甘草根際節(jié)桿菌Arthrobacter sp. GCG3的分離鑒定及抑菌促生特性

摘要：為挖掘甘草根際兼具促生防病功能的植物根際促生菌，利用平板對(duì)峙法從甘草根際篩選出1株對(duì)甘草根腐病病原菌及常見(jiàn)植物病原菌抑制率均在50%以上的高活性拮抗菌株GCG3。通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化特征及16S rRNA序列同源性分析，確定該菌株屬于節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）。GCG3菌株的不同濃度發(fā)酵菌液對(duì)供試病原菌均具有較強(qiáng)的抑制作用，當(dāng)菌液濃度為1%以上時(shí)，抑制率均能達(dá)到70%以上；而無(wú)細(xì)胞濾液只在濃度為20%時(shí)對(duì)病原菌灰霉菌、核盤菌、茄鏈格孢、大斑凸臍蠕孢菌具有較強(qiáng)的抑制作用，抑制率為69.49%～76.92%。菌體、發(fā)酵菌液和無(wú)細(xì)胞濾液的抑制活性強(qiáng)度整體表現(xiàn)為發(fā)酵菌液gt;菌體gt;無(wú)細(xì)胞濾液。發(fā)酵24 h的菌液對(duì)供試病原菌的抑制作用最強(qiáng)。該菌株能夠耐受較高鹽堿，具有固氮、分泌生長(zhǎng)激素IAA的性能，且胞外多糖產(chǎn)量可達(dá)1 017.06 mg/L。盆栽與大田試驗(yàn)結(jié)果表明，接種該菌株對(duì)玉米生長(zhǎng)具有顯著的促生效果。綜上，節(jié)桿菌GCG3兼具廣譜抑菌活性和促生性能，在生物防治、促生及鹽堿地改良中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：甘草；根際；節(jié)桿菌；抑菌活性；促生

中圖分類號(hào)：S182" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）23-0247-09

張" 軍，郭" 琪，楊" 暉，等. 甘草根際節(jié)桿菌Arthrobacter sp. GCG3的分離鑒定及抑菌促生特性［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024，52（23）：247-255.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.23.033

收稿日期：2024-06-06

基金項(xiàng)目：蘭州市人才創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（編號(hào)：2022-RC-75）；甘肅省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：21YF5FA151）。

作者簡(jiǎn)介：張" 軍（1982—），男，甘肅禮縣人，助理研究員，主要從事藥用植物栽培和菌植互作研究。E-mail：zhangjun-204@163.com。

通信作者：郭" 琪，碩士，研究員，主要從事植物生物技術(shù)和菌植互作研究，E-mail：guoqi9207@163.com；楊" 暉，博士，研究員，主要從事植物生物技術(shù)和菌植互作研究，E-mail：yanghui43@163.com。

甘草是甘草屬（Glycyrrhiza L.）植物的統(tǒng)稱，為豆科多年生草本植物，是我國(guó)大宗常用藥材，主要分布于內(nèi)蒙古、甘肅、寧夏、新疆等地，常以其根及根莖入藥，具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥等功效［1］。在新冠疫情防治中，甘草是主要的免疫調(diào)節(jié)藥物［2］。此外，甘草在食品制造業(yè)、畜牧業(yè)養(yǎng)殖、環(huán)境保護(hù)中均有應(yīng)用。近年來(lái)，隨著我國(guó)及向外出口的甘草需求量逐年增大，甘草人工栽培的規(guī)模不斷擴(kuò)大，已經(jīng)成為一種廣泛種植的藥材。病害，特別是真菌病害是影響甘草生產(chǎn)的限制性因素之一，也是導(dǎo)致甘草產(chǎn)量減少、品質(zhì)下降的因素。土壤微生物防治在藥用植物綠色生態(tài)栽培方面表現(xiàn)出了巨大潛力，特別是植物根際促生菌被證實(shí)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)、提高植物生長(zhǎng)品質(zhì)及緩解病害等方面具有重要作用［3］。因此，從甘草根際篩選拮抗微生物可為甘草的生物防治提供微生物資源，對(duì)甘草產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。目前，對(duì)甘草根際微生物的研究多集中在叢枝菌根真菌，對(duì)細(xì)菌的研究尚處在初級(jí)階段，且主要集中在根部?jī)?nèi)生細(xì)菌的研究上，例如郎多勇等發(fā)現(xiàn)，寧夏產(chǎn)甘草中含有豐富的內(nèi)生細(xì)菌，且以根中居多，這類內(nèi)生細(xì)菌中對(duì)多種病原菌有拮抗效果的菌種為芽孢桿菌屬［4］。饒小莉?qū)趵瓲柛什輧?nèi)生細(xì)菌的多樣性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)分離到的6株內(nèi)生細(xì)菌對(duì)15種植物病原菌均具有較好的拮抗活性，而且與菌根復(fù)合回接后能顯著促進(jìn)甘草生長(zhǎng)［5］。馬文彬等利用從甘草與苜蓿根際分離獲得的5株優(yōu)良促生細(xì)菌制成的接種劑接種甘草幼苗，發(fā)現(xiàn)可顯著促進(jìn)苗期幼苗生長(zhǎng)［6］。

本研究前期在分離甘草根際固氮菌的過(guò)程中篩選到1株對(duì)甘草根腐病病原菌及常見(jiàn)植物病原菌具有明顯抑制作用的節(jié)桿菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化特征及16S rRNA基因序列分析進(jìn)行鑒定，并對(duì)其發(fā)酵液的抑菌活性、菌株促生性能進(jìn)行研究，以期為抑菌促生菌劑的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1" 材料與方法

1.1" 土壤樣品

于2022年6月在甘肅省武威市民勤縣西渠鎮(zhèn)東容村（39°04′N，103°61′E）2年生健康烏拉爾甘草根際取樣，采集距離根部0～10 cm的土壤，將土壤裝入無(wú)菌自封袋中，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離。采樣區(qū)0～20 cm土層土壤的全氮含量為 0.61 g/kg，速效磷含量為19.11 mg/kg，速效鉀含量為47.71 mg/kg，有機(jī)質(zhì)含量為9.36 g/kg，pH值為8.14，全鹽量為1.40 g/kg。

盆栽試驗(yàn)用土取自甘肅省蘭州新區(qū)農(nóng)投集團(tuán)皋蘭縣西岔鎮(zhèn)園區(qū)（36°42′N，103°79′E） 0～20 cm土層土壤，全氮含量為4.08 g/kg，速效磷含量為36.64 mg/kg，速效鉀含量為186.38 mg/kg，有機(jī)質(zhì)含量為3.84 g/kg，pH值為7.80，全鹽量為4.08 g/kg。去除落葉、小石塊等雜質(zhì)，并將土樣過(guò) 5 mm 篩，高壓滅菌后晾干備用。

1.2" 供試菌株與病原菌

圓褐固氮菌［Azotobacter chroococcum（Ac）］1.178由中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心甘肅分中心提供；立枯絲核菌［Rhizoctonia solani Kuhn（Rs）］、尖孢鐮刀菌［Fusarium oxysporum Schlecht （Fo）］、腐皮鐮孢菌［Fusarium solani （Martius） Sacco（Fs）］、灰霉菌［Botrytis cinerea Persoon（Bc）］、瓜亡革菌［Thanatephorus cucumeris（Tc）］、核盤菌Sclerotinia sclertiorum（Ss）、大斑凸臍蠕孢菌［Exserohilum tucicum（Et）］、茄鏈格孢［Alternaria solani （Elliset G. Martin） Sorauer（As）］由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院植保所提供。

1.3" 供試玉米品種

甜糯182（審定編號(hào)：國(guó)審玉2016004）購(gòu)自北京華耐農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，為無(wú)包衣種子。

1.4" 菌株的分離純化與篩選

本研究菌株是在分離甘草根際固氮促生菌的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的。取10 g土樣，與無(wú)菌水充分混合制成混懸液，再將混懸液置于固氮Ashby液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、180 r/min富集培養(yǎng)72 h后，用常規(guī)稀釋平板涂布法在Ashby培養(yǎng)基上進(jìn)行凃布分離，28 ℃ 恒溫培養(yǎng)2～3 d。待分離的菌落長(zhǎng)出后，挑取單菌落，用平板劃線法繼續(xù)在Ashby培養(yǎng)基上進(jìn)行純化。將純化好的菌株接入LB斜面上，培養(yǎng)2～3 d后于4 ℃冰箱保藏并編號(hào)。

將分離得到的菌株分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，180 r/min、28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期。采用平板對(duì)峙法，在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）平板中心放置植物病原菌菌餅（直徑6 mm），取4張無(wú)菌濾紙片，呈十字交叉狀放在菌餅四周，每張濾紙片距平板外緣2 cm。在每張濾紙片上各滴5 μL各菌株菌懸液。以無(wú)菌水為對(duì)照，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。在28 ℃培養(yǎng)3～5 d后，采用十字交叉法測(cè)定菌落生長(zhǎng)直徑，按照以下公式計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率：

菌絲生長(zhǎng)抑制率＝（對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑）/對(duì)照組菌落直徑×100％。

1.5" 菌株GCG3的鑒定

1.5.1" 形態(tài)及生理生化特征分析" 觀察并描述菌株GCG3在LB培養(yǎng)基上于28 ℃培養(yǎng)48 h后的單菌落特征，主要包括菌落的生長(zhǎng)速度、大小、顏色、透明度、表面狀態(tài)（是否平坦、凸起、褶皺或凹陷等）和邊緣狀態(tài)（是否整齊、不規(guī)則或放射狀等）及后期生長(zhǎng)狀態(tài)。并按照細(xì)菌鑒定常規(guī)方法對(duì)菌株GCG3進(jìn)行革蘭氏染色及生理生化鑒定試驗(yàn)［7］。

1.5.2" 16S rDNA序列的同源性分析" 根據(jù)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）說(shuō)明提取單菌落基因組DNA，送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行16S rDNA測(cè)序，結(jié)果與NCBI（美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心）GenBank中的已知序列進(jìn)行同源性比對(duì)后，判斷細(xì)菌種類并劃分到屬。應(yīng)用MEGA 7.0軟件，采用鄰接法聚類分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，Bootstrap值為1 000。

1.6" 菌株GCG3發(fā)酵液對(duì)植物病原菌的抑制作用

1.6.1" 不同濃度GCG3發(fā)酵菌液對(duì)病原菌的抑制作用" 將菌株GCG3接種于LB液體培養(yǎng)基中，于180 r/min、28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)48 h，待PDA培養(yǎng)基冷卻至50 ℃左右時(shí)加入發(fā)酵菌液，使菌液濃度體積占比分別為0.2%、0.5%、1.0%、2.0%、5.0%、10.0%、20.0%時(shí)，混合均勻后制成平板，每個(gè)比例設(shè)3次重復(fù)；以不含菌液的PDA平板作為對(duì)照。取直徑為 0.6 cm 的病原菌菌餅放置于PDA平板中心，于 28 ℃ 培養(yǎng)5～7 d。采用十字交叉法測(cè)定菌落生長(zhǎng)直徑，按照“1.4”節(jié)中的公式計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。

1.6.2" 不同濃度GCG3發(fā)酵液無(wú)細(xì)胞濾液對(duì)病原菌的抑制作用" 用“1.6.1”節(jié)的方法制作的菌懸液在4 ℃、12 000 r/min離心4 min，取上清液，經(jīng) 0.22 μm 孔徑的濾膜過(guò)濾，得到無(wú)細(xì)胞濾液。待PDA培養(yǎng)基冷卻至50 ℃左右時(shí)加入無(wú)細(xì)胞濾液，使菌液體積分?jǐn)?shù)分別為5%、10%、20%，后續(xù)步驟同“1.6.1”節(jié)，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率。以不含無(wú)細(xì)胞濾液的PDA平板作為對(duì)照。

1.6.3" 不同發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)GCG3發(fā)酵菌液對(duì)病原菌的抑制作用" 將菌株GCG3接種于LB液體培養(yǎng)基中，于180 r/min、28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)24、48、72、96、120 h，菌液濃度按照0.5%的體積分?jǐn)?shù)加入培養(yǎng)基中后，檢測(cè)不同時(shí)長(zhǎng)發(fā)酵液對(duì)病原菌生長(zhǎng)的抑制率。

1.7" 促生性能研究

1.7.1" 促生性能檢測(cè)" 固氮酶活性參照微生物固氮酶（NITS）ELISA試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司）說(shuō)明書操作測(cè)定，對(duì)照菌株為GCG1（Agrobacterium sp.）、GCG2（Arthrobacter sp.）和圓褐固氮菌1.178。用定性溶磷圈法測(cè)定溶磷能力［8］；用定性顯色法和Salkowski定量比色法測(cè)定菌株分泌IAA的能力［9］；用苯酚-硫酸法測(cè)定產(chǎn)胞外多糖（EPS）的能力［10］；用CAS培養(yǎng)基平板接種法進(jìn)行鐵載體的定性檢測(cè)［11］，對(duì)照菌株為GCG1、GCG2。

1.7.2" 菌株GCG3對(duì)玉米的促生效應(yīng)

1.7.2.1" 盆栽試驗(yàn)" 該試驗(yàn)在甘肅省科學(xué)院生物研究所人工氣候室內(nèi)進(jìn)行，挑取大小相似、顆粒飽滿的玉米種子，在75%乙醇中浸泡30 s后，放入2%次氯酸鈉溶液中浸泡2 min，再用自來(lái)水沖洗 20 min，最后用無(wú)菌水洗滌3～5次，晾干備用。將菌株GCG3接種于LB液體培養(yǎng)基中，180 r/min、28 ℃ 恒溫振蕩培養(yǎng)48 h后，離心并收集菌體，離心后將菌體重懸于無(wú)菌水中，使菌懸液的濃度達(dá)到 1×107 CFU/mL，再按照1 ∶2的體積比與滅菌土壤混合，制成泥漿，使用該泥漿對(duì)處理過(guò)的玉米種子進(jìn)行拌種，確保每粒種子表面均勻裹滿泥漿。晾干后，將玉米種子播種于花盆中，每個(gè)花盆裝3 L滅菌土，每盆放置1粒種子，共設(shè)6次重復(fù)，待幼苗破土后，每隔7 d用稀釋100倍的50 mL菌懸液均勻澆灌幼苗根部，累計(jì)澆灌3次。對(duì)照組為無(wú)菌水處理。30 d后測(cè)定玉米的株高、莖基直徑、根長(zhǎng)、地上部干重和地下部干重。

1.7.2.2" 田間試驗(yàn)" 該試驗(yàn)在甘肅省蘭州新區(qū)農(nóng)投集團(tuán)皋蘭縣西岔鎮(zhèn)園區(qū)試驗(yàn)田進(jìn)行。將玉米種子按照“1.7.2.1”節(jié)中的方法拌種后備用。采用隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)，每個(gè)小區(qū)試驗(yàn)地面積為16.8 m2，長(zhǎng)×寬=12 m×1.4 m，共設(shè)3次重復(fù)，按照株距×行距為 25 cm×70 cm播種，每個(gè)小區(qū)四周設(shè)有保護(hù)行。在拔節(jié)期、大喇叭口期、抽雄期、灌漿期按照 30 L/hm2 菌懸液用灌溉水稀釋100倍后對(duì)玉米進(jìn)行灌根處理。對(duì)照組為灌溉水處理。在玉米成熟期，每個(gè)小區(qū)隨機(jī)選取5株玉米，測(cè)定株高、每株穗數(shù)、葉面積（長(zhǎng)寬系數(shù)法［12］）、地上部分干重、每穗行數(shù)、禿尖長(zhǎng)、每穗粒數(shù)、千粒重、單位面積產(chǎn)量。單位面積產(chǎn)量按照如下公式計(jì)算：

單位面積產(chǎn)量=（穗粒數(shù)×穗數(shù)×667 m2株數(shù)×0.066 7×千粒重）/1 000。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 菌株GCG3對(duì)植物病原菌的抑制作用

從甘草根際土壤中共分離得到3株固氮細(xì)菌，分別編號(hào)為GCG1、GCG2、GCG3。通過(guò)對(duì)供試植物病原菌的抑制測(cè)試發(fā)現(xiàn)，只有GCG3表現(xiàn)出明顯的抑制病原菌的作用（表1、圖1），且抑制率均在50%以上。

2.2" 菌株的鑒定

2.2.1" 形態(tài)及生理生化特征" 在LB培養(yǎng)基上的GCG3菌株菌落生長(zhǎng)速度較快，16 h后觀察單一菌落為圓形，邊緣整齊，表面光滑且濕潤(rùn)，呈半透明水珠狀（圖2-A），后期變?yōu)闇\白色、扁平狀且邊緣有凸起（圖2-B）。菌株GCG3在LB液體培養(yǎng)基中為淡黃色，部分菌體有絮凝現(xiàn)象。鏡檢結(jié)果為革蘭氏陽(yáng)性菌，短桿菌，無(wú)芽孢（圖2-C）。

生理生化檢測(cè)結(jié)果表明，菌株GCG3能夠耐受8%以下濃度的NaCl，在含鹽量為5%、2%培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)速度較快，能夠適應(yīng)15～45 ℃的溫度范圍，28 ℃ 為菌株GCG3的最適生長(zhǎng)溫度。但是，該菌株在pH值為9.0及以上的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)。菌株GCG3對(duì)麥芽糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、半乳糖、鼠李糖、丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘露醇、山梨醇、肌醇、檸檬酸、乙酸、硝酸鹽呈陽(yáng)性反應(yīng)，對(duì)過(guò)氧化氫酶、絲氨酸、阿拉伯醇、蘋果酸呈陰性反應(yīng)。

2.2.2" 16S rDNA序列同源性分析" 經(jīng)16S rDNA測(cè)序比對(duì)，得到同源性較高的菌株，并與相似及近緣種模式菌株的16SrDNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育

樹(shù)。圖3顯示，菌株GCG3與節(jié)桿菌（Arthrobacter sp.）3734（KP345971）聚為一支，親緣關(guān)系較近，同源相似性達(dá)到99.16%，初步將菌株GCG3歸屬于節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）。

2.3" 菌株GCG3發(fā)酵液對(duì)植物病原菌的抑制作用

2.3.1" 不同濃度GCG3發(fā)酵菌液對(duì)病原菌的抑制作用" 不同濃度GCG3發(fā)酵菌液對(duì)供試病原菌均具有較好的抑制作用（表2），其中Bc、Ss在含有不同濃度發(fā)酵菌液中，以及Et在含有2.0%～20.0%發(fā)酵菌液培養(yǎng)基上均未見(jiàn)明顯生長(zhǎng)，抑制率可視為100%。當(dāng)發(fā)酵菌液濃度為1.0%以上時(shí)，GCG3對(duì)各個(gè)病原菌的抑制率均能達(dá)到70%以上。

2.3.2" 不同濃度GCG3發(fā)酵液無(wú)細(xì)胞濾液對(duì)病原菌的抑制作用" 不同濃度菌株GCG3無(wú)細(xì)胞濾液對(duì)供試病原菌的抑制作用不同（表3、圖4），整體表現(xiàn)為濃度越大，抑制作用越強(qiáng)，即20%gt;10%gt;5%，且濃度20%與濃度10%相比，除Fo外對(duì)病原菌的抑制均呈極顯著差異，與5%濃度相比，10%濃度處理除Fo、Bc有極顯著差異外，其他均無(wú)顯著差異。當(dāng)無(wú)細(xì)胞濾液濃度為20%時(shí)，對(duì)Bc、Ss、As、Et具有較強(qiáng)的抑制作用，抑制率均在70%以上，其中對(duì)Bc的抑制率最高，為76.92%。當(dāng)無(wú)細(xì)胞濾液濃度為5%時(shí)，對(duì)病原菌均有一定的抑制作用，但對(duì)Fo、Bc的抑制作用較弱，而對(duì)As的抑制率仍在50%以上。

2.3.3" 不同發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)GCG3發(fā)酵菌液對(duì)病原菌的抑制作用" 不同發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)GCG3發(fā)酵菌液對(duì)病原菌的抑制作用不同（表4），發(fā)酵24 h的菌液對(duì)供試病原菌的抑制作用最強(qiáng)。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，雖整體的抑制力呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但對(duì)Tc、Ss、As、Bc的抑制作用無(wú)顯著差異。發(fā)酵120 h后的菌液對(duì)上述病原菌的抑制率仍在70%以上。當(dāng)發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)分別為48、72 h時(shí)，菌液對(duì)Fo、Rs和Fs、Et的抑制作用有顯著減弱，但之后的抑制力下降趨勢(shì)減緩，并且無(wú)顯著差異。

2.4" 促生性能研究

2.4.1" 促生性能檢測(cè)結(jié)果" 菌株GCG3能夠固氮、分泌生長(zhǎng)激素IAA、產(chǎn)胞外多糖（EPS），但不具備溶磷、產(chǎn)鐵載體的能力（表5）。與固氮模式菌圓褐固氮菌（Ac）相比，菌株GCG3的固氮酶活性無(wú)顯著差異，固氮性能較強(qiáng)，產(chǎn)IAA顯色反應(yīng)明顯，EPS產(chǎn)量可達(dá)1 000 mg/L以上，具有較強(qiáng)的產(chǎn)EPS能力。

2.4.2" 菌株GCG3對(duì)盆栽玉米幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)和生物量的影響" 整體上看，接種GCG3可顯著促進(jìn)盆栽玉米幼苗的生長(zhǎng)；與對(duì)照相比，接種菌株GCG3的玉米幼苗株高、根長(zhǎng)、地上部干重、地下部干重分別較對(duì)照增加50.15%、43.24%、37.04%、30.12%（表6）。

2.4.3" 菌株GCG3在田間條件下對(duì)玉米生長(zhǎng)指標(biāo)和產(chǎn)量的影響" 在大田條件下，接種菌株GCG3對(duì)玉米的每株穗數(shù)、葉面積、千粒重?zé)o顯著影響，但可顯著促進(jìn)玉米株高生長(zhǎng)、增加每穗行數(shù)和粒數(shù)及地上部干重，縮短禿尖長(zhǎng)度，較大程度地提高玉米產(chǎn)量（表7）。與對(duì)照相比，株高、穗行數(shù)、穗粒數(shù)、地上部干重、產(chǎn)量分別提高9.35%、24.93%、17.65%、25.46%、29.13%，禿尖長(zhǎng)縮短了51.61%。

3" 結(jié)論與討論

由于植物根際土壤中存在著大量拮抗促生細(xì)菌，因此篩選拮抗促生細(xì)菌并對(duì)其進(jìn)行鑒定是開(kāi)發(fā)微生物資源的重要途徑。本研究前期在分離甘草根際固氮菌的過(guò)程中篩選得到1株兼具防病促生的

細(xì)菌GCG3，經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化特征及16S rRNA基因序列分析后，鑒定為節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）菌株。節(jié)桿菌是自然界中最常分離到的土壤細(xì)菌種類之一，常作為生物除污修復(fù)工具被廣泛關(guān)注［13］。目前，國(guó)內(nèi)外將節(jié)桿菌作為一種具有防病促生潛力的多功能植物根際促生菌的研究尚不多見(jiàn)。Ramlawi等研究發(fā)現(xiàn)，從堆肥中分離得到的腐殖質(zhì)節(jié)桿菌（Arthrobacter humicola）M9-1A、M9-2、M9-8 及嗜冷節(jié)桿菌M9-17菌株及細(xì)胞細(xì)菌無(wú)細(xì)胞濾液對(duì)9種植物病原菌均表現(xiàn)出不同的體外抑菌活性，除了M9-2外均能抑制番茄果實(shí)黑霉?。?4］。Geeta等從韓國(guó)水稻根際分離得到的節(jié)桿菌（Arthrobacter sp.）GN70能夠分泌生長(zhǎng)激素IAA，該菌能夠成功定殖至水稻根際并促進(jìn)水稻植株、側(cè)根生長(zhǎng)和重量增加，同時(shí)對(duì)十字花科黑腐病病原菌（Xanthomonas campestris）、水稻葉枯病病原菌（Pantoea agglomerans）、水稻穗腐病病原菌鐮刀菌（Fusarium proliferatum）和金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)出較好的抗菌活性［15］。Platamone等從杜鵑葉片中分離得到節(jié)桿菌（Arthrobacter sp. strain CD），將其接種于意大利抗旱作物梨果仙人掌種植土壤中后，能顯著促進(jìn)植株早發(fā)芽和結(jié)果，同時(shí)改善果實(shí)品質(zhì)［16］。郭麗麗等從稷山牡丹根際分離獲得的球形節(jié)桿菌PJ45具有顯著降解有機(jī)磷的能力。目前，尚未見(jiàn)從藥用植物甘草根際分離獲得具有抑菌促生特性節(jié)桿菌的報(bào)道［17］。

立枯絲核菌（Rs）、尖孢鐮刀菌（Fo）和腐皮鐮孢菌（Fs）、灰霉菌（Bc）分別是引起甘草絲核菌根腐病、鐮孢根腐病、葡萄孢灰霉病的主要病原菌［18］，核盤菌（Ss）、大斑凸臍蠕孢菌（Et）、茄鏈格孢（As）分別是引起油菜菌核病、玉米大斑病、番茄早疫病的主要病原菌。本研究結(jié)果表明，節(jié)桿菌GCG3菌體、不同濃度菌株發(fā)酵液和20%無(wú)細(xì)胞濾液對(duì)以上病原菌均具有不同程度的抑制作用，抑制率分別在52%、56%、40%以上，抑菌活性強(qiáng)度以油菜菌核病病原、甘草灰霉病病原最為明顯，抑制率均在70%以上，可認(rèn)為節(jié)桿菌GCG3是潛在的生防菌株。

菌體、發(fā)酵菌液和無(wú)細(xì)胞濾液的抑制活性強(qiáng)度整體表現(xiàn)為發(fā)酵菌液gt;菌體gt;無(wú)細(xì)胞濾液。當(dāng)濃度為5%、10%時(shí)，與菌液相比，無(wú)細(xì)胞濾液的抑制強(qiáng)度有較明顯的下降，特別是對(duì)引起甘草根腐病的2種病原菌Fo、Fs而言，20%菌液的抑制率為70%以上，而20%無(wú)細(xì)胞濾液的最高抑制率僅為40.74%，推測(cè)GCG3對(duì)上述病原菌的抑制作用是菌體及其產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)共同作用的結(jié)果。對(duì)尖孢鐮刀菌、腐皮鐮孢菌而言，菌體的作用要大于拮抗物質(zhì)的作用。因此，在實(shí)際生產(chǎn)中，可優(yōu)先考慮將GCG3菌液用于上述植物病原菌的生物防治。

節(jié)桿菌GCG3的生長(zhǎng)速度快，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為 24 h 時(shí)，菌液對(duì)上述病原的抑制作用最強(qiáng)，之后隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用整體呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)。原因可能是隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)菌自溶，從而引起菌體細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定及相關(guān)拮抗物質(zhì)數(shù)量的變化。從目前的實(shí)際情況看，發(fā)酵24 h的菌液即可實(shí)際應(yīng)用，后續(xù)可考察24 h前對(duì)數(shù)期與調(diào)整期抑菌活性的差異，從而進(jìn)一步縮短發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)，節(jié)約發(fā)酵成本。

植物根際益生菌可通過(guò)多種促生機(jī)制來(lái)刺激植物生長(zhǎng)，包括固氮、溶磷、分泌植物激素（IAA）和鐵載體的產(chǎn)生［19］。在本研究的盆栽與大田促生試驗(yàn)中，土壤鹽度屬中度鹽漬土［20］，盆栽與大田試驗(yàn)結(jié)果均表明，接種GCG3可顯著促進(jìn)玉米生長(zhǎng)，這可能與GCG3能夠耐受較高鹽堿、具有較強(qiáng)的固氮能力與分泌IAA的能力密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在非生物脅迫（干旱、溫度、鹽）下接種EPS產(chǎn)生菌，能夠顯著提高植物根部土壤團(tuán)聚體的穩(wěn)定性［21］。李慧芬等從海濱鹽堿植物根際篩選出1株高產(chǎn)EPS的芽孢桿菌，可在中度鹽堿土壤中促進(jìn)番茄生長(zhǎng)，并顯著降低土壤pH值、全鹽含量和土壤容重［22］。在本研究中，節(jié)桿菌GCG3兼具高產(chǎn)胞外多糖的能力，除了可用于抑菌促生外，其具有修復(fù)鹽堿土壤的潛力。

而另有研究推測(cè)，植物根際的微生物拮抗性可能與產(chǎn)胞外多糖性能有關(guān)［23］，胞外多糖能夠促進(jìn)根部生物膜的形成［24］，產(chǎn)胞外多糖的芽孢桿菌能夠通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)、拮抗和提高植物抗病性等方式抵御病原菌的入侵［25］，該菌株拮抗性與胞外多糖的相關(guān)性和作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究和驗(yàn)證。

綜上，從甘草根際分離的節(jié)桿菌GCG3具有廣譜抑菌活性，應(yīng)用于玉米種植可取得良好的促生效果，在生物防治、促生及鹽堿地改良中具有潛在應(yīng)用價(jià)值，可為復(fù)合功能菌劑與菌肥的研發(fā)和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供候選菌種資源和理論支撐。

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