芝麻熱脅迫響應基因SiHsfB-2b的克隆及表達特性分析

關鍵詞：芝麻；耐熱性；SiHsjB-2b基因；基因克?。欢勘磉_分析；亞細胞定位

芝麻（Sesamum indicum L．）起源于非洲熱帶地區(qū)，喜熱，耐干旱耐瘠薄，是重要的優(yōu)質油料作物。然而在實際生產中，現(xiàn)有芝麻品種對極端高溫環(huán)境較為敏感，在持續(xù)性高溫條件下，落蕾、落花、落蒴嚴重，最終致使產量大幅度降低。尤其近年來隨著全球氣候不斷變暖，我國黃淮等產區(qū)極端高溫災害性天氣頻發(fā)，高溫熱害已成為制約芝麻生產可持續(xù)發(fā)展的重要因素之一。因此，深入開展芝麻耐高溫調控的分子機制研究，克隆調控芝麻耐熱性相關基因，系統(tǒng)闡明芝麻耐高溫遺傳機制和開展分子輔助育種，對推進芝麻抗逆遺傳改良和高效生產具有極其重要的意義。

多項研究報道，熱脅迫誘導作物產生大量熱休克蛋白，并誘導參與次生代謝物合成的相關基因表達。熱休克蛋白的產生及次生代謝物合成基因的表達均受轉錄因子調控。截至目前，一些響應逆境脅迫的轉錄因子，如HSF、MYB、WRKY、AP2等，已被證實參與作物響應熱脅迫的重要過程。熱激轉錄因子（HSFs）是作物耐熱機制中最重要的一類轉錄因子，是熱激信號傳遞途徑中非常重要的參與者，可誘導熱激蛋白產生，進而提升作物對高溫的耐受性。目前已在水稻、大豆、小麥、玉米、煙草、擬南芥中發(fā)現(xiàn)了數(shù)十個響應高溫脅迫的HSFs。HSFs在結構上具有相似性，主要包含5大結構域，根據(jù)結構域的獨特性，可將HSFs家族分為A、B、C三類，其中，研究較為清楚的A類HSFs是熱脅迫主要調節(jié)因子，可誘導抗逆基因表達；B類HSFs相關研究報道較少，由于缺少C端轉錄激活結構域（CTAD），前期研究認為B類HSFs負調控作物耐熱性，抑制熱響應基因的表達，但近幾年的研究發(fā)現(xiàn)其屬于熱誘導型，熱脅迫下可誘導耐熱基因的轉錄表達，從而在植物耐熱性防御方面發(fā)揮重要的作用。如對擬南芥幼苗的熱激和恢復試驗證實，B類HSFB2b基因是植物獲得耐熱性所必需的：在擬南芥中過表達鷹嘴豆OsllsfB2b能夠顯著提高其耐熱性。

目前，關于芝麻HSFs的研究尚未見報道，對其家族基因及個體特性和功能了解甚少。我們前期通過轉錄組學測序篩選鑒定出在熱脅迫下高豐度表達的基因SIN_1015574，編碼B類HsfB-2b蛋白。在此基礎上，本研究從白芝麻材料中克隆獲得SillsfB-2b基因，采用生物信息學方法對該基因的結構及其編碼蛋白的氨基酸序列、同源比對和基本理化性質進行分析，同時分析其在熱脅迫響應過程中的組織表達特異性，并對其進行亞細胞定位，以期為進一步解析SillsfB-2b的生物學功能及作用機制提供理論依據(jù)，也為芝麻耐熱性遺傳改良挖掘優(yōu)異基因資源。

1材料與方法

1.1試驗材料

試驗選用鄭太芝3號白芝麻品種，種子由河南省農業(yè)科學院芝麻研究中心提供。試驗于2022年8月-2023年5月在河南省農業(yè)科學院芝麻研究中心人工氣候箱中進行。選取籽粒飽滿、大小均一的種子，采用1%次氯酸鈉溶液浸泡15min后，用純凈水反復沖洗干凈，播種在塑料盆（直徑16cm，高度14cm）中，所用培養(yǎng)基質為營養(yǎng)土和珍珠巖（配比為3：1）的混合物，放置于人工氣候箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：光周期為14h光照/10h黑暗，光強為350umol/（m2·s），溫度設置為30℃，相對濕度為70%。

1.2熱脅迫處理

待芝麻幼苗長至2對真葉時，選取長勢一致的植株，置于恒溫培養(yǎng)箱中，在41℃高溫條件下進行熱脅迫處理，其他培養(yǎng)條件不變。分別在處理0、2、4、6、8d后采集根、莖和葉片樣品，在液氮中速凍后保存于-80 0C超低溫冰箱中，備用。

1.3SiHsfB-2b基因克隆

以芝麻幼苗組織混合樣品為試驗材料，采用CTAB法提取基因組DNA;根據(jù)前期研究鑒定到的SIN_1015574基因，通過NCBI網站獲得該基因序列，利用DNAMAN6.0軟件，設計特異性克隆引物（F：5'-CCGTAGTCCTTCGGACACCT-3';R：5'-GGCGTTAGTAATGGGAATTGTG-3'），并用高保真酶Pyrobest（TaKaRa，上海）進行PCR擴增。反應體系：Pyrobest DNA Polymerase 0.25uL，10×Pyrobest BufferⅡ5uL，F(xiàn)、R引物各2uL，DNA 1uL， dNTP Mixture（2.5mmol/L）4uL， ddH2035.75uL。反應程序：98℃預變性10min;98℃10s，59℃ 30s，72℃2min，30個循環(huán)；72℃完全延伸5min。利用膠回收試劑盒（莊盟，北京）回收目的片段，將回收產物利用pEasy-Blunt Sim-ple Cloning試劑盒（TransGen Biotech）連接T載體后，由生工生物工程（上海）有限公司測序。

1.4 SiHsfB-2b基因生物信息學分析

通過NCBI網站獲得SiHsfB-2b基因的編碼區(qū)、外顯子和內含子序列，利用GSDS軟件（ht-tp：//gsds.gao-lab.org/）分析SiHsfB-2b基因結構；使用ProtParam對SiHsfB-2b蛋白的理化性質進行分析，利用SMART軟件預測其功能結構域：使用DNAMAN6.0軟件進行氨基酸序列比對分析，利用MEGA5.1軟件構建13個物種的HsfB-2b氨基酸序列系統(tǒng)進化樹，重復計算次數(shù)設為1000次；使用Phytozome13網站獲得SiHsfB-2b基因起始密碼子ATG上游2000bp區(qū)域堿基序列，利用PlantCARE（http//bioinforrnatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對其啟動子區(qū)域結合元件進行分析。

1.5RT-qPCR分析

熱脅迫處理不同時間的芝麻根、莖、葉樣品，用RNArose Reagent Systems試劑盒（上海華舜生物工程公司，上海）提取RNA，然后使用HiScriptⅡlst Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）試劑盒（Vazyme，南京）合成cDNA第一鏈；SillsfB -26的轉錄水平用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）法測定，使用AceQ Universal SYBR qPCR MasterMix熒光定量試劑盒（Vazyme，南京）進行檢測，使用ABI ONE STEP PCR System進行熒光定量分析。設計SiHsfB-2b的RT-qPCR特異引物（F：5'-TTCTCCAGTTTTGTTCGTCAAC-3'：R：5'-CTCGCCTCTTCTAAAACAATCG-3'），以及內參基因SiTUB的引物（F：5'-GCACACGTGCTTTG-CAGATAAG-3'; R：5'-GCCCTCAAGCTCAAC-CATAACT-3'）。反應體系和反應程序見說明書。采用2法計算基因的相對表達量。每組試驗至少進行3個獨立的生物學重復。

1.6SiHsfB-2b的亞細胞定位分析

采用同源重組的方法，使用植物雙元表達載體pcambia1302-GFP進行SillsfB-2b重組載體構建。設計組裝引物GFP-HSF-F（caaatcgactctag-aaagcttATGAGCGGCGAAGGCACA）和GFP-HSF-R（gcccttgctcaccatggtaccTTTATCAAGCCTAGGAGG-TTCCTC）。使用上海東洋紡KOD One PCR Mas-ter Mix進行SiHsfB-2b的合成；使用Hieff CloneUniversaiⅡOne Step Cloning Kit（翊圣，上海）進行同源重組；使用大腸桿菌DH5ca感受態(tài)（擎科，北京）進行重組產物的轉化并測序，將測序正確的菌體在-80℃保存。

將含有重組載體35S：SiHsfB-2b-GFP的大腸桿菌進行擴大培養(yǎng)，37℃、220r/min培養(yǎng)至OD600值于1左右，使用無內毒素質粒大提試劑盒（天根，北京）提取質粒，最終質粒的濃度至少為1ug/uL。將35S：Maker-mCherry質粒作為細胞核標記物共轉移到玉米原生質體中，空的35S：GFP質粒作為細胞內靶向對照。培養(yǎng)一定時間后，在共聚焦激光掃描顯微鏡（尼康C2-ER，日本）下觀察轉化后的原生質體。GFP用488nm的激光激發(fā)，并在525nm處進行監(jiān)測；mCherry用561nm激光激發(fā)，用580nm長通濾波器監(jiān)測。

2結果與分析

2.1SiHsfB-2b基因克隆及編碼蛋白理化性質分析

以芝麻幼苗根、莖、葉的混合樣提取基因組DNA，根據(jù)公布的芝麻基因組序列，設計SiHsfB-26同源克隆引物，擴增獲得SiHsfB-2b基因，經測序鑒定，擴增序列與公布的序列完全一致。SiHs-fB-2b基因序列全長為3090bp（圖1），含有2個外顯子和2個內含子，CDS序列為936bp，編碼311個氨基酸，編碼蛋白分子量為34.27kDa，等電點為6.08，為酸性蛋白。SiHsfB-2b蛋白序列包含一個保守的HSF類DNA結合域（HSF-typeDNA-binding domain）（圖2），可以特異性地結合熱休克蛋白啟動子，但無核定位信號序列（NLS）。

2.2SiHsfB-2b同源比對和進化樹分析

為明確SiHsfB-2b的親緣關系．利用SiHsfB-2b蛋白氨基酸序列查詢擬南芥、咖啡和煙草等植物的同源蛋白，獲得與其親緣關系較近的蛋白，包括擬南芥的HsfB-2b（Q9TOD3）、煙草的HsfB-2b（AOAIS3XXH5）、山豆麻屬的Hsf（AOA2P5CBB9）等13種同源蛋白，利用MEGA5.1軟件構建系統(tǒng)進化樹（圖3），可以看出，與SiHsfB-2b同源關系最近的是松蒿的HsfB-2b（AOA830CUN7）和獨腳金的HsfB-2b（AOA5A7PCT3），其次為銹鱗木樨欖的HsfB-2b（AOA8SOQHL8）。為鑒定SiHsfB-2b與其同源蛋白的相似性，將SiHsfB-2b與其同源關系較近的蛋白進行氨基酸序列比對分析，結果如圖4所示，SiHsfB-2b與煙草的HsfB-2b（AOAIS3XXH5）、山豆麻屬的Hsf（AOA2P5CBB9）、獨腳金的HsfB-2b（AOA5A7PCT3）、咖啡屬的HsfB-2b-like（AOA6P6TPE8）、銹鱗木樨欖的HsfB-2b（AOA8 SOQHL8）和松蒿的HsfB-2b（AOA830CUN7）的相似性系數(shù)分別為56.21%、60.79%、61.49%、60.68%、59.55%、63.23%。

2.3Si%sfB-2b啟動子順式作用元件分析

為了探究Si%sfB-2b基因潛在的生物學功能，對其啟動子區(qū)域順式作用元件進行分析，共發(fā)現(xiàn)13類元件（表1），包括與脅迫、光、激素響應相關的元件以及植物生長發(fā)育相關元件，其中與脅迫響應和激素響應相關的元件各有3類，分別為MYC、ARE、STRE和TGACG-motif、ERE、CGTCA-motif。

2.4熱脅迫下SiHsfB-2b在芝麻不同器官中的表達模式分析

利用RT-qPCR分析熱脅迫下SiHsfB-2b基因在芝麻不同器官中的表達模式，結果如圖5所示。熱脅迫可誘導SiHsfB-26基因在芝麻根、莖和葉中上調表達。隨著脅迫時間的延長，莖和葉中的相對表達量整體呈現(xiàn)逐漸增加趨勢，均在脅迫第8天達到最高值，分別為處理0d的1.66倍和13.88倍：而在根中，該基因的相對表達量隨著脅迫時間的延長呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，在脅迫處理第4天達到峰值，為處理0d時的2.23倍。

2.5SiHsfB-2b的亞細胞定位分析

為了確定SiHsfB-2b的亞細胞位點，首先利用數(shù)據(jù)庫獲得SiHsfB-2b的CDS序列，設計特異性引物，利用高保真酶進行全長序列的擴增，經測序發(fā)現(xiàn)無突變后，利用同源重組的方法構建35S：SiHsfB-2b-GFP載體，利用PEG介導的玉米原生質體的瞬日寸轉化體系和PEG-Ca的轉化方法，將重組載體瞬時轉入玉米原生質體中，在黑暗、室溫條件下培養(yǎng)16h后，通過激光共聚焦顯微鏡（尼康C2-ER，日本）進行觀察，以偶聯(lián)mCherry熒光蛋白的已知位于細胞核的擬南芥蛋白IMP4作為對照（Marker-mCherry）o結果如圖6所示，SiHs-fB-2b的GFP熒光與Maker-mCherry的位置重合，表明SiHsfB-2b蛋白位于細胞核中。

3討論

高溫熱害是近年來世界各地多發(fā)的自然災害之一，能夠引起植株萎蔫、落花落果和生殖系統(tǒng)發(fā)育異常等，顯著抑制植物的生長發(fā)育，進而影響產量和品質。關于植物耐熱性的分子機制研究中，轉錄因子在基因表達調控中扮演重要角色，其中HSFs是植物基因在轉錄水平上響應熱脅迫的中心調控因子，在植物熱脅迫應激響應中起著關鍵性的作用。

HSFs廣泛存在于所有真核生物中，已發(fā)現(xiàn)在擬南芥、小麥、水稻和大豆等多種植物中存在著大量HSFs。由于A類HSFs存在AHA（轉錄激活結構域）．能在響應熱脅迫時激活下游耐熱相關基因，目前的研究報道主要集中于該類HS-Fs，而有關B類和C類HSFs的研究報道卻相對較少。本研究在前期通過轉錄組測序發(fā)現(xiàn)SiHsfB-26受高溫脅迫顯著誘導的基礎上，從芝麻根、莖和葉的混合樣品中克隆獲得SiHsfB-2b基因，該基因序列長3090bp，CDS序列為936bp，編碼311個氨基酸殘基。結構分析表明SiHsfB-2b蛋白含有保守的N端DNA結合域（HSF-type DNA-binding domain），進一步通過對不同物種HsfB-2b蛋白序列同源性比對和進化樹分析顯示，SiHsfB-2b與松蒿屬的HsfB-2b蛋白同源性最高，與獨腳金、咖啡屬和山豆麻屬等的同源性也比較高，表明不同物種間HsfB-2b蛋白非常相似，推測其在不同物種中可能具有相似的功能。

順勢作用元件是一類能被特定轉錄因子識別和結合、參與調控基因特異性表達的DNA序列，包含熱激應答元件、激素應答元件等，在植物非生物脅迫響應中扮演著重要角色。本研究通過對SiHsfB-2b基因啟動子上游2000bp區(qū)域的順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，該基因啟動子區(qū)包含多個與芝麻逆境脅迫響應、激素信號轉導、光反應以及植物生長發(fā)育識別有關的位點，推測該基因可能通過這些作用元件參與芝麻對熱脅迫信號的響應，在芝麻耐熱過程中發(fā)揮作用。前人研究也表明，B類HSFs轉錄表達受到茉莉酸和水楊酸調控，在植物熱脅迫響應過程中發(fā)揮重要作用。

亞細胞定位分析發(fā)現(xiàn)，SiHsfB-2b定位在細胞核上，這與大多數(shù)B類HSFs的定位結果一致，例如有研究報道擬南芥的AtHsfB-2b定位于細胞核中。轉錄因子進入細胞核大多借助核定位信號，然而本研究對SiHsfB-2b基因進行保守結構域分析發(fā)現(xiàn)該基因無核定位信號序列（NLS），因此我們推測SiHsfB-2b可能與具有NLS的蛋白存在互作，輔助其進入細胞核，具體還需后續(xù)進一步研究。

早期研究認為，在正常生長條件下．B類熱激轉錄因子可抑制耐熱基因的轉錄表達，如抑制HsfA2和HsfA7a的表達。隨著研究的深入，較多研究發(fā)現(xiàn)B類HSF家族基因受熱等逆境脅迫誘導表達，通過與某些性性較弱的A類HSFs協(xié)同作用，參與植株脅迫響應及生長發(fā)育過程，如HsfB1和HSFB2b在調控擬南芥獲得性耐熱方面是必不可少的。前人研究表明，在擬南芥中，37℃高溫能夠顯著誘導HSFB2a和HSFB2b的轉錄表達：過表達HSFs B2亞家族的基因TaHSF3可明顯提高轉基因擬南芥對42℃極端高溫的耐受性，而且高溫、低溫和干旱等脅迫均可誘導該基因在麥穗等器官中上調表達。本研究結果也表明，高溫脅迫可誘導SiHsfB-2b基因在芝麻根、莖和葉中不同程度地上調表達，在葉中表達量較高，且在高溫脅迫后期被誘導大量表達。因此，我們推測SiHsfB-2b基因可能是熱激反應后期的關鍵調控因子，從而維持芝麻持久的耐熱性。

4結論

芝麻B族熱激轉錄因子SiHsfB-2b的基因序列全長為3090bp，CDS序列長936bp，編碼311個氨基酸殘基，蛋白質序列中含有DNA結合結構域。SiHsfB-2b與松蒿屬的AOA830CUN7蛋白相似性最高，相似性系數(shù)達63.23%。由啟動子區(qū)順式作用元件分析結果推測SillsfB-2b可能通過參與激素信號轉導和光反應響應熱脅迫。SiHsfB-26在芝麻根、莖、葉中受熱脅迫誘導上調表達，尤其在熱脅迫后期表達量顯著上升，推測其主要在芝麻熱脅迫響應中后期起重要調控作用。這些結果可為在分子水平研究芝麻耐熱機制及開展基因工程育種研究提供理論依據(jù)。