玉米穗腐病致病南方鐮孢菌菌株JX18-4效應(yīng)蛋白的預(yù)測及分析

摘要：為挖掘與玉米受體蛋白互作進(jìn)而觸發(fā)免疫反應(yīng)的南方鐮孢菌效應(yīng)蛋白，基于南方鐮孢菌菌株JX18-4全基因組編碼蛋白序列，利用Signal P、WoLFP SORT、Target P、TMHMM和big PI Predictor等生物信息學(xué)軟件預(yù)測出分泌蛋白684個，隨后再用EffectorP軟件預(yù)測出效應(yīng)蛋白157個，隨后篩選出氨基酸殘基數(shù)lt;400且半胱氨酸殘基數(shù)≥4的效應(yīng)蛋白115個。植物與寄主互作（PHI）和碳水化合物酶類（CAZymes）分析結(jié)果表明，獲得PHI和CAZymes數(shù)據(jù)庫注釋的效應(yīng)蛋白數(shù)分別為14、26個。10個效應(yīng)蛋白獲得PHI和CAZymes 2個數(shù)據(jù)庫注釋，其中6個候選效應(yīng)蛋白的注釋結(jié)果一致。本研究所預(yù)測出的南方鐮孢菌菌株JX18-4效應(yīng)蛋白將會為南方鐮孢菌引起的玉米穗腐病的致病機(jī)制及防控方法研究提供了參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：南方鐮孢菌；玉米穗腐?。蝗蚪M；分泌蛋白；效應(yīng)蛋白

中圖分類號：S435.131.4+9" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）23-0124-05

蘇月貴，唐照磊，杜" 青，等. 玉米穗腐病致病南方鐮孢菌菌株JX18-4效應(yīng)蛋白的預(yù)測及分析［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2024，52（23）：124-128.

doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2024.23.017

收稿日期：2024-02-02

基金項(xiàng)目：廣西自然科學(xué)基金（編號：2020GXNSFAA297137）；廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技發(fā)展基金（編號：桂農(nóng)科2021JM39、桂農(nóng)科2022JM17）。

作者簡介：蘇月貴（1984—），男，廣西靈川人，碩士，助理研究員，從事玉米抗病性研究。E-mail：suyuegui@163.com。

通信作者：杜" 青，碩士，副研究員，從事玉米抗病性研究。E-mail：duq82@163.com。

穗腐病是玉米生產(chǎn)上的重要病害之一，在世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生，也是我國最常見的玉米真菌病害。鐮孢菌主要引起的2種類型的玉米穗腐病，分別為鐮孢穗腐?。‵usarium ear rot，簡稱 FER）和赤霉穗腐?。℅ibberella ear rot，簡稱GER）［1］，南方鐮孢（Fusarium meridionale）與禾谷鐮孢（F.graminearum）同為禾谷鐮孢復(fù)合種的不同發(fā)育種，均能引起 GER。在國外，由南方鐮孢引起的玉米穗腐病主要發(fā)生在氣候溫潤的巴西南部、阿根廷東北部和我國西南近鄰尼泊爾等地［2-4］；在我國，主要分布在西南玉米產(chǎn)區(qū)，如廣西、貴州、云南、四川、陜西、重慶等地，也是引起廣西玉米穗腐病的重要致病菌［5-7］。南方鐮孢穗腐病導(dǎo)致玉米產(chǎn)量損失和品質(zhì)下降，更重要的是收獲感染了該病菌的果穗，可能會導(dǎo)致真菌毒素如雪腐鐮刀菌烯醇（nivalenol，簡稱NIV）和赤霉烯酮（zearalenone，簡稱ZEA）的污染，給人畜的生命健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。

南方鐮孢喜好冷涼和濕度較高的環(huán)境，在22～28 ℃，開花期或收獲期遇到降雨、霧水等潮濕的環(huán)境有利于該病害的發(fā)生［7-8］。Machado等認(rèn)為，巴西南方鐮孢菌株的侵染力和競爭性要強(qiáng)于禾谷鐮孢，導(dǎo)致南方鐮孢相比禾谷鐮孢處于優(yōu)勢地位［2］。桂北是廣西的玉米主產(chǎn)區(qū)，具有冷涼、多山、多霧、多雨、寡照等氣候特點(diǎn)，適宜南方鐮孢生長繁殖，而玉米是該地區(qū)最主要的口糧作物之一，因此尤其需要重視該病害在該區(qū)域的防控，而選育抗性品種成為防控玉米穗腐病最經(jīng)濟(jì)和安全有效的方法［9］。

植物對病原菌的侵染存在2種類型的免疫機(jī)制，被稱為PTI（PAMP-triggered immunity）途徑和ETI（effector-triggered immunity）途徑［10］，當(dāng)病原菌侵染作物時(shí)，病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular paterns，PAMP）分子機(jī)制識別病原菌，啟動PTI免疫反應(yīng)，該防衛(wèi)反應(yīng)是系統(tǒng)性、廣譜性的，其烈度相對較弱，因此很多病原菌能夠突破植物的PTI免疫反應(yīng)而進(jìn)一步增殖。病原菌為了克服植物的本底防御反應(yīng)，在侵染植物時(shí)會分泌效應(yīng)蛋白（effector）來抑制植物免疫反應(yīng)使植物感病（effector-triggered susceptibility，ETS）。植物為了克服ETS反應(yīng)，進(jìn)化出了第2種防御機(jī)制ETI，即病原菌效應(yīng)蛋白誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。ETI反應(yīng)往往伴隨著植物超敏反應(yīng)的發(fā)生，是更劇烈的防衛(wèi)反應(yīng)，能夠在病原菌侵染點(diǎn)附近引起過敏性壞死反應(yīng)，導(dǎo)致植物細(xì)胞程序性死亡，從而將病原菌限制在侵染點(diǎn)，具有持久性、高效性。稻瘟菌的無毒基因與植物的抗病基因相互作用符合經(jīng)典的“基因?qū)颉崩碚?，病原菌侵入植物體內(nèi)釋放效應(yīng)蛋白，植物的抗性蛋白能夠特異性識別病原菌分泌的效應(yīng)蛋白，從而激活下游的免疫反應(yīng)［10］。

真菌效應(yīng)子大多具有以下特征：（1）氨基酸序列N端具有一段信號肽，定位在胞外；（2）無GPI錨定位點(diǎn)；（3）一般在侵染宿主前期階段活躍表達(dá)；（4）蛋白長度為50～400個氨基酸，并且含有大量的半胱氨酸殘基（Cys），這些參數(shù)常被用來預(yù)測真菌效應(yīng)蛋白［11-12］。研究者已經(jīng)開發(fā)出Signal P、WoLFP SORT、Target P、TMHMM、big PI Predictor等可以預(yù)測分泌蛋白的軟件，在此基礎(chǔ)上再用EffectorP軟件預(yù)測效應(yīng)子。

本研究前期從一個采自廣西靖西市的玉米病穗上單孢分離得到1株南方鐮孢菌菌株JX18-4，經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定后，采用FUSARIUM-ID v.3.0對引物延伸因子TEF-1α基因（NCBI登錄號：OR513044）進(jìn)行序列比對分析，明確其為南方鐮孢菌。隨后對該菌株進(jìn)行三代 Pacbio 和二代 Illumina 全基因組測序。本研究利用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行分泌蛋白和效應(yīng)蛋白的序列特征預(yù)測，并利用數(shù)據(jù)庫對預(yù)測到的效應(yīng)蛋白進(jìn)行注釋。以期為后續(xù)南方鐮孢菌引起的玉米穗腐病的致病機(jī)制及防控機(jī)制研究提供參考依據(jù)。

1" 材料與方法

1.1" 基因組信息

南方鐮孢菌菌株 JX18-4 分離自2019年秋季廣西靖西市玉米田玉米穗腐病發(fā)病果穗，全基因組蛋白信息來源于 NCBI（登錄號：PRJNA977470），下載地址為（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/GCA_032355295.1/），該南方鐮孢菌基因組共包含11 920個蛋白。

1.2" 分泌蛋白預(yù)測

參考文獻(xiàn)［11-12］中的方法，使用多種軟件對基因進(jìn)行預(yù)測分析。（1）使用SignalIP 5.0在線軟件（http：//www.Cbs.dtu.dk /services/SignalP /）預(yù)測分泌信號肽，保留有信號肽的基因。（2）使用SecretomeP軟件（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SecretomeP-2.0/）對缺乏信號肽的蛋白預(yù)測非經(jīng)典分泌蛋白（NN-scoregt;0.5）。（3）使用TargetP軟件TargetP v2.0（http：//www.cbs.dtu.dk /services/TargetP-2.0/）對SignalP和SecretomeP預(yù)測結(jié)果所保留的基因進(jìn)行TargetP分析，去除其中的線粒體蛋白。（4）利用TMHMM 2.0 sever（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對具有N-端信號肽且定位于胞外的蛋白質(zhì)進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域分析，僅保留跨膜結(jié)構(gòu)域數(shù)目≤1的蛋白質(zhì)。（5）使用WoLF PSORT軟件（https：//wolfpsort.hgc.jp/）進(jìn)行蛋白的亞細(xì)胞定位分析，選擇得分大于17的細(xì)胞外目的蛋白。（6）使用big-PI predictor（https：//mendel.imp.ac.at/gpi/gpi_server.html）分析錨定位點(diǎn)，無 GPI 錨定位點(diǎn)的蛋白為候選分泌蛋白。

1.3" 效應(yīng)蛋白的預(yù)測

對預(yù)測出的分泌蛋白進(jìn)一步進(jìn)行效應(yīng)子預(yù)測，利用EffectorP軟件（https：//effectorp.csiro.au/）預(yù)測分泌蛋白中的真菌的候選效應(yīng)蛋白。隨后篩選出氨基酸殘基數(shù)lt;400且半胱氨酸殘基數(shù)≥4的效應(yīng)蛋白［13］。

1.4" PHI 及CAZymes基因注釋

基于 PHI（Pathogen-Host Interaction database，http：/ /www.phi-base.org /downloadLink.Htm）數(shù)據(jù)庫，對預(yù)測到的效應(yīng)子進(jìn)行植物病原互作相關(guān)基因注釋，同時(shí)，利用CAZymes（Carbohydrate-Active enzymes，CAZymes，http：//www.cazy.org/）對分泌蛋白、候選效應(yīng)蛋白與碳水化合物酶類序列進(jìn)行BlastP同源性比對。優(yōu)先關(guān)注E-value最低、 比對得分（score）最高的注釋，同時(shí)關(guān)注注釋基因的功能描述。

2" 結(jié)果與分析

2.1" 南方鐮孢菌分泌蛋白預(yù)測

對利用SignalIP 5.0南方鐮孢菌菌株JX18-4預(yù)測出的11 920個蛋白質(zhì)進(jìn)行信號肽預(yù)測，具有N端信號肽的蛋白序列有1 248個，這些蛋白屬于典型的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/高爾基體途徑進(jìn)行運(yùn)輸，并最終分泌到細(xì)胞外SP（Sec/SPI）型經(jīng)典分泌蛋白。為不遺漏不具備信號肽特征卻能分泌到細(xì)胞外發(fā)揮功能的非經(jīng)典分泌蛋白，SecretomeP軟件分析結(jié)果顯示，NN-score分值高于0.5的蛋白序列為5 602個。SignalIP和SecretomeP軟件分析所得的共6 850個蛋白序列采用TargetP v2.0軟件預(yù)測蛋白的亞細(xì)胞定位，去除定位在線粒體上的蛋白后，共獲得5 868個蛋白序列。采用TMHMM v2.0軟件對上述蛋白序列進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域分析，751個蛋白序列具有2個以上跨膜區(qū)，即分泌到其他細(xì)胞器的蛋白，僅保留跨膜結(jié)構(gòu)域數(shù)≤1的蛋白序列5 117個。利用WoLF PSORT對含有上述蛋白序列進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，794個蛋白得分大于17，是分泌到細(xì)胞外的目的蛋白。最后用big-PI predictor軟件排除含有錨定位點(diǎn)的蛋白序列，最終獲得684個分泌蛋白（圖1）。684個分泌蛋白中，635個蛋白是具有信號肽序列特征，占比92.84%，另外49個是不具備信號肽特征序列的非經(jīng)典分泌蛋白，占比7.16%。

2.2" 效應(yīng)蛋白的篩選

利用EffectorP軟件預(yù)測分泌蛋白中的真菌效應(yīng)蛋白，不是效應(yīng)子的蛋白序列405個，剔除掉篩選出不大可能是效應(yīng)子的蛋白序列22個［可能性（probability）值lt;0.55］，預(yù)測出效應(yīng)子157個（probability值≥0.55），這些效應(yīng)蛋白的可能性probability為0.553～0.984不等。大多數(shù)已知效應(yīng)蛋白氨基酸殘基較少且富含半胱氨酸，且缺乏保守的氨基酸序列特征，真菌效應(yīng)蛋白的預(yù)測一般采用相對寬泛的標(biāo)準(zhǔn)［13］。不同研究往往采用的參數(shù)指標(biāo)并不一致，本研究以蛋白序列長度小于400個氨基酸且半胱氨酸殘基數(shù)≥4的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步篩選效應(yīng)蛋白［11，13］，最終獲得115個符合要求的效應(yīng)蛋白（圖1）。

2.3" PHI和CAZymes注釋分析

從“2.2”節(jié)中得到的115個效應(yīng)蛋白序列，僅14個獲得PHI數(shù)據(jù)庫注釋（表1）。其中注釋為無毒效應(yīng)子的3個， 均與稻瘟病菌誘導(dǎo)過敏性反應(yīng)相

關(guān)；注釋為基因敲除突變體后毒力減弱的基因7個；注釋為基因敲除后突變體無致病力變化的4個。

684個分泌蛋白，獲得CAZymes注釋的基因?yàn)?02個。碳水化合物結(jié)合模塊（carbohydrate-binding module，CBM）家族基因最多，為84個，糖苷水解酯酶（glycoside hydrolases，GH）家族基因次之，為78個，輔助氧化還原酶類（auxiliary activities，AA）家族基因23個，碳水化合物酯酶（carbohydrate esterases，CE）家族基因16個，多糖裂解酶（polysaccharide lyases，PL）家族基因僅1個（表2）。115個候選效應(yīng)蛋白中，CBM家族基因最多，為11個，CE家族基因次之，為10個，GH家族基因?yàn)?個，AA家族基因?yàn)?個，PL家族基因未獲得注釋（表2）。

表2" JX18-4菌株分泌蛋白和效應(yīng)蛋白的CAZymes家族蛋白數(shù)

類型數(shù)量（個）CBMGHAACEPL總計(jì)

分泌蛋白847823161202

候選效應(yīng)蛋白113210026

10 個效應(yīng)蛋白獲得PHI和CAZymes 2個數(shù)據(jù)庫注釋，6個基因的注釋基因功能一致，例如JX18-4_002683的基因功能為糖苷水解酶，JX18-4_004928、JX18-4_005073、JX18-4_010703注釋為果膠裂解酶，JX18-4_005366注釋為果膠酯酶，JX18-4_008860注釋為阿魏酸酯酶。

3" 討論

本研究基于南方鐮孢菌株JX18-4的全基因組測序后的序列分析，共預(yù)測到115個效應(yīng)蛋白，其中獲得PHI數(shù)據(jù)注釋的效應(yīng)蛋白為14個，獲得CAZymes注釋的基因?yàn)?6個，這可能是由于大量真菌效應(yīng)子還未被發(fā)掘和報(bào)道，植物病原真菌效應(yīng)蛋白與寄主植物的互作機(jī)制研究報(bào)道還極不充分。14個PHI數(shù)據(jù)庫注釋的效應(yīng)蛋白中，10個被CAZymes數(shù)據(jù)庫注釋，其中6個基因的注釋功能一致，說明本注釋結(jié)果具有較好的一致性。這些已報(bào)道、注釋到的基因在其他物種上影響著病害的發(fā)生程度，其是否影響玉米穗腐病的致病情況有待進(jìn)一步進(jìn)行研究。利用高通量測序技術(shù)預(yù)測分泌蛋白和效應(yīng)蛋白，能極大程度地為后續(xù)研究進(jìn)行前期篩選。隨著病原真菌和植物寄主間的互作機(jī)理研究逐漸深入，大量病原菌效應(yīng)蛋白將會不斷被鑒定和報(bào)道，合理利用預(yù)測出的115個南方鐮孢效應(yīng)蛋白序列，與已報(bào)道、影響致病力的效應(yīng)蛋白序列進(jìn)行序列比對，將有利于闡明南方鐮孢菌與玉米的互作機(jī)制。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，真菌全基因組測序價(jià)格快速降低，基于全基因組測序后的真菌效應(yīng)蛋白預(yù)測，能大大加快真菌效應(yīng)蛋白的挖掘進(jìn)程。

JX18-4_002683、JX18-4_003263和JX18-4_005485共3個基因注釋為無毒效應(yīng)蛋白，誘導(dǎo)過敏性壞死反應(yīng)。JX18-4_002683注釋到的基因MoCDIP4作用是誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，包含1個糖基水解酶家族結(jié)構(gòu)域和1個真菌纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，C末端的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域在誘導(dǎo)細(xì)胞死亡中具有重要的功能［14］。JX18-4_003263注釋到的稻瘟病病菌基因MgSM1，無論是在真菌生長還是在水稻的初侵染過程中都能組成型表達(dá)，在擬南芥中通過上調(diào)防衛(wèi)基因的表達(dá)引起葉片的過敏性反應(yīng)［15］。JX18-4_005655注釋到的MoCDIP1基因的N端PbH1 motif基序功能為誘導(dǎo)植物細(xì)胞過敏性壞死［14］。這3個基因作為稻瘟病菌的無毒基因，侵入寄主細(xì)胞后，可能與植物細(xì)胞中的R基因發(fā)生互作，可誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生過敏性壞死反應(yīng)，從而導(dǎo)致寄主抗病。然而，南方鐮孢菌作為玉米穗腐病、玉米莖腐病、小麥赤霉病、水稻赤霉病和大豆莢枯?。?-7，16］的致病菌，是否會在玉米葉片、莖稈、籽粒組織中引起ETI免疫應(yīng)答反應(yīng)還尚待后續(xù)驗(yàn)證。廣西玉米育種家當(dāng)前極缺乏玉米赤霉穗腐病優(yōu)異抗源，筆者所在項(xiàng)目組前期已經(jīng)鑒定出CML287、CML362等極少量抗南方鐮孢菌穗腐病的玉米自交系，但其抗病機(jī)制尚不明確，從抗病自交系中發(fā)掘出與無毒效應(yīng)子互作的抗病基因，合理利用其劇烈的ETI防衛(wèi)反應(yīng)機(jī)制，對于玉米抗穗腐病育種具有重要價(jià)值。

玉米籽粒中富含淀粉，主要存在于玉米胚乳中，纖維素主要存在于玉米的種皮和內(nèi)皮中，果膠作為一種半乳糖醛酸的聚合多糖，存在于玉米的種皮或細(xì)胞壁中。注釋到的部分效應(yīng)蛋白為潛在的淀粉、纖維素、果膠等物質(zhì)降解酶。植物病原真菌分泌到胞外的碳水化物酶是一類重要的活性蛋白，依據(jù)這些酶的氨基酸序列的保守結(jié)構(gòu)域，將這些活性酶歸入不同的蛋白質(zhì)家族，其功能結(jié)構(gòu)域可能通過作用于寄主的糖復(fù)合物、寡糖和多糖等方式，從而降解玉米籽粒中的多種物質(zhì)。26個獲得CAZymes注釋的效應(yīng)蛋白中，碳水化合物結(jié)合模塊（CBM）家族11個，碳水化合物酯酶（CE）家族11個。JX18-4_004928、JX18-4_005073和JX18-4_010703等3個基因的PHI和CAZymes數(shù)據(jù)庫注釋均為果膠裂解酶，CAZymes數(shù)據(jù)庫注釋均為CBM1亞家族，CBM1亞家族被稱為纖維素結(jié)合模塊蛋白，例如，里氏木霉的Cel7A酶中含有該蛋白，EC分類號為3.2.1.176，其底物為纖維素［17］。

南方鐮孢與禾谷鐮孢為禾谷鐮孢復(fù)合種的不同發(fā)育種［5］，禾谷鐮孢菌模式菌株P(guān)H-1與本研究中南方鐮孢菌菌株JX18-4具有極高的共線性關(guān)系（另文發(fā)表），利用已報(bào)道禾谷鐮孢菌致病相關(guān)基因與南方鐮孢菌菌株JX18-4進(jìn)行序列比對，基因預(yù)測會更為準(zhǔn)確。PHI數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果顯示，3個效應(yīng)蛋白的E-value值為0，JX18-4_005655、JX18-4_007996和JX18-4_008860對應(yīng)的物種均為禾谷鐮孢菌，說明這3個效應(yīng)蛋白與注釋基因高度同源。只有JX18-4_007996注釋基因FGL1明確為侵染小麥赤霉病和玉米穗腐病的毒力因子，具有細(xì)胞外脂肪酶分解活性［18］。然而，禾谷鐮孢效應(yīng)蛋白與玉米靶標(biāo)蛋白互作調(diào)控玉米穗腐病抗性機(jī)制的報(bào)道尚不充分，亦未見南方鐮孢菌效應(yīng)蛋白相關(guān)的報(bào)道。本研究所預(yù)測出的115個南方鐮孢菌效應(yīng)蛋白，可能對禾谷鐮孢菌引起的病害亦具有一定參考價(jià)值。

前人的研究已成功定位了大量玉米抗禾谷鐮孢菌引起的赤霉穗腐病QTL［19］，卻未見明確抗赤霉穗腐病基因的相關(guān)報(bào)道。這可能是由于玉米的基因組較大，采用常規(guī)QTL定位方法，抗病QTL定位區(qū)間往往過大且表型解釋率較低，難以聚焦到寄主中與效應(yīng)蛋白互作的、免疫反應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)。為了闡明玉米抗病基因與鐮孢菌的互作機(jī)制，鑒定并明確南方鐮孢效應(yīng)蛋白，通過酵母雙雜交技術(shù)，利用效應(yīng)蛋白作為誘餌，篩選與效應(yīng)蛋白互作的玉米靶標(biāo)蛋白，縮小候選抗病基因的篩選范圍。本研究結(jié)果可為南方鐮孢效應(yīng)蛋白與玉米靶標(biāo)蛋白互作機(jī)制、抗玉米穗腐病基因的挖掘及分子育種奠定基礎(chǔ)。

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