雞傳染性法氏囊病毒接種雞胚成纖維細(xì)胞工藝優(yōu)化

摘 要：雞傳染性法氏囊病是一種急性、高度接觸性傳染病，主要侵害幼齡雞。傳染性法氏囊病滅活疫苗通常采用強(qiáng)毒接種雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）進(jìn)行病毒的培養(yǎng)。本試驗(yàn)采用細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)CEF方法接種病毒對(duì)轉(zhuǎn)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞接種密度、種毒接種量及收獲病毒時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，篩選出傳染性法氏囊病毒培養(yǎng)的最佳工藝參數(shù)（轉(zhuǎn)瓶），為擴(kuò)大生產(chǎn)穩(wěn)定的雞傳染性法氏囊病滅活疫苗奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：雞傳染性法氏囊病毒；雞胚成纖維細(xì)胞；工藝優(yōu)化

中圖分類號(hào)：S858.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：1673-1085（2024）07-0031-04

傳染性法氏囊病（IBD）是一種急性、高度接觸性傳染病，主要侵害幼齡雞。本病主要水平傳播，突然發(fā)生，傳播迅速。2周齡以內(nèi)的幼雞感染后，能引起嚴(yán)重的免疫抑制，常誘發(fā)繼發(fā)感染。近年來(lái)流行的雞傳染性法氏囊病，超強(qiáng)病毒株致死率高達(dá)70%左右，給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)重大經(jīng)濟(jì)損失[1]。

滅活疫苗具有良好的安全性，選擇當(dāng)?shù)亓餍卸局昕梢愿玫仡A(yù)防本地流行的雞傳染性法氏囊病[2]。目前，制備雞傳染性法氏囊病滅活疫苗的毒株通常為弱毒株或強(qiáng)毒株，采用雞胚、CEF或傳代細(xì)胞系（DF?1等）進(jìn)行病毒培養(yǎng)，收獲的病毒滅活后，與一定比例的佐劑混合制備成滅活疫苗[3-4]。實(shí)際生產(chǎn)中，細(xì)胞工藝需要使用大量的SPF雞胚，費(fèi)用較高。為降低疫苗成本，現(xiàn)對(duì)傳染性法氏囊病毒（IBDV）生產(chǎn)工藝進(jìn)行優(yōu)化，以提高病毒含量。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)接種細(xì)胞密度、接種劑量和病毒收獲時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，篩選出制備IBDV的最佳生產(chǎn)工藝，不僅節(jié)約了生產(chǎn)成本，還提高了IBDV的病毒含量。

1 "材料與方法

1.1 "材料

M199、胰酶，購(gòu)于Gibco公司；青鏈霉素，購(gòu)于魯抗公司；新生牛血清，購(gòu)于內(nèi)蒙古奧普賽；一次性塑料細(xì)胞培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶，購(gòu)自BIOFIL公司；SPF雞胚，購(gòu)自勃林格；種毒IBDV-B株F5代，山東博瑞科生物技術(shù)有限公司分離鑒定。

1.2 "方法

1.2.1 "雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）的制備[5] "選擇10～11日齡發(fā)育良好的SPF雞胚，蛋殼外表面碘伏噴灑消毒，然后75%酒精進(jìn)行脫碘消毒，彎頭鑷子挑破氣室內(nèi)膜，無(wú)菌取出雞胚，置于盛有PBS溶液的平皿中，仔細(xì)去除頭部和內(nèi)臟，將胚體移入100 mL小燒杯中，加適量PBS，洗滌胚體2次，盡量去除血細(xì)胞，棄去上清液。大剪刀將胚體剪成米粒大?。s1～2 mm）的均勻組織塊， PBS溶液沖洗胚體2次后，將剪碎的組織塊轉(zhuǎn)移至250 mL三角瓶中，加入0.25%胰酶溶液（約10 mL/胚），置37 ℃水浴中消化30 min，每5 min搖一次。取出三角燒瓶，棄去上清胰酶溶液，直接加PBS溶液洗滌消化后的組織塊2次，每次洗滌后均棄去上清液，保留剪碎后的組織塊。三角燒瓶中加入適量細(xì)胞生長(zhǎng)液終止消化，反復(fù)吹打數(shù)次， 12層紗布濾過(guò)；再用適量生長(zhǎng)液重懸，反復(fù)吹打數(shù)次，紗布過(guò)濾，混勻細(xì)胞懸液，取細(xì)胞液200 L，細(xì)胞計(jì)數(shù)。按細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果，進(jìn)行適當(dāng)倍數(shù)的稀釋。

1.2.2 "最佳接種細(xì)胞密度的優(yōu)化 "見(jiàn)表1將制備的原代雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）分別按150萬(wàn)、200萬(wàn)、250萬(wàn)/mL分別接種1 000 mL細(xì)胞轉(zhuǎn)瓶，每瓶接種150 mL細(xì)胞液，24 h后長(zhǎng)成單層。病毒做1 000倍稀釋后，接種種毒IBDV-B株病毒液9 mL（接毒比例為細(xì)胞培養(yǎng)液的6%）。37 ℃，繼續(xù)培養(yǎng)72～96 h，每天觀察細(xì)胞病變，待細(xì)胞病變達(dá)80%以上時(shí)收獲病毒液。將收獲的病毒液-20 ℃保存，并反復(fù)凍融3次，離心取上清液，檢測(cè)TCID50。

1.2.3 "最佳種毒接種量的優(yōu)化 "見(jiàn)表2制備的原代雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）按照200萬(wàn)/mL的接種密度分別接種3個(gè)轉(zhuǎn)瓶，每瓶接種150 mL細(xì)胞液，24 h后，長(zhǎng)成單層。毒種做1 000稀釋后，分別接種IBDV-B株病毒液9 mL（6%）、12 mL（8%）和15 mL（10%）。37 ℃，繼續(xù)培養(yǎng)72～96 h，每天觀察細(xì)胞病變，待細(xì)胞病變達(dá)80%以上時(shí)收獲病毒液。-20 ℃反復(fù)凍融3次，離心取上清液，檢測(cè)TCID50。

1.2.4 "最佳收獲時(shí)間的優(yōu)化 "見(jiàn)表3制備的原代雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）按200萬(wàn)/mL分別接種3個(gè)轉(zhuǎn)瓶，每瓶接種150 mL細(xì)胞液，24 h后，長(zhǎng)成單層。接種IBDV-B株病毒液，1000倍稀釋后，接種比例8%，每瓶接種12 mL病毒液。37 ℃，繼續(xù)培養(yǎng)48h 、60 h和72 h，收獲病毒液。-20 ℃反復(fù)凍融3次，離心取上清液，檢測(cè)TCID50。

2 "結(jié)果

2.1 "雞胚成纖維細(xì)胞制備

共制備原代雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）1 000 mL，細(xì)胞密度為1 000萬(wàn)/mL。

2.2 "最佳接種細(xì)胞密度的優(yōu)化

接種細(xì)胞密度分別為每毫升150萬(wàn)、200萬(wàn)、250萬(wàn)，種毒IBDV-B株接種3個(gè)轉(zhuǎn)瓶，培養(yǎng)72 h，病變達(dá)80%以上收獲。3瓶病毒液無(wú)菌檢驗(yàn)均符合標(biāo)準(zhǔn)，TCID50測(cè)定結(jié)果分別為105.78、106.5、106.17，結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可見(jiàn)，不是細(xì)胞密度越密越好，過(guò)高的細(xì)胞密度，除了需要接種更多的毒種之外，也可能會(huì)產(chǎn)生細(xì)胞高密度效應(yīng)反而抑制病毒生長(zhǎng)[6]，因此需要根據(jù)毒種的效價(jià)及收獲時(shí)間優(yōu)化適宜的細(xì)胞接種密度。本次試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳接種細(xì)胞密度是200萬(wàn)/mL。

2.3 "最佳種毒接種量的優(yōu)化

制備雞胚成纖維細(xì)胞液450 mL，細(xì)胞接種密度為200萬(wàn)/mL，150 mL/瓶，分裝3個(gè)轉(zhuǎn)瓶。種毒IBDV-B株接種3個(gè)轉(zhuǎn)瓶，接毒劑量分別為9、12 、15 mL，培養(yǎng)72 h，病變達(dá)80%以上收獲。3瓶病毒液無(wú)菌檢驗(yàn)均符合標(biāo)準(zhǔn)，TCID50測(cè)定結(jié)果分別為106.32、106.63、106.17，結(jié)果見(jiàn)表5。

由表5可知，不同的種毒接種量對(duì)細(xì)胞病變的產(chǎn)生有直接影響[7]。當(dāng)接毒量較小時(shí)，病毒達(dá)到繁殖高峰的時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞整體狀態(tài)下降，反而不利于病毒增殖，很難出現(xiàn)高毒價(jià)。接毒量大了，細(xì)胞病變時(shí)間提前，病毒增殖快，細(xì)胞圓縮脫落，待收獲時(shí)，病毒死亡較多，所以毒價(jià)較低[8]。本次試驗(yàn)結(jié)果表明，IBDV的最佳種毒接種量是將毒種1 000倍稀釋后，按培養(yǎng)液8%的劑量接種到雞胚成纖維細(xì)胞上。

2.4 "最佳收獲時(shí)間的優(yōu)化

制備雞胚成纖維細(xì)胞液450 mL，細(xì)胞接種密度為200萬(wàn)/mL，150 mL/瓶，分裝3個(gè)轉(zhuǎn)瓶。種毒IBDV-B株接種3個(gè)轉(zhuǎn)瓶，接毒劑量為12 mL，分別培養(yǎng)48 、72 h和96 h收獲。3瓶病毒液無(wú)菌檢驗(yàn)均符合標(biāo)準(zhǔn)，TCID50測(cè)定結(jié)果分別為106.17、106.83、105.83，結(jié)果見(jiàn)表6。

由表6的試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，種毒接種單層細(xì)胞48 h后產(chǎn)生明顯病變，細(xì)胞圓縮脫落；60 h時(shí)細(xì)胞達(dá)到80％以上病變，病毒效價(jià)最高；72 h時(shí)大量細(xì)胞從細(xì)胞瓶壁脫落，病毒感染后的細(xì)胞呈拉網(wǎng)狀，病毒效價(jià)下降迅速。上述試驗(yàn)結(jié)果與張振華等[7]報(bào)道的一致。

3 "結(jié)論

雞傳染性法氏囊病毒（IBDV）可在雞胚成纖維細(xì)胞上傳代擴(kuò)繁，本試驗(yàn)從接種細(xì)胞密度、種毒接種量和收獲時(shí)間3個(gè)方面進(jìn)行了工藝優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果顯示，種毒IBDV-B株接種雞胚成纖維細(xì)胞，轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的最佳生產(chǎn)工藝為接種細(xì)胞密度為200萬(wàn)/mL、接種量為毒種1 000倍稀釋后培養(yǎng)液的8%、收獲時(shí)間為60 h、細(xì)胞病變80%以上，收獲的病毒液中病毒含量最高。

參考文獻(xiàn)：

[1] " "夏業(yè)才， 陳光華，丁家波.獸醫(yī)生物制品學(xué) [M].2版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2018.

[2] " 張旭知，孫彩宜，徐少珠，等.雞傳染性法氏囊病疫苗的研究進(jìn)展[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技，2023（48）：28-29.

[3] "RAGE E，MARUSIC C，LICO C，et al. Current state-of-the-art in the use of plants for the production of recombinant vaccines against infectious bursal disease virus[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2020，104（6）：2287-2296.

[4] "MüLLER H，MUNDT E，ETERRADOSSI N，et al. Current status of vaccines against infectious bursal disease[J]. Avian Pathology，2012，41（2）：133-139.

[5] " 趙海棋，高慶芳，張澤愷，等.一種雞胚成纖維細(xì)胞快速制備與保存方法的研究[J].家禽科學(xué)，2023，45（11）：3-7+69.

[6] " Bock A， Schulze-Horsel J， Schwarzer J， et al. High-density microcarrier cell "cultures for influenza virus production[J]. Biotechnology Progress， 2011，27（1）：241-250.

[7] "錢建飛，陳溥言，蔡寶祥.馬立克氏病病毒和火雞皰疹病毒在雞胚細(xì)胞在培養(yǎng)上生長(zhǎng)特性的比較[J].病毒學(xué)報(bào)，1992（03）：257-262.

[8] "章振華，李林，景小冬，等.雞傳染性法氏囊病病毒BJQ902株在DF-1細(xì)胞系上增殖工藝研究[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2016，43（10）：2778-2779.