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    冰結(jié)構(gòu)蛋白對豬精液低溫保存效果的影響

    2024-12-06 00:00:00尚月麗韓雪峻張心志宋團偉吳凌江
    國外畜牧學·豬與禽 2024年6期

    摘" 要:為了探索冰結(jié)構(gòu)蛋白(ice structuring proteins,ISPs)對低溫(4 ℃)保存下豬精液保存效果的影響,向不同稀釋倍數(shù)的豬精液中添加不同濃度的ISPs,于24、48、72、96、120 h后,測定各試驗組豬精子前向運動比例和總活率。結(jié)果顯示:向稀釋8倍的豬精液中添加100 μg/mL ISPs,低溫(4 ℃)保存24 h、48 h后,精子前向運動比例顯著提高(P<0.05),精子總活率沒有顯著變化,但其他試驗組精子前向運動比例和總活率均較低;向稀釋2倍的豬精液中添加10 μg/mL ISPs,低溫(4 ℃)保存24 h和120 h后,精子前向運動比例顯著提高(P<0.05),精子總活率沒有顯著變化,添加100 μg/mL ISPs,低溫(4 ℃)保存24 h后,精子前向運動比例顯著提高(P<0.05),精子總活率沒有顯著變化;向去除精漿并稀釋到原密度的豬精液中添加100 μg/mL ISPs,低溫(4 ℃)保存48 h后,精子前向運動比例和總活率顯著提高(P<0.05)。結(jié)果表明,豬精液中添加100 μg/mL ISPs,低溫(4 ℃)保存48 h后,均能顯著提高精子前向運動比例,為豬精液低溫保存提供數(shù)據(jù)支撐。

    關(guān)鍵詞:冰結(jié)構(gòu)蛋白;不同精漿含量;精子前向運動比例;精子總活率

    中圖分類號:S828 文獻標志碼:A 文章編號:1001-0769(2024)06-0042-08

    基金項目:上海農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學院校基金(KY6-0000-24-02)

    作者簡介:尚月麗,博士,主要研究方向為生殖生理

    *通信作者:韓雪峻,主要研究方向豬精液冷凍保存及推廣應用

    全球養(yǎng)豬生產(chǎn)中,人工授精使用率超過90%,豬精液長途運輸是優(yōu)秀種公豬基因傳播的主要途徑[1]。目前國內(nèi)外精液保存分為常溫液態(tài)保存(15~20 ℃)、低溫液態(tài)保存(4~10 ℃)和超低溫冷凍固態(tài)保存(液氮-196 ℃,或干冰" -80 ℃)。超低溫冷凍保存容易破壞精子膜、頂體、精子活力等,降低精子受精能力[2],在生產(chǎn)實踐中受到限制,全球使用率不到1%[3]。精液常溫液態(tài)保存一般維持在17 ℃,可以減緩精子代謝,延長精子受精能力,達到與新鮮精液接近的受孕率和產(chǎn)仔數(shù)[4]。然而,精液收集過程中可能會污染細菌,在17 ℃保存不能阻止細菌生長,導致細菌對精子質(zhì)量和功能產(chǎn)生破壞。為了減少抗生素使用,近年來開始探索將精液稀釋,于低溫(4 ℃)保存來抑制細菌生長,從而降低細菌對精子的破壞[5]。理論上低溫保存能降低豬精子的代謝水平,抑制細菌生長,延長精液保存時間。但豬精子對低溫比較敏感,在低溫環(huán)境容易發(fā)生冷休克現(xiàn)象,產(chǎn)生過多的活性氧(reactive oxygen species,ROS),破壞精子膜的完整性,影響精子受孕能力[6]。

    自然界中的抗凍生物在0 ℃以下產(chǎn)生的蛋白能抑制冰晶的形成,也能與細胞結(jié)合引起細胞膜結(jié)構(gòu)的改變,從而提高細胞對低溫的抵抗能力,這種蛋白稱為冰結(jié)構(gòu)蛋白(ice structuring proteins,ISPs),也稱冰結(jié)合蛋白,抗凍蛋白,可用于精子、卵子及胚胎的冷凍保存[7]。冰結(jié)構(gòu)蛋白是由細菌、昆蟲、深海魚、植物等產(chǎn)生[8-9]。利用自然界中這些生物的耐凍機制,分離出抗凍蛋白,能夠提高冷凍和低溫保存精子的質(zhì)量[10-11]。Masuda等[12]研究發(fā)現(xiàn),將Ⅲ型抗凍蛋白加入精液稀釋液中,能顯著提高豬冷凍精液復蘇后精子的活力、線粒體和細胞膜的完整性以及頂體蛋白水解活性。將抗凍蛋白用于豬精液的低溫保存的研究鮮有報道。南京百斯杰生物工程有限公司從極地嚴寒地區(qū)的藍孢子菌中分離出抗凍基因,利用植物材料發(fā)酵生產(chǎn)出ISPs(BSJ-RD-000162)。在豬肉及牛肉中添加ISPs能夠提高肉的抗凍能力,保持營養(yǎng)風味,關(guān)于其對豬精液低溫保存的影響還有待研究。因此,本研究在不同稀釋倍數(shù)的豬精液中添加ISPs,于4 ℃保存不同時間后測定精子的前向運動比例和總活力,以確定ISPs對豬精液低溫保存的影響,為豬精液的低溫液態(tài)運輸提供數(shù)據(jù)支撐。

    1" 材料與方法

    1.1 材料

    豬精液采自上海祥欣畜禽有限公司東灘種公豬站2~3歲大白公豬。ISPs由南京百斯杰生物工程有限公司提供。豬精液稀釋劑為江蘇中牧倍康藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的全能健豬精液稀釋粉保存劑。計算機輔助精子分析(computer assisted sperm analysis,CASA)系統(tǒng)購自福州鴻視野軟件技術(shù)有限公司。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 豬精液采集

    利用手握法采集6頭大白種公豬精液,將采集的精液置于37 ℃保溫箱中1 h內(nèi)送至實驗室,選擇外觀呈乳白色、稍腥而無異味、密度在2億/mL以上、直線運動精子70%以上的合格精液,不添加任何抗生素和防腐劑。

    1.2.2 試驗設計

    試驗1:將豬精液8倍稀釋,稀釋后分為6組,分別添加0(A1組)、0.1(B1組)、1(C1組)、10(D1組)、100(E1組)、1 000 μg/mL" ISPs(F1組),充分混合,每組6個重復,每個重復 1.5 mL。試驗重復3次。

    試驗2:將豬精液2倍稀釋,稀釋后分為 5組,分別添加0(A2組)、10(B2組)、100(C2組)、1 000(D2組)、3 000 μg/mL ISPs(E2組),充分混合,每組6個重復,每個重復1.5 mL。試驗重復3次。

    試驗3:將豬精液4倍稀釋,2 h內(nèi)溫度過度到25 ℃,950 r/min離心15 min,去除上層精漿,用精液稀釋劑將精子稀釋至原密度(2億/mL),分為7組,分別添加0(A3組)、0.1(B3組)、1(C3組)、10(D3組)、100(E3組)、1 000(F3組)、3 000 μg/mL ISPs(G3組),充分混勻,每組6個重復,每個重復1.5 mL。試驗重復3次。

    1.2.3 精液低溫保存及回溫

    將處理后的精液于17 ℃放置1 h,然后于9 ℃放置1 h,4 ℃保存?zhèn)溆?。分別于4 ℃保存24、48、72、96、120 h后取出,先9 ℃放置1 h,17 ℃放置2 h,然后室溫25 ℃平衡2 h,37 ℃孵育5 min,待精子活力恢復后進行檢測。

    1.2.4 測定精子質(zhì)量指標

    將精子調(diào)整為統(tǒng)一密度,取5 μL精液滴加于載玻片檢測腔室中,置于37 ℃恒溫載物臺上,利用計算機精子輔助分析儀測定精子質(zhì)量指標。測定指標為:精子總活力,指精子運動速率大于20 μm/s的精子比例;精子前向運動比例,指直線率大于75%、運動速率大于50 μm/s的精子比例。

    1.3 數(shù)據(jù)處理

    試驗數(shù)據(jù)用Excel初步整理后,應用GraphPad Prism Vol.10.2.1統(tǒng)計分析作圖軟件的單因素方差分析程序(ANOVA)來分析各組間的差異顯著性,P<0.05表示差異顯著。數(shù)據(jù)用“平均數(shù)±標準誤”表示。

    2" 結(jié)果與分析

    2.1 ISPs對稀釋8倍精液4 ℃保存效果的影響

    如表1所示,將精液8倍稀釋后,相比對照組A1,添加1 000 μg/mL ISPs顯著提高了" " 4 ℃保存24、48、96 h后精子總活力(P<0.05);而添加0.1 μg/mL ISPs于4 ℃保存24 h后,精子總活力顯著下降(P<0.05)。

    如表2所示,將精液8倍稀釋后,與對照組A1相比,添加0.1、1、10、100 μg/mL ISPs,均顯著提高了4 ℃保存24 h后精子前向運動比例(P<0.05);添加100 μg/mL ISPs顯著提高了4 ℃保存48 h后精子前向運動比例(P<0.05),但保存72 h后,精子前向運動比例顯著降低(P<0.05);添加1 000 μg/mL ISPs時,4 ℃保存120 h精子前向運動比例顯著降低(P<0.05)。

    總的來說,將精液8倍稀釋后,添加100 μg/mL ISPs能顯著提高4 ℃保存48 h的精子前向運動比例,而對精子總活力沒有顯著影響,但這兩個指標均較低。

    2.2 ISPs對稀釋2倍精液4 ℃保存效果的影響

    如表3所示,將精液2倍稀釋后,與對照組A2相比,添加100 μg/mL ISPs顯著抑制了4 ℃保存48 h的精子總活力(P<0.05),對其他保存時間的精子總活力沒有顯著影響;而添加" " " " 1 000 μg/mL ISPs顯著降低了4 ℃保存48、72、96、120 h后的精子總活力(P<0.05);添加3 000 μg/mL ISPs均顯著抑制了精子總活力(P<0.05)。

    如表4所示,將精液2倍稀釋后,與對照組A2相比,添加10 μg/mL ISPs,4 ℃保存24、120 h精子前向運動比例顯著提高(P<0.05);添加100 μg/mL ISPs,4 ℃保存24 h精子前向運動比例顯著提高(P<0.05),但保存48 h卻顯著降低(P<0.05);添加1 000 μg/mL ISPs,4 ℃保存24 h精子前向運動比例顯著提高(P<0.05),但其他時間點均顯著降低(P<0.05);添加3 000 μg/mL ISPs,各時間點的精子前向運動比例均顯著下降(P<0.05)。

    總的來說,將精液2倍稀釋后,添加10 μg/mL ISPs顯著提高了4 ℃保存精子前向運動比例,對精子總活力沒有影響;添加100 μg/mL ISPs顯著提高了4 ℃保存24 h的精子前向運動比例,并對精子總活力沒有影響。

    2.3 ISPs對無精漿精液4 ℃保存效果的影響

    如表5所示,在無精漿精液中添加100 μg/mL ISPs顯著提高了4 ℃保存48 h的精子總活力" (P<0.05),而對其他時間點沒有影響;添加1、10 μg/mL ISPs對大部分保存時間的精子總活力沒有影響;而添加0.1、3 000 μg/mL ISPs顯著降低了所有保存時間的精子總活力(P<0.05),添加1 000 μg/mL ISPs也顯著降低了大部分保存時間的精子總活力(P<0.05)。

    如表6所示,在無精漿精液中添加100 μg/mL ISPs,4 ℃保存48 h精子前向運動比例顯著提高(P<0.05),而在96 h顯著下降(P<0.05),其他時間點無顯著變化;添加0.1、3 000 μg/mL ISPs,所有保存時間的精子前向運動比例均顯著下降(P<0.05);添加1、10 μg/mL ISPs,大部分保存時間的精子前向運動比例沒有顯著變化;添加1 000 μg/mL ISPs,4 ℃保存96、120 h精子前向運動比例顯著降低(P<0.05),其他時間點無顯著變化。

    總的來說,在無精漿精液中添加100 μg/mL ISPs顯著提高了4 ℃保存48 h精子前向運動比例和精子總活力。

    3" 討論

    目前種豬精液通常經(jīng)稀釋后在17 ℃條件下進行運輸,不過有報道稱,將精漿增加到10%,于17 ℃保存72 h會顯著降低精子活力[13],引發(fā)頂體獲能、分泌[14]。近來有研究提出通過稀釋降低保存溫度,以減少抗生素使用[15]。不過,精液在-5~5 ℃處于冰晶潛熱階段,由液相變?yōu)楣滔鄷r會釋放熱量,同時精子會產(chǎn)生過多的活性氧,破壞精子膜完整性[6]。雖然4~5 ℃保存可以有效抑制細菌增殖,但隨著溫度降低直線運動精子會大量減少[16],為了提高精子前向運動比例,有研究報道添加20%蛋黃[17]或20%脫脂奶粉[4]可幫助精子對抗低溫,但精子前向運動比例在保存24 h后迅速下降,維持在30%~45%。在試驗1中發(fā)現(xiàn),ISPs能提高" 4 ℃保存精子前向運動比例,但均維持在較低水平。在試驗1的基礎上,將精液2倍稀釋,添加ISPs后發(fā)現(xiàn),精子總活力由之前的10%左右提高到70%左右,且4 ℃保存120 h精子前向運動比例也有大幅提高,接近國標規(guī)定的70%。本研究一定程度上顯著提高了豬精液4 ℃保存時的精子前向運動比例,延長了保存時間,有望拓寬豬精液低溫液態(tài)保存運輸。

    在本研究中,將精液2倍稀釋,在較長的保存時間內(nèi),精子都保持著較高的前向運動比例,而將精液8倍稀釋或去除精漿,ISPs的添加效果只能持續(xù)48 h,表明ISPs持續(xù)發(fā)揮其抗低溫作用可能與精漿有關(guān)。ISPs由自然界生物自身產(chǎn)生,可以保持血液或者體液在冰點以下正常運行[7,18],接近或者完全一致的動物體液環(huán)境可能更能促進ISPs發(fā)揮其抗凍功能。不過具體的活性機制不清楚,需要進一步研究。

    研究發(fā)現(xiàn),在太平洋鮑魚精液中添加" " "10 μg/mL ISPs能提高冷凍保存精子的活率,提高精子頂體的完整性、膜完整性、線粒體膜電位,提高受孕率和孵化率[19]。ISPs能顯著提高鱘魚精子活率[20],減少冷凍保存對安卡拉鴨精子DNA的損傷[21]。研究顯示,添加1 μg/mL ISPs能提高雞精子前向運動比例和總活力,提高精子膜功能和線粒體活性,提高受孕率和孵化率[22]。冷凍保存時加入ISPs能顯著提高食蟹獼猴精子活力,提高線粒體膜電位比例,通過穩(wěn)定細胞分子功能和精子生物學過程提高冷凍精子質(zhì)量[23]。本研究發(fā)現(xiàn),在不同精漿含量的精液中添加100 μg/mL ISPs,4 ℃保存時對精子均有較好的保護作用。在不同物種上的研究表明,低溫及超低溫保存時添加ISPs對不同物種精子有保護作用。

    不過也有不一樣的結(jié)果,添加10 μg/mL ISPs顯著提高了水牛精子冷凍保存時前向運動比例,提高了精子膜完整性,不過對精子4 ℃保存沒有任何作用[24]。但是該研究只測定了ISPs對精子4 ℃保存2 h的效果,可能是時間太短,ISPs還沒有發(fā)揮作用。該研究使用的是無精漿保存,與本研究的試驗3類似,本研究也發(fā)現(xiàn)ISPs對精子前向運動比例和總活力的效果在4 ℃保存48 h才顯示出。在羊上的研究表明,冷凍保存時在精液中加入ISPs,隨著添加水平的增加,精子活力下降,精子質(zhì)膜完整性和低滲耐受性也下降[25],這可能是因為羊精子膜結(jié)構(gòu)與豬精子膜結(jié)構(gòu)中脂質(zhì)含量不同。

    在本研究中,添加1 000 μg/mL或以上ISPs對精子前向運動比例有顯著的抑制作用,與報道高濃度ISPs對細胞有一定的毒副作用有關(guān)[8],但是也有報道稱ISPs安全無毒[26],與本研究中高濃度表現(xiàn)出副作用和中等濃度的促進作用類似,與之前的報道基本類似。

    綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn),ISPs對豬精液4 ℃保存效果受劑量和時間影響,還與精液中精漿含量有關(guān)。在不同精漿含量的豬精液中添加100 μg/mL ISPs,可以提高4 ℃保存48 h精子前向運動比例;通過在2倍稀釋精液中添加100 μg/mL ISPs,精子4 ℃保存120 h仍能維持較高的前向運動比例。本研究為拓寬豬精液低溫液態(tài)保存運輸提供了數(shù)據(jù)支撐。

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