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    雙氫青蒿素對(duì)甲狀腺未分化癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響

    2024-12-04 00:00:00李洪軍步翠平張小琴劉金龍劉愛(ài)玲
    大醫(yī)生 2024年22期

    【摘要】目的 觀察雙氫青蒿素(DHA)對(duì)甲狀腺未分化癌(ATC)細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響,為臨床提供參考。方法 取人ATC細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng),分為對(duì)照組與DHA組,其中DHA組根據(jù)DHA干預(yù)劑量不同,分為5、10、20、40、80和160 μmol/L DHA亞組。觀察DHA對(duì)ATC細(xì)胞形態(tài)的影響,采用細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)試劑盒-8(CKK-8)、Transwell小室檢測(cè)DHA對(duì)ATC細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的影響;以流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)DHA對(duì)ATC細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果 10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用24 、48 、72 及96 h后,對(duì)照組ATC細(xì)胞正常生長(zhǎng),5、10和20 μmol/L DHA組ATC細(xì)胞形態(tài)變化不明顯,40、80和160 μmol/L DHA組ATC細(xì)胞密度變得明顯稀疏,出現(xiàn)細(xì)胞離壁,腫脹,胞膜和胞體破裂分解,細(xì)胞死亡等情況。10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用24 、48 及72 h后,ATC細(xì)胞的吸光度(OD)值均低于對(duì)照組,5 μmol/L DHA組藥液作用48 、72 h后,ATC細(xì)胞的OD值均低于對(duì)照組(均P<0.05)。5、10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細(xì)胞的遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)均少于對(duì)照組(均P<0.05)。5、10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細(xì)胞晚期凋亡率均高于對(duì)照組(均P<0.05);5、10和20 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細(xì)胞早期凋亡率與對(duì)照組比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05);40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細(xì)胞早期凋亡率均高于對(duì)照組(均P<0.05)。結(jié)論 DHA可明顯抑制ATC細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移并誘導(dǎo)其凋亡,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)抑制ATC的作用。

    【關(guān)鍵詞】雙氫青蒿素;甲狀腺未分化癌細(xì)胞;增殖;侵襲;遷移;凋亡

    【中圖分類號(hào)】R736.1 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2096-2665.2024.22.0029.04

    DOI:10.3969/j.issn.2096-2665.2024.22.010

    甲狀腺未分化癌(anaplastic thyroid carcinoma,ATC)惡性程度高,腫瘤生長(zhǎng)速度快,侵襲性強(qiáng),預(yù)后較差。有研究顯示,ATC發(fā)病率有升高趨勢(shì)[1],嚴(yán)重威脅患者生命安全。近年來(lái),有關(guān)ATC治療方案不斷優(yōu)化,但仍有部分ATC患者出現(xiàn)攝碘能力異常,表現(xiàn)出極強(qiáng)的細(xì)胞侵襲性和較高的轉(zhuǎn)移率,嚴(yán)重影響治療效果[2]。因此,積極研發(fā)新的ATC治療藥物對(duì)改善患者預(yù)后具有重要意義。雙氫青蒿素(DHA)是采用硼氫化納將青蒿素還原而生成的一種衍生物,具有強(qiáng)大的抗瘧作用,既往多用于寄生蟲(chóng)病的治療中,已成為治療惡性瘧疾的特效藥,此外,DHA還具有生物利用度高、毒性較低、吸收快、排泄迅速和適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)[3]。隨著臨床應(yīng)用推廣和研究深入,有研究顯示,DHA具有抗腫瘤作用,在肝癌、肺癌和腸癌等惡性腫瘤中表現(xiàn)出良好的抗腫瘤效果[4-5]。但有關(guān)DHA在ATC中的應(yīng)用還較為少見(jiàn)?;诖?,本研究觀察DHA對(duì)人ATC細(xì)胞的作用效果,初步探討DHA對(duì)ATC的治療作用,現(xiàn)報(bào)道如下。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料 人ATC細(xì)胞株(上海研謹(jǐn)生物科技有限公司,批號(hào):YJ-h443);WE培養(yǎng)基[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司,型號(hào):12551032]和胎牛血清[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司,型號(hào):A5669701],0.22 μm微孔濾膜,細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板(6孔、12孔、24孔和96孔等),細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)試劑盒(CKK)-8(山東思科捷生物技術(shù)有限公司,型號(hào):CT0001-B)、二甲基亞砜(DMSO)(北京索萊寶科技有限公司,型號(hào):D8371)、曲拉通X-100(Sigma-aldrich,型號(hào):T8787),Transwell小室(美國(guó)Costar公司,型號(hào):CLS3422),Matrigel基質(zhì)膠(上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司,型號(hào):C0396)和膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)試劑盒(碧迪生物科學(xué)公司,型號(hào):556547)。

    1.2 研究方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及含藥培養(yǎng)基的配制 ATC細(xì)胞快速?gòu)?fù)蘇后接種在含有100 mL/L胎牛血清的WE培養(yǎng)基中(含青霉素100 kU/L,鏈霉素100 mg/L),常規(guī)培養(yǎng)、消化、傳代;實(shí)驗(yàn)均用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。電子天平稱取DHA溶于DMSO,配制各藥物濃度分別為5、10、20、40、80、160 μmol/L DHA藥液,經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾、分裝后保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 觀察DHA對(duì)ATC細(xì)胞形態(tài)的影響 在37 ℃、5% CO2的條件下,ATC細(xì)胞培養(yǎng)液配成單細(xì)胞懸液,每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中;培養(yǎng)24 h后移除細(xì)胞培養(yǎng)液,分別加入5、10、20、40、80、160 μmol/L DHA藥液各30 μL,培養(yǎng)24、48、72、96 h后經(jīng)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

    1.2.3 DHA對(duì)ATC細(xì)胞增殖的抑制作用 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ATC細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),配制成3×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。取100 μL的ATC細(xì)胞懸液接種至96孔培養(yǎng)板(3×103個(gè)/孔),經(jīng)24 h培養(yǎng)使其貼壁,移除細(xì)胞培養(yǎng)液,分別加入5、10、20、40、80、160 μmol/L DHA藥液,培養(yǎng)24、48、72 h后,加入10 μL CKK溶液,于37 ℃下作用4 h,采用酶標(biāo)儀(北京宏潤(rùn)達(dá)科技發(fā)展有限公司,京械注準(zhǔn)20162220432,型號(hào):ZS-2)于450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度(OD)值。

    1.2.4 DHA對(duì)ATC細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響 采用Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ATC細(xì)胞的侵襲能力。于4 ℃解凍Matrigel過(guò)夜,采用細(xì)胞培養(yǎng)液WE按1∶5稀釋,平鋪在Transwell小室的濾膜上,50 μL/膜,于37 ℃放置30 min,便于基底膜膠發(fā)生凝固,采用生理鹽水浸浴水化小室膜30 min待用。于Transwell下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液,DHA組上室分別加入5、10、20、40、80、160 μmol/L DHA藥液400 μL,對(duì)照組上室加入無(wú)DHA藥物的血清WE培養(yǎng)基溶液400 μL,培養(yǎng)24 h后,用棉簽擦去上室面的細(xì)胞,固定,采用1 g/L的結(jié)晶紫染液(北京索萊寶科技有限公司,型號(hào):CR202211004766)染色,在的生物顯微鏡[蔡司科技(蘇州)有限公司,蘇械注準(zhǔn)20202220363,型號(hào):Axiolab 5](200×)下觀察并拍照,并隨機(jī)挑選6個(gè)視野進(jìn)行穿膜細(xì)胞計(jì)數(shù)。采用遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ATC細(xì)胞的遷移能力,操作步驟參照Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn),除Transwell小室的上室底部不鋪設(shè)基質(zhì)膠外,其余的操作步驟和方法均相同。

    1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)ATC細(xì)胞凋亡結(jié)果 采用雙熒光標(biāo)記法檢測(cè)不同濃度DHA藥液作用后的ATC細(xì)胞的凋亡情況。具體步驟按照AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。每組取1 mL細(xì)胞懸液分別加入5 μL AnnexinV-FITC和10 μL PI混勻后避光標(biāo)記10 min,采用流式細(xì)胞儀(碧迪公司,型號(hào):BD FACSCalibur)進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。凋亡率=象限內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%,流式細(xì)胞儀檢測(cè)圖右上象限為晚期凋亡細(xì)胞,右下象限為早期凋亡細(xì)胞。

    1.3 觀察指標(biāo) ⑴分析DHA 對(duì)ATC細(xì)胞形態(tài)的影響。⑵分析DHA 對(duì) ATC細(xì)胞增殖的抑制作用。⑶分析DHA對(duì)ATC細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響。⑷觀察DHA對(duì)ATC細(xì)胞凋亡的影響。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)量資料以(x)表示,多組間比較采用F檢驗(yàn),其兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 DHA對(duì)ATC細(xì)胞形態(tài)的影響 10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用24、48、72及96 h后,對(duì)照組ATC細(xì)胞正常生長(zhǎng),5、10和20 μmol/L DHA組ATC細(xì)胞形態(tài)變化不明顯,40、80和160 μmol/L DHA組ATC細(xì)胞密度變得明顯稀疏,出現(xiàn)細(xì)胞離壁,腫脹,胞膜和胞體破裂分解,細(xì)胞死亡等情況。

    2.2 DHA對(duì)ATC細(xì)胞增殖的抑制作用 10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用24、48 及72 h后,ATC細(xì)胞的OD值均低于對(duì)照組,5 μmol/L DHA組藥液作用48、72 h后,ATC細(xì)胞的OD值均低于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見(jiàn)表1。

    2.3 DHA對(duì)ATC細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響 5、10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細(xì)胞的遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)均少于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見(jiàn)表2。

    2.4 DHA對(duì)ATC細(xì)胞凋亡的影響 5、10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細(xì)胞晚期凋亡率均高于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);5、10和20 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細(xì)胞早期凋亡率與對(duì)照組比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05),40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細(xì)胞早期凋亡率均高于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見(jiàn)表3。

    3 討論

    ATC的兩大標(biāo)志性惡性生物學(xué)行為包括血管生成和組織侵襲,是造成ATC預(yù)后極差的原因之一,主要表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞迅速生長(zhǎng)、較早發(fā)生致命性的局部侵襲和轉(zhuǎn)移[6]。DHA是倍半萜內(nèi)酯類化合物,具有強(qiáng)大的抗瘧作用,還可抑制腫瘤相關(guān)蛋白表達(dá),下調(diào)絲裂素活化蛋白激酶、胞外信號(hào)調(diào)控激酶等信號(hào)通路,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,既往已有多項(xiàng)報(bào)道證實(shí)DHA對(duì)肺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤具有抑制作用[7-8],這為臨床抗癌新藥的研發(fā)提供方向。但有關(guān)DHA在ATC中的應(yīng)用還較為少見(jiàn)。因此,本研究觀察DHA對(duì)人ATC細(xì)胞的作用效果,分析DHA對(duì)ATC的治療作用。

    本研究結(jié)果顯示,10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用24、48、72及96 h后,對(duì)照組ATC細(xì)胞正常生長(zhǎng),5、10和20 μmol/L DHA組細(xì)胞形態(tài)變化不明顯,40、80和160 μmol/L DHA組細(xì)胞密度變得明顯稀疏,出現(xiàn)細(xì)胞離壁,腫脹,胞膜和胞體破裂分解,細(xì)胞死亡等情況。這提示DHA對(duì)ATC細(xì)胞具有毒性作用,隨著DHA濃度的增加,ATC細(xì)胞的形態(tài)變化越明顯,細(xì)胞死亡率也越高。分析原因?yàn)?,DHA可能通過(guò)干擾鐵代謝、促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化、調(diào)控信號(hào)通路和改變基因表達(dá)等機(jī)制,誘導(dǎo)ATC細(xì)胞發(fā)生鐵死亡,從而改變其形態(tài)[9]。本研究結(jié)果顯示,10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用24、48 及72 h后,ATC細(xì)胞的OD值均低于對(duì)照組,5 μmol/L DHA組藥液作用48、72 h后,ATC細(xì)胞的OD值均低于對(duì)照組;5、10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細(xì)胞的遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)均少于對(duì)照組,這提示DHA可顯著抑制ATC細(xì)胞增殖、侵襲、遷移。分析原因?yàn)?,凋亡和壞死是?xì)胞死亡的方式,細(xì)胞凋亡是機(jī)體發(fā)育過(guò)程中基因調(diào)控下的細(xì)胞程序性死亡,惡性腫瘤的重要生物學(xué)特征為細(xì)胞的凋亡受阻和過(guò)度細(xì)胞增殖[10]。DHA能阻斷Wnt/β-catenin蛋白信號(hào)通路,并增強(qiáng)糖原合酶激酶的催化活性,抑制甲狀腺腫瘤細(xì)胞分化、增殖。此外,DHA可與ATC細(xì)胞內(nèi)亞鐵離子結(jié)合,直接破壞ATC細(xì)胞,抑制ATC細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力[11]。本研究結(jié)果顯示,5、10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細(xì)胞晚期凋亡率均高于對(duì)照組;5、10和20 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細(xì)胞早期凋亡率與對(duì)照組比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細(xì)胞早期凋亡率均高于對(duì)照組,這提示DHA可誘導(dǎo)ATC細(xì)胞凋亡。分析原因?yàn)?,DHA能抑制核因子κB(NF-κB)蛋白表達(dá),破壞腫瘤細(xì)胞膜與蛋白質(zhì),誘導(dǎo)DNA損傷,進(jìn)而抑制腫瘤血管生長(zhǎng),達(dá)到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡目的,且DHA抗腫瘤作用可能具有劑量依賴性[12]。這也證實(shí)DHA有望成為甲狀腺未分化癌治療藥物,但其具體機(jī)制和臨床應(yīng)用還有待今后深入探討。

    綜上所述,DHA可明顯抑制ATC細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力并誘導(dǎo)其發(fā)生細(xì)胞凋亡,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)抑制甲狀腺腫瘤的作用。

    參考文獻(xiàn)

    李斐,李舍予.全球甲狀腺癌疾病負(fù)擔(dān)[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué), 2018, 21(26): 3155-3159.

    周一坤,施秉銀.對(duì)甲狀腺未分化癌生物學(xué)行為的再認(rèn)識(shí)[J].中華醫(yī)學(xué)雜志, 2023, 103(5): 375-377.

    YANG S, ZHANG D, SHEN N, et al. Dihydroartemisinin increases gemcitabine therapeutic efficacy in ovarian cancer by inducing reactive oxygen species[J]. J Cell Biochem, 2019, 120(1): 634-644.

    周許薇,譚蔚鋒,解方園,等.雙氫青蒿素抗癌藥理作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志, 2019, 37(3): 206-211, 278.

    孫卉,陳曉靜,劉麗,等.雙氫青蒿素通過(guò)PI3K/Akt通路逆轉(zhuǎn)肺癌順鉑耐藥A549/DDP細(xì)胞的分子機(jī)制[J].中國(guó)藥師, 2021, 24(6): 1013-1017.

    RAMMAL R, WASSERMAN J K, SINGHI A D, et al. Glomangiosarcoma-like anaplastic transformation in papillary thyroid carcinoma: A novel form of heterologous differentiation and a systematic review of heterologous element prevalence[J]. Endocr Pathol, 2023, 34(4): 471-483.

    胡冰琪,周靜,黃俊峰,等.雙氫青蒿素抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞遷移侵襲和血管生成擬態(tài)的初步研究[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2023, 58(5): 766-771.

    周駟杰,劉思豪,楊嘉昕,等.雙氫青蒿素誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞焦亡及調(diào)控凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白甲基化[J].陸軍軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2022, 44(14): 1421-1430.

    董佳悅,李樹(shù)杰,王艷,等.雙氫青蒿素和索拉非尼誘導(dǎo)未分化甲狀腺癌鐵死亡的協(xié)同機(jī)制[J]. 中華內(nèi)分泌代謝雜志, 2023, 39(7): 596-604.

    潘宗富,方琦璐,張軼雯,等.基于生物信息學(xué)的未分化甲狀腺癌惡性機(jī)制研究[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué), 2018, 35(11): 1606-1612

    PACCEZ J D, DUNCAN K, SEKAR D, et al. Correction: Dihydroartemisinin inhibits prostate cancer via JARID2/miR-7/miR-34a-dependent downregulation of Axl[J]. Oncogenesis, 2024, 13(1): 32.

    費(fèi)偉東,葉軼青,陳玥,等.雙氫青蒿素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞鐵死亡及其機(jī)制研究[J].中草藥, 2020, 51(13): 3473-3481.

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