痤瘡患者外周血TLR—2、IL—4、IL—8、TNF—α表達水平與痤瘡嚴重程度相關性研究

劉波 胡友紅

[摘要]目的：檢測痤瘡患者外周血TLR-2、IL-4、IL-8、TNF-α的水平，并分析這些因素與痤瘡嚴重程度的相關性。方法：收集本院皮膚科門診收治的尋常性痤瘡患者90例，輕、中、重度患者各30例，另選擇30例健康者作為對照組。流式細胞儀檢測外周血CD14+單核細胞TLR-2表達，雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清IL-4、IL-8、TNF-α水平。結果：三組痤瘡患者TLR-2、IL-4、IL-8及TNF-α表達均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且均與痤瘡嚴重程度呈正相關（P<0.05）。結論：痤瘡患者外周血TLR-2、IL-4、IL-8、TNF-α的檢測可指導痤瘡嚴重程度的客觀評價和臨床治療。

[關鍵詞]痤瘡；TOLL樣受體；白介素-4；白介素-8；腫瘤壞死因子-α

[中圖分類號]R758.73+3 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2018）03-0111-03

The Correlation Study between the Expression of TLR-2， IL-4， IL-8， TNF-α and the Severity of Acne in Acne Patients

LIU Bo1，2，HU You-hong2

（1.The Basic Medical School of Wuhan University，Wuhan 430071，Hubei，China；2.Department of Dermatology，Xiaogan Central Hospital，Xiaogan Hospital Affiliated to Wuhan University of Science and Technology，Xiaogan 432000，Hubei，China）

Abstract： Objective To explore the role of TLR-2， IL-4， IL-8 and TNF-α in the pathogenesis of acne vulgaris， and analyze the correlation between these factors and the severity of the clinical manifestations of acne. Methods Venous blood was collected from 30 human controls and 90 patients with acne vulgaris， the patients were divided into three groups， mild， moderate and severe group. TLR-2 expression of CD14+ monocyte in peripheral blood of flow cytometry and the level of IL-4， IL-8 and TNF-α in serum by double antibody enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）. Results The expression of TLR-2， IL-4， IL-8 and TNF-α in three groups of acne patients were all higher than those of the control group， and the difference were statistically significant（P<0.05）. And which was positively correlated with the severity of acne（P<0.05）. Conclusion The detection of TLR-2， IL-4， IL-8 and TNF-α in the peripheral blood of acne patients can guide the objective evaluation and clinical treatment of the severity of acne.

Key words： acne vulgaris； Toll-like receptors； IL-4； IL-8； Tumor necrosis factor-α

痤瘡的發(fā)病機制主要包括：皮膚毛囊皮脂腺導管角化異常，微生物的感染尤其丙酸痤瘡桿菌定植，以及免疫學因素[1]。痤瘡丙酸桿菌的定植可誘導機體一系列免疫反應，但其具體應答機制尚未明確，近年來研究發(fā)現(xiàn)[2]，天然免疫是痤瘡粉刺的形成，繼發(fā)性炎癥的起始和加重因素，病原相關分子模式（pathogen-associated molecular pattern，PAMP）及其模式識別受體是天然免疫重要機制之一。痤瘡丙酸桿菌可通過Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）依賴途經(jīng)激活單核細胞，從而釋放白介素等細胞因子引起炎癥。研究發(fā)現(xiàn)[3-4]痤瘡患者外周血單核細胞TLR-2的表達上調(diào)，及其與IL-8和TNF-α等炎性因子相關。同時，大量研究表明[5]，特異性免疫應答也參與痤瘡的發(fā)生和發(fā)展過程，并存在免疫應答異常，表現(xiàn)為Th2細胞介導占主導地位，IL-4為Th2細胞釋放的重要炎性因子。本次聯(lián)合檢測痤瘡患者TLR-2以及炎性因子IL-4、IL-8、TNF-α的表達水平，并分析這些因素與不同臨床程度痤瘡的相關性，現(xiàn)報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料：參考趙辨主編的《中國臨床皮膚病學》尋常性痤瘡診斷標準，收集2017年3月-2017年10月本院皮膚科門診收治的尋常性痤瘡患者90例，其中男42例，女48例；年齡15～39歲，平均（18.23±5.65）歲；病程3個月～22年，平均（3.58±1.24）年。參照Pillsbury分類法，根據(jù)患者皮損數(shù)目痤瘡分Ⅰ～Ⅳ級，Ⅰ級為輕度組，Ⅱ～Ⅲ級為中度組，Ⅳ級為重度組。輕度組（Ⅰ級）30例，男19例，女11例，年齡（17.46±4.25）歲，病程（3.04±1.11）年；中度組（Ⅱ～Ⅲ級）30例，男12例，女18例，年齡（18.27±5.44）歲，病程（2.89±1.04）年；重度組（Ⅳ級）30例，男11例，女19例，年齡（19.44±5.24）歲，病程（3.20±1.09）年。另外，同期隨機選擇本院體檢中心健康志愿者30例為對照組，其中男18例，女12例，年齡（18.11±4.33）歲。各組性別、年齡等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。本試驗進行前經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準并備案，所有參試者均為自愿參與，且事前均被告知研究事項并簽署知情同意書。

1.2 納入標準：①男女不限，自愿參加者；②無自身免疫性疾病者；③近1個月內(nèi)系統(tǒng)及局部未使用維A酸類、糖皮質(zhì)激素等藥物者；④非藥物性、職業(yè)性及經(jīng)期前痤瘡者。

1.3 方法

1.3.1 儀器和試劑：FACSCAL-IBUR流式細胞儀（美國BD公司）；FITC熒光素標記小鼠抗人CD14抗體，藻紅蛋白（PE）標記小鼠抗人TLR2抗體及同型對照鼠抗人IgG抗體，1×紅細胞裂解液，均購自eBioscience公司；血清IL-4、IL-8、TNF-α檢測試劑盒均購自上海信裕生物科技有限公司。

1.3.2 標本采集及處理：所有參試者均晨間空腹采集肘靜脈血5ml，其中3ml全血置于肝素抗凝管中，4℃冰箱保存，待流式細胞儀檢測；另2ml置于消毒試管中，低溫離心15min（2 500r/min），吸取上清液分裝于Eppendorf管中，置-20℃冰箱保存待檢。

1.3.3 流式細胞儀檢測外周血CD14+單核細胞TLR-2表達：每份參試者標本各取3支樣品測定管，依次加入相應抗體CDl4-FITC，IgG1-FITC/IgG2a-PE，CDl4-FITC/TLR2-FITC 20μl，然后在每管中加入該份參試者抗凝血100μl，振蕩混勻，室溫避光孵育20mim后加入2ml溶血素，振蕩混勻，室溫避光5min，然后1 000r/min離心5min，棄去上清液后加PBS 2ml，再1 000r/min離心5min后棄上清液；加入PBS 300μl混勻，上機檢測，同時設不加標記抗體的陰性對照管。上機前以標準熒光微球調(diào)整儀器的變異系數(shù)并穩(wěn)定在2%以內(nèi)，上機收集10 000個細胞/管，熒光強度以對數(shù)放大，光散射數(shù)據(jù)存盤，測試完成后用CellQuest軟件檢測，以CD14及TLR-2抗體染色雙陽性細胞百分率記錄結果。

1.3.4 血清IL-4、IL-8、TNF-α的檢測：均采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），操作步驟嚴格按照試劑盒說明進行。

1.4 統(tǒng)計學分析：所有數(shù)據(jù)用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件包進行分析。實驗測定計量資料數(shù)用（x?±s）表示，組間比較行t檢驗，方差不齊，選用近似t檢驗。TLR-2及IL-4、IL-8、TNF-α表達水平與痤瘡嚴重程度分級相關采用Spearman分析，用直線相關分析法處理指標間關系。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 外周血CD14+單核細胞TLR-2表達的檢測結果：輕、中、重度痤瘡患者外周血中的TLR-2表達水平明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；90例痤瘡患者TLR-2表達水平與痤瘡嚴重程度呈正相關（r=0.485，P<0.05）。見表1。

2.2 血清IL-4、IL-8、TNF-α檢測結果：輕、中、重度痤瘡患者外周血中的IL-4、IL-8、TNF-α水平均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。90例痤瘡患者IL-4、IL-8、TNF-α的表達水平與輕、中、重度痤瘡相關性呈正相（r=0.489，P<0.05；r=0.424，P<0.05；r=0.432，P<0.05）。見表1。

3 討論

痤瘡好發(fā)于顏面部、胸背部等皮脂腺分布密集的區(qū)域，是一種多因素疾病，其主要病因為皮脂過多分泌、毛囊皮脂腺導管堵塞、細菌感染和炎癥，大量皮脂的分泌和排出障礙易繼發(fā)細菌感染，最常見和最重要的是痤瘡丙酸桿菌的感染。痤瘡丙酸桿菌，為人類皮膚共生菌之一，分布于皮脂分泌旺盛的區(qū)域，丙酸桿菌繁殖后激活炎癥反應，為痤瘡粉刺、炎性丘疹的起始或加重環(huán)節(jié)，但其激活炎癥反應機制尚未完全闡明[6]。

在病原體入侵時，通過病原相關模式分子（pathogen associated molecular patterns， PAMP）與固有免疫細胞其表面的或者胞質(zhì)中的模式識別受體（pattern recognition receptor， PRR）識別，相互結合后即可迅速激活效應細胞，一并啟動下游一系列免疫反應，觸發(fā)機體的固有免疫[7]。TLR為重要的一類PRR，在生物界廣泛表達，是天然免疫中抗感染免疫重要機制之一，痤瘡丙酸桿菌的PAMP可識別角質(zhì)形成細胞和皮脂腺細胞表達的TLR-2等受體，觸發(fā)天然免疫，刺激角質(zhì)形成細胞產(chǎn)生一系列炎性因子[8-9]。房晶晶等[2]應用流式細胞術檢測到痤瘡患者外周血CD14+單核細胞TLR-2的表達增強，痤瘡外周血CD14+單核細胞TLR-2經(jīng)異維A酸[10]、強脈沖光聯(lián)合甲硝唑[11]、中藥面膜驗方[12]等治療后，表達可下調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)，痤瘡患者外周血CD14+單核細胞TLR-2的表達上調(diào)，并且與痤瘡的嚴重程度呈正相關。

早期痤瘡患者外周血單核細胞TLR-2等受體識別病原菌后，激活NF-κB信號通路，啟動IL-8、TNF-α表達，直接介導炎癥反應，并且在局部招募多種炎癥細胞并促進其他炎癥介質(zhì)的釋放、造成炎癥反應的級聯(lián)激活[13]。隨著病情的持續(xù)發(fā)展，炎性因子釋放和聚集可加重痤瘡的炎性反應，甚至促進新的痤瘡樣皮損形成[14]。同時，由于痤瘡患者存在以Th2細胞介導占主導地位的免疫應答異常，Th2細胞釋放大量IL-4等因子促進B細胞介導的體液免疫。在痤瘡早期患者中丙酸桿菌細胞壁糖類以產(chǎn)生不能滲入毛囊為主的IgM抗體，當抗原持續(xù)存在時以產(chǎn)生能滲入毛囊并激活補體的IgG抗體為主，并進入毛囊皮脂腺參與痤瘡的病理過程。本次研究發(fā)現(xiàn)，痤瘡患者外周血TLR-2、IL-4、IL-8、TNF-α表達同時上升，與痤瘡的嚴重程度呈正相關。

總之，TLR-2表達上調(diào)，以及IL-4、IL-8、TNF-α炎癥因子局部或外周血增加，可能是痤瘡炎癥反應的分子途徑，通過檢測這些炎癥因子，可指導痤瘡炎癥反應程度的客觀評價，同時還能根據(jù)痤瘡患者的免疫應答狀態(tài)，及時在治療過程中采取相應措施控制痤瘡患者過度的免疫反應，減少因炎性因子過度釋放引起的后遺癥和病理改變，以利于提高臨床治療效果和改善患者生活質(zhì)量。但輕、中以及重度各級別痤瘡的以上炎癥因子的具體標準范圍，仍需進一步觀察和研究。

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[收稿日期]2017-12-21 [修回日期]2018-02-02

編輯/朱婉蓉