基于ITS序列的五味子DNA條形碼鑒定分析

摘要 基于五味子的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal transcribed spacer，ITS）條形碼序列，探討五味子藥材基源的鑒定方法，為該藥材來源的鑒別和規(guī)范栽培種植提供參考。本研究共收集16份五味子樣品，提取樣品基因組DNA，PCR擴(kuò)增ITS序列后雙向測(cè)序，所得序列經(jīng)SeqMan拼接后，采用MEGA11軟件對(duì)序列進(jìn)行分析比對(duì)，計(jì)算K2P遺傳距離，并利用鄰接（NJ）法建立系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，研究區(qū)16個(gè)樣本的ITS序列結(jié)構(gòu)差異較小，堿基序列相似，其中2份樣本出現(xiàn)1個(gè)變異位點(diǎn)；結(jié)合遺傳距離和NJ聚類樹結(jié)果可看出，五味子屬所有樣品聚為一支，其中研究區(qū)五味子樣本與來自GenBank的五味子聚為一支，南五味子屬作為外群單獨(dú)聚為一支，且分支具有很高的支持率，種內(nèi)差異不明顯，可與五味子屬近緣種區(qū)分開?；贗TS序列的DNA條形碼技術(shù)能夠?qū)ξ逦蹲蛹捌渫浦参镞M(jìn)行區(qū)分鑒別。

關(guān)鍵詞 五味子；ITS；DNA條形碼；系統(tǒng)發(fā)育分析；物種鑒定

中圖分類號(hào) S32" "文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 1007-7731（2024）11-0064-06

DNA barcoding analysis of Schisandra chinensis based on ITS sequences

MA Ziyu" " AN Xinghua" " XUE Jianing" " ZHAO Rong

（College of Pharmacy， Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Dalian 116600， China）

Abstract Based on the internal transcribed spacer （ITS） barcode sequences of Schisandra chinensis， this study explored the identification method of S. chinensis plants， providing reference for the identification and standardized cultivation of the source of this medicinal material. A total of 16 samples were collected in this study， and genomic DNA was extracted from the samples， followed by PCR amplification of the ITS sequence and bidirectional sequencing. After sequence assembly using SeqMan， the sequences were analyzed and aligned using MEGA11 software， K2P genetic distances were calculated， and a neighbor-joining （NJ） tree was constructed to establish the phylogenetic relationship. The results showed that the ITS sequences of the 16 samples in the study area had small structural differences and similar nucleotide sequences， with 1 variant site found in 2 samples; combining the genetic distances and NJ clustering tree results， all S. chinensis samples in the study area clustered together， forming a clade with the S. chinensis samples from GenBank， while the Kadsura samples formed an outgroup clade with a high support rate， with no clear differences within the species， allowing them to be distinguished from closely related species of Schisandra. DNA barcode technology based on the ITS sequence can differentiate and identify S. chinensis and its congeneric plants.

Keywords Schisandra chinensis; ITS; DNA barcode; phylogenetic analysis; species identification

木蘭科五味子屬植物五味子[Schisandra chinensis（Turcz.） Baill.]的干燥成熟果實(shí)為藥材五味子的基源之一，習(xí)稱“北五味子”，具有收斂固澀、益氣生津和補(bǔ)腎寧心等作用[1]。遼寧所產(chǎn)五味子油大、紫紅、肉厚、味濃和質(zhì)佳，習(xí)稱“遼五味”，主產(chǎn)于桓仁、寬甸和岫巖等地區(qū)[2]。刑楠楠等[3]考證表明，遼寧是五味子藥材的道地產(chǎn)區(qū)之一。劉璐璐等[4]研究表明遼寧所產(chǎn)的五味子的品質(zhì)較為上乘。華中五味子（S. sphenanthera Rehd. et Wils.）的干燥成熟果實(shí)是區(qū)別于五味子的另一種藥材。因其形態(tài)特征與北五味子較為相似，市場上部分被混作五味子藥材進(jìn)行銷售。而南、北五味子的五味子醇甲、五味子甲素等木質(zhì)素類成分，以及三萜、多糖和揮發(fā)油等主要有效成分含量差異較大[5]，故二者功效各異。因此，在五味子藥材栽培生產(chǎn)中，尋求合適的鑒定方法對(duì)確保五味子藥材質(zhì)量及資源的可持續(xù)發(fā)展至關(guān)重要[6]。

DNA條形碼技術(shù)可通過DNA片段，從分子層面對(duì)中藥材等進(jìn)行識(shí)別與鑒定[7]，因其便捷性、準(zhǔn)確性和通用性，成為中藥材鑒定的重要方法之一[8]。內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal eranscribed spacer，ITS）序列進(jìn)化速率較快，常被作為主體條形碼序列，用于藥材基源植物屬間、種間關(guān)系的研究。陳靚等[9]利用ITS2序列有效地區(qū)分了東北產(chǎn)區(qū)的五味子與非東北產(chǎn)區(qū)的華中五味子藥材。林鳳越等[10]以五味子種子為研究對(duì)象，通過ITS2序列對(duì)來自黑龍江等5個(gè)省份的南、北五味子種質(zhì)資源進(jìn)行了有效鑒別。李先寬等[11]應(yīng)用ITS2序列對(duì)遼寧地區(qū)栽培的白果五味子和不同產(chǎn)地的南五味子進(jìn)行了研究，指出白果五味子屬于五味子。郭豪杰等[12]以南五味子為研究對(duì)象，通過比較ITS2、ITS、matK、psbA-trnH和rbcL 5種序列，對(duì)來自多個(gè)省區(qū)的南、北五味子屬各6種植物分別進(jìn)行鑒定，指出ITS和psbA-trnH序列能較好地區(qū)分南五味子與同科多種植物，可作為該物種鑒定的優(yōu)選條碼。本試驗(yàn)以遼寧地區(qū)栽培的五味子品種為研究對(duì)象，選擇其ITS序列進(jìn)行物種鑒定分析，為該區(qū)域五味子品種的鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥材

五味子果實(shí)全部采自遼寧省內(nèi)16個(gè)地區(qū)，共計(jì)16份樣品。所有樣品經(jīng)鑒定均為五味子[Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.]，樣本采集信息詳見表1。不同基源的木蘭科五味子屬藥材及外群樣品信息來自GenBank，詳見表2。

1.2 試劑及儀器

1.2.1 試驗(yàn)試劑" DNAsecure-新型植物基因組提取試劑盒（DP320型，北京TIANGEN生化科技有限公司），2×Es Tap MasterMix（上海Sangon Biotech股份有限公司），正向引物、反向引物（上海Sangon Biotech股份有限公司），ddH2O（上海Sangon Biotech股份有限公司），瓊脂糖及溴化乙錠（上海Sangon Biotech股份有限公司），Trans 2k DNA Marker（北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司），無水乙醇（天津科密歐有限公司）及其余試劑均為分析純。

1.2.2 試驗(yàn)儀器" 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴(kuò)增儀（TC1000-G型，北京大龍興創(chuàng)試驗(yàn)儀器股份公司），電泳儀（DYY-6C型，北京六一生物科技有限公司），凝膠成像處理系統(tǒng)（Tabnon-4100，上海天能科技有限公司），高速離心機(jī)（D3024R型，北京大龍興創(chuàng)試驗(yàn)儀器股份公司），電熱恒溫水浴鍋（DZKW-S-4型，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司），旋渦混勻器（XH-C型，金壇市城東新瑞儀器廠），移液器（賽默飛世爾公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣本DNA提取" 每個(gè)樣品各取100 mg，并將樣品果實(shí)解剖為果皮、種皮和種仁3部分備用。每個(gè)步驟前均用75%乙醇擦拭果實(shí)及種仁表面，以免外源污染影響DNA提取結(jié)果。樣品各部位分別放入滅菌研缽中，加入適量液氮快速研磨成細(xì)粉。低溫稱取20 mg樣本粉末，用試劑盒提取各樣本的基因組總DNA，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)樣品DNA提取質(zhì)量。

1.3.2 PCR擴(kuò)增" PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：2×Es Tap Master Mix（Dye）25 μL，正反雙向引物各2 μL，DNA模板4 μL，加入ddH2O 17 μL補(bǔ)充至50 μL，充分混勻后備用。ITS擴(kuò)增引物及PCR擴(kuò)增條件參考文獻(xiàn)[7]，正向引物5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，反向引物5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。PCR產(chǎn)物純化后由上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4 序列分析與數(shù)據(jù)處理

測(cè)序獲得的片段使用SeqMan軟件進(jìn)行拼接，并除去低質(zhì)量區(qū)及引物區(qū)獲得目標(biāo)序列。采用MEGA11軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)分析，采用Kimura-2-Parameter（K2P）模型計(jì)算遺傳距離，分析五味子種間種內(nèi)變異，并基于鄰接法（NJ）構(gòu)建系統(tǒng)聚類樹，使用Bootstrap（1 000次重復(fù)）檢驗(yàn)各分支的支持率。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA最佳提取部位及基于ITS序列的物種鑒定分析

各樣本ITS序列擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果見圖1，由種仁部位所提取的基因組DNA，其ITS序列的擴(kuò)增條帶較果實(shí)和果皮的明顯清晰，表明種仁為五味子基因組DNA的最佳提取部位；所采集的16個(gè)五味子藥材種仁的DNA提取率為100%，且16個(gè)樣本的ITS序列擴(kuò)增效率均為100％。由測(cè)序結(jié)果可知，各樣本ITS序列的堿基質(zhì)量值均大于20（即可信度大于99%）；通過BLAST比對(duì)，確定16個(gè)樣本的堿基序列均與已報(bào)道的五味子（Schisandra chinensis）的ITS序列相似性最高。

2.2 種內(nèi)和種間變異分析

16個(gè)五味子樣本的ITS序列長度500～509 bp。通過各樣本ITS序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)W2、W6樣本中各存在1個(gè)變異位點(diǎn)；其余樣本中均未發(fā)現(xiàn)變異位點(diǎn)（表3）?？傮w而言，研究區(qū)五味子樣本的ITS序列之間差異不大。

五味子屬各樣本及外群之間的遺傳距離見表4，可以看出，樣本W(wǎng)2與W6具有1個(gè)變異位點(diǎn)，與五味子樣本的遺傳距離為0.002 12，其余五味子樣本之間的遺傳距離均為0；而同屬五味子屬物種與外群南五味子屬植物冷飯?zhí)伲↘adsura oblongifolia.）和南五味子（Kadsura longipedunculata）的遺傳距離≥0.032 13，明顯高于五味子屬物種之間的遺傳距離。

2.3 聚類分析

采用MEGA11軟件對(duì)16個(gè)五味子樣本ITS序列，以及來自GenBank的3個(gè)五味子（Schisandra chinensis）ITS序列，2個(gè)華中五味子（S. sphenanthera）ITS序列，綠葉五味子（S. arisanensis subsp. viridis）、金山五味子（S. glaucescens）、翼梗五味子（S. henryi）、紅花五味子（S. rubriflora）、毛葉五味子（S. pubescens）及大花五味子（S. grandiflora）各1個(gè)ITS序列，同科植物南五味子屬冷飯?zhí)伲↘. oblongifolia）和南五味子（K. longipedunculata）ITS序列作為外群進(jìn)行序列比對(duì)。根據(jù)比對(duì)結(jié)果建立NJ系統(tǒng)聚類發(fā)育樹（圖2）。

由圖2可知，29個(gè)樣本分為兩支，外群南五味子屬物種單獨(dú)聚為一支，其余同屬五味子屬物種聚為一支。其中，16個(gè)五味子樣本與來自GenBank的五味子聚為一小支，W2和W6樣本出現(xiàn)了種內(nèi)變異，因此又單獨(dú)聚為一個(gè)小分支，其親緣關(guān)系非常接近。五味子同屬植物金山五味子、綠葉五味子、華中五味子、毛葉五味子、翼梗五味子、紅花五味子和大花五味子聚為一支。其中，金山五味子、綠葉五味子和華中五味子聚為一小支，毛葉五味子、翼梗五味子、紅花五味子和大花五味子另聚為一小支。

從物種系統(tǒng)發(fā)育樹可以觀察得到，五味子屬物種間親緣關(guān)系接近，而五味子物種與同屬其他物種可以被區(qū)分開來?？傮w而言，五味子科植物親緣關(guān)系相近；利用ITS序列可以明顯區(qū)分五味子與同科其他物種，并且具有較高的支持率。

3 結(jié)論與討論

五味子果實(shí)的酚類成分含量較高，其完整果實(shí)樣本的DNA提取質(zhì)量不高，在一定程度上可能會(huì)影響測(cè)序結(jié)果。通過將其果實(shí)解剖后分部位單獨(dú)提取基因組DNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)種仁提取的DNA質(zhì)量更佳。樣品研磨后加入異丙醇，可以有效除去脂溶性酚類化合物[13]。同時(shí)，提取過程中加入適當(dāng)比例的β巰基乙醇（還原劑），可以起到抗氧化等作用，保護(hù)樣品中的多酚類物質(zhì)，避免其與DNA共沉淀形成難溶物或褐變，以保證DNA產(chǎn)率。

有關(guān)五味子DNA條形碼的相關(guān)研究較多，主要集中在對(duì)全國范圍內(nèi)不同產(chǎn)區(qū)五味子樣品的對(duì)比，部分研究樣本量較少，有關(guān)栽培品種和野生品種區(qū)分鑒定的研究較少，且多為基于ITS2序列的物種鑒定研究[9-11]。遼寧是五味子的道地產(chǎn)區(qū)之一，栽培品種豐富、市場需求量大。鑒于市售五味子藥材商品來源存在部分混雜現(xiàn)象，本試驗(yàn)通過對(duì)該地區(qū)16個(gè)不同產(chǎn)區(qū)的栽培五味子樣本進(jìn)行ITS序列鑒定。經(jīng)序列比對(duì)和遺傳距離測(cè)算，ITS序列可以明顯區(qū)分五味子樣品與同科其他物種，且具有較高的支持率。

綜上，ITS序列可作為DNA條形碼對(duì)五味子藥材及其不同來源的基原植物進(jìn)行區(qū)分鑒別，且成功率較高，可用于五味子屬物種間的鑒別。本試驗(yàn)結(jié)果為五味子藥材來源的準(zhǔn)確鑒定提供了參考。

參考文獻(xiàn)

[1] 國家藥典委員會(huì). 中華人民共和國藥典：二部[M]. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2020.

[2] 遼寧省科學(xué)技術(shù)委員會(huì)遼寧植物志編輯委員會(huì). 遼寧植物志：上冊(cè)[M]. 沈陽：遼寧科學(xué)技術(shù)出版社，1988.

[3] 邢楠楠，屈懷東，任偉超，等. 南、北五味子古今產(chǎn)地和功效考證及現(xiàn)代鑒別技術(shù)研究[J]. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2022，24（10）：110-114.

[4] 劉璐璐，張祺，許亮，等. 遼五味的道地性和栽培史考證[J]. 中國中醫(yī)藥現(xiàn)代遠(yuǎn)程教育，2019，17（21）：129-132.

[5] 張明曉，黃國英，白羽琦，等. 南、北五味子的化學(xué)成分及其保肝作用的研究進(jìn)展[J]. 中國中藥雜志，2021，46（5）：1017-1025.

[6] 李澤鋒，劉昆，郝云良. 遼寧省五味子產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及對(duì)策[J]. 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)，2011（7）：21，34.

[7] 陳士林，龐曉慧，姚輝，等. 中藥DNA條形碼鑒定體系及研究方向[J]. 世界科學(xué)技術(shù)（中醫(yī)藥現(xiàn)代化），2011，13（5）：747-754.

[8] 陳士林，姚輝，宋經(jīng)元，等. 基于DNA barcoding（條形碼）技術(shù)的中藥材鑒定[J]. 世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2007，9（3）：7-12.

[9] 陳靚，吳亞男，單會(huì)嬌，等. 五味子與南五味子藥材的DNA條形碼鑒定[J]. 中國試驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2016，22（1）：66-71.

[10] 林鳳越，牛征，任歡歡，等. 中藥五味子種子的基源快速鑒定[J]. 時(shí)珍國醫(yī)國藥，2020，31（4）：880-883.

[11] 李先寬，王冰，鄭艷超，等. 五味子特殊類型白果五味子的ITS2序列鑒定研究[J]. 中國中藥雜志，2014，39（11）：2011-2015.

[12] 郭豪杰. 五味子科藥用植物葉綠體基因組學(xué)研究與內(nèi)南五味子的分子鑒定[D]. 北京：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，2017.

[13] 陳士林，姚輝，韓建萍，等. 中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則[J]. 中國中藥雜志，2013，38（2）：141-148.

（責(zé)編：何 艷）