相對侵襲率均低于NC組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均Plt;0.05），見圖3。

3 討論

膠質(zhì)瘤具有高度的侵襲性，可廣泛浸潤周圍正常腦組織，難以通過手術(shù)完全切除，常生長迅速，能在短時間內(nèi)對周圍組織造成嚴重破壞，使患者的病情進展迅速，且其在細胞形態(tài)、分子特征、生物學(xué)行為等方面存在高度異質(zhì)性，不同患者的膠質(zhì)瘤可能具有不同的基因突變、基因表達譜及治療反應(yīng)，增加治療難度[9]。

本研究結(jié)果顯示，癌組織樣本中miR-665的表達量低于癌旁組織，U251MG細胞、A172細胞、LN18細胞、T98G細胞中miR-665的表達量均低于正常組細胞；表達較高組患者KPS評分gt;80分、TNM分級I～II級占比均高于表達較低組；細胞培養(yǎng)24～72 h內(nèi)，miR-665+pcDNA3.1組細胞的增殖率均低于NC組和對照組，且對照組細胞增殖率均低于NC組；細胞培養(yǎng)24 h后，miR-665+pcDNA3.1組細胞的相對遷移率和相對侵襲率均低于NC組和對照組，且對照組相對遷移率和相對侵襲率均低于NC組。這些結(jié)果提示miR-665可能通過與靶基因的特定序列結(jié)合，激活細胞間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，對下游細胞的信號通路產(chǎn)生刺激作用，最終對細胞的增殖、遷移及侵襲造成影響。分析原因為，腫瘤組織中特定的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶可能使miR-665基因啟動子區(qū)域發(fā)生高甲基化，從而抑制其轉(zhuǎn)錄[10]。同時，若抑制miR-665轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子在腫瘤組織中高表達，或促進miR-665轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子活性降低，也可能導(dǎo)致miR-665表達量下降[11]。此外，腫瘤微環(huán)境中的各種因素，如缺氧、炎癥細胞、生長因子等，通過與靶基因結(jié)合，靶向一些促進細胞增殖的基因，抑制其表達，使細胞周期停滯在DNA合成前期，從而降低細胞增殖率[12]。同時，miR-665可能還影響細胞間黏附分子的表達，改變細胞間的黏附性，進一步影響細胞的遷移行為[13]。

綜上所述，miR-665可能在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮抑制作用，其表達水平與患者病情及細胞生物學(xué)行為密切相關(guān)，對miR-665的深入研究有望為膠質(zhì)瘤的診斷和治療提供新的方向和靶點。

參考文獻

國家衛(wèi)生健康委員會醫(yī)政醫(yī)管局，中國抗癌協(xié)會腦膠質(zhì)瘤專業(yè)委員會，中國醫(yī)師協(xié)會腦膠質(zhì)瘤專業(yè)委員會.腦膠質(zhì)瘤診療指南（2022版）[J].中華神經(jīng)外科雜志， 2022， 38（8）： 757-777.

樊星，劉幸，柴睿超，等. 2020版美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)腦膠質(zhì)瘤臨床實踐指南解讀[J].中華神經(jīng)外科雜志， 2021， 37（6）： 541-545.

張永博，王文華，王冉，等.外泌體miRNA在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中的研究進展及展望[J].現(xiàn)代消化及介入診療， 2024， 29（2）： 248-252.

武倫，湯志剛，李生偉，等.外泌體miRNA在腫瘤進展中的作用及其可能機制[J].中華肝臟病雜志， 2021， 29（9）： 908-912.

李芳，陳翎，王亞榮.阿片類生長因子受體假基因1靶向miR-665對卵巢癌細胞增殖、侵襲和遷移的影響[J].中華生物醫(yī)學(xué)工程雜志， 2020， 26（6）： 508-514.

中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)外科分會腫瘤專業(yè)組.中國中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性膠質(zhì)瘤診斷和治療共識（簡化版）[J].中華醫(yī)學(xué)雜志， 2009， 89（43）： 3028-3030.

孫燕，周際昌.臨床腫瘤內(nèi)科手冊[M].3版.北京：人民衛(wèi)生出版社， 1996： 53-54.

尚偉，王琪. 2002年頭頸腫瘤的TNM分級分期總論[J].國外醫(yī)學(xué)耳鼻咽喉科學(xué)分冊， 2004， 28（1）： 59-60.

中國醫(yī)師協(xié)會腦膠質(zhì)瘤專業(yè)委員會，上海市抗癌協(xié)會神經(jīng)腫瘤分會.中國中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)瘤免疫和靶向治療專家共識（第二版）[J].中華醫(yī)學(xué)雜志， 2020， 100（43）： 3388-3396.

魏利娟，馬亞飛，陳小莉，等.布托啡諾通過調(diào)控miR-665表達對脂多糖致心肌細胞炎癥反應(yīng)及細胞凋亡的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志， 2022， 20（2）： 240-245.

宋穎韜，姜凌云，姜文茹. LINC00519通過miR-665/STAT3軸促進口腔鱗狀細胞癌進展[J].哈爾濱醫(yī)科大學(xué)學(xué)報， 2021， 55（4）： 376-381.

劉榮鳳，張玲玲，徐志宏，等. miR-665通過靶向調(diào)控LLGL促進小細胞肺癌生物學(xué)行為的研究[J].中國肺癌雜志， 2020， 23（4）： 223-232.

張正平，李坤正，吳彬杰，等.敗醬草水提物通過調(diào)控circ_0000936/miR-665抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖、遷移及侵襲[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)， 2024， 32（6）： 1017-1024.