• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    雙氫青蒿素對(duì)甲狀腺未分化癌細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響

    2024-12-04 00:00:00李洪軍步翠平張小琴劉金龍劉愛(ài)玲
    大醫(yī)生 2024年22期

    【摘要】目的 觀察雙氫青蒿素(DHA)對(duì)甲狀腺未分化癌(ATC)細(xì)胞增殖、侵襲、遷移及凋亡的影響,為臨床提供參考。方法 取人ATC細(xì)胞株進(jìn)行培養(yǎng),分為對(duì)照組與DHA組,其中DHA組根據(jù)DHA干預(yù)劑量不同,分為5、10、20、40、80和160 μmol/L DHA亞組。觀察DHA對(duì)ATC細(xì)胞形態(tài)的影響,采用細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)試劑盒-8(CKK-8)、Transwell小室檢測(cè)DHA對(duì)ATC細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力的影響;以流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)DHA對(duì)ATC細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果 10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用24 、48 、72 及96 h后,對(duì)照組ATC細(xì)胞正常生長(zhǎng),5、10和20 μmol/L DHA組ATC細(xì)胞形態(tài)變化不明顯,40、80和160 μmol/L DHA組ATC細(xì)胞密度變得明顯稀疏,出現(xiàn)細(xì)胞離壁,腫脹,胞膜和胞體破裂分解,細(xì)胞死亡等情況。10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用24 、48 及72 h后,ATC細(xì)胞的吸光度(OD)值均低于對(duì)照組,5 μmol/L DHA組藥液作用48 、72 h后,ATC細(xì)胞的OD值均低于對(duì)照組(均P<0.05)。5、10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細(xì)胞的遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)均少于對(duì)照組(均P<0.05)。5、10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細(xì)胞晚期凋亡率均高于對(duì)照組(均P<0.05);5、10和20 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細(xì)胞早期凋亡率與對(duì)照組比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05);40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細(xì)胞早期凋亡率均高于對(duì)照組(均P<0.05)。結(jié)論 DHA可明顯抑制ATC細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移并誘導(dǎo)其凋亡,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)抑制ATC的作用。

    【關(guān)鍵詞】雙氫青蒿素;甲狀腺未分化癌細(xì)胞;增殖;侵襲;遷移;凋亡

    【中圖分類號(hào)】R736.1 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2096-2665.2024.22.0029.04

    DOI:10.3969/j.issn.2096-2665.2024.22.010

    甲狀腺未分化癌(anaplastic thyroid carcinoma,ATC)惡性程度高,腫瘤生長(zhǎng)速度快,侵襲性強(qiáng),預(yù)后較差。有研究顯示,ATC發(fā)病率有升高趨勢(shì)[1],嚴(yán)重威脅患者生命安全。近年來(lái),有關(guān)ATC治療方案不斷優(yōu)化,但仍有部分ATC患者出現(xiàn)攝碘能力異常,表現(xiàn)出極強(qiáng)的細(xì)胞侵襲性和較高的轉(zhuǎn)移率,嚴(yán)重影響治療效果[2]。因此,積極研發(fā)新的ATC治療藥物對(duì)改善患者預(yù)后具有重要意義。雙氫青蒿素(DHA)是采用硼氫化納將青蒿素還原而生成的一種衍生物,具有強(qiáng)大的抗瘧作用,既往多用于寄生蟲(chóng)病的治療中,已成為治療惡性瘧疾的特效藥,此外,DHA還具有生物利用度高、毒性較低、吸收快、排泄迅速和適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)[3]。隨著臨床應(yīng)用推廣和研究深入,有研究顯示,DHA具有抗腫瘤作用,在肝癌、肺癌和腸癌等惡性腫瘤中表現(xiàn)出良好的抗腫瘤效果[4-5]。但有關(guān)DHA在ATC中的應(yīng)用還較為少見(jiàn)?;诖?,本研究觀察DHA對(duì)人ATC細(xì)胞的作用效果,初步探討DHA對(duì)ATC的治療作用,現(xiàn)報(bào)道如下。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料 人ATC細(xì)胞株(上海研謹(jǐn)生物科技有限公司,批號(hào):YJ-h443);WE培養(yǎng)基[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司,型號(hào):12551032]和胎牛血清[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司,型號(hào):A5669701],0.22 μm微孔濾膜,細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板(6孔、12孔、24孔和96孔等),細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)試劑盒(CKK)-8(山東思科捷生物技術(shù)有限公司,型號(hào):CT0001-B)、二甲基亞砜(DMSO)(北京索萊寶科技有限公司,型號(hào):D8371)、曲拉通X-100(Sigma-aldrich,型號(hào):T8787),Transwell小室(美國(guó)Costar公司,型號(hào):CLS3422),Matrigel基質(zhì)膠(上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司,型號(hào):C0396)和膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)試劑盒(碧迪生物科學(xué)公司,型號(hào):556547)。

    1.2 研究方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及含藥培養(yǎng)基的配制 ATC細(xì)胞快速?gòu)?fù)蘇后接種在含有100 mL/L胎牛血清的WE培養(yǎng)基中(含青霉素100 kU/L,鏈霉素100 mg/L),常規(guī)培養(yǎng)、消化、傳代;實(shí)驗(yàn)均用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞。電子天平稱取DHA溶于DMSO,配制各藥物濃度分別為5、10、20、40、80、160 μmol/L DHA藥液,經(jīng)微孔濾膜過(guò)濾、分裝后保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 觀察DHA對(duì)ATC細(xì)胞形態(tài)的影響 在37 ℃、5% CO2的條件下,ATC細(xì)胞培養(yǎng)液配成單細(xì)胞懸液,每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中;培養(yǎng)24 h后移除細(xì)胞培養(yǎng)液,分別加入5、10、20、40、80、160 μmol/L DHA藥液各30 μL,培養(yǎng)24、48、72、96 h后經(jīng)倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

    1.2.3 DHA對(duì)ATC細(xì)胞增殖的抑制作用 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ATC細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù),配制成3×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。取100 μL的ATC細(xì)胞懸液接種至96孔培養(yǎng)板(3×103個(gè)/孔),經(jīng)24 h培養(yǎng)使其貼壁,移除細(xì)胞培養(yǎng)液,分別加入5、10、20、40、80、160 μmol/L DHA藥液,培養(yǎng)24、48、72 h后,加入10 μL CKK溶液,于37 ℃下作用4 h,采用酶標(biāo)儀(北京宏潤(rùn)達(dá)科技發(fā)展有限公司,京械注準(zhǔn)20162220432,型號(hào):ZS-2)于450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度(OD)值。

    1.2.4 DHA對(duì)ATC細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響 采用Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ATC細(xì)胞的侵襲能力。于4 ℃解凍Matrigel過(guò)夜,采用細(xì)胞培養(yǎng)液WE按1∶5稀釋,平鋪在Transwell小室的濾膜上,50 μL/膜,于37 ℃放置30 min,便于基底膜膠發(fā)生凝固,采用生理鹽水浸浴水化小室膜30 min待用。于Transwell下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液,DHA組上室分別加入5、10、20、40、80、160 μmol/L DHA藥液400 μL,對(duì)照組上室加入無(wú)DHA藥物的血清WE培養(yǎng)基溶液400 μL,培養(yǎng)24 h后,用棉簽擦去上室面的細(xì)胞,固定,采用1 g/L的結(jié)晶紫染液(北京索萊寶科技有限公司,型號(hào):CR202211004766)染色,在的生物顯微鏡[蔡司科技(蘇州)有限公司,蘇械注準(zhǔn)20202220363,型號(hào):Axiolab 5](200×)下觀察并拍照,并隨機(jī)挑選6個(gè)視野進(jìn)行穿膜細(xì)胞計(jì)數(shù)。采用遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)ATC細(xì)胞的遷移能力,操作步驟參照Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn),除Transwell小室的上室底部不鋪設(shè)基質(zhì)膠外,其余的操作步驟和方法均相同。

    1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)ATC細(xì)胞凋亡結(jié)果 采用雙熒光標(biāo)記法檢測(cè)不同濃度DHA藥液作用后的ATC細(xì)胞的凋亡情況。具體步驟按照AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。每組取1 mL細(xì)胞懸液分別加入5 μL AnnexinV-FITC和10 μL PI混勻后避光標(biāo)記10 min,采用流式細(xì)胞儀(碧迪公司,型號(hào):BD FACSCalibur)進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。凋亡率=象限內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%,流式細(xì)胞儀檢測(cè)圖右上象限為晚期凋亡細(xì)胞,右下象限為早期凋亡細(xì)胞。

    1.3 觀察指標(biāo) ⑴分析DHA 對(duì)ATC細(xì)胞形態(tài)的影響。⑵分析DHA 對(duì) ATC細(xì)胞增殖的抑制作用。⑶分析DHA對(duì)ATC細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響。⑷觀察DHA對(duì)ATC細(xì)胞凋亡的影響。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)量資料以(x)表示,多組間比較采用F檢驗(yàn),其兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 DHA對(duì)ATC細(xì)胞形態(tài)的影響 10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用24、48、72及96 h后,對(duì)照組ATC細(xì)胞正常生長(zhǎng),5、10和20 μmol/L DHA組ATC細(xì)胞形態(tài)變化不明顯,40、80和160 μmol/L DHA組ATC細(xì)胞密度變得明顯稀疏,出現(xiàn)細(xì)胞離壁,腫脹,胞膜和胞體破裂分解,細(xì)胞死亡等情況。

    2.2 DHA對(duì)ATC細(xì)胞增殖的抑制作用 10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用24、48 及72 h后,ATC細(xì)胞的OD值均低于對(duì)照組,5 μmol/L DHA組藥液作用48、72 h后,ATC細(xì)胞的OD值均低于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見(jiàn)表1。

    2.3 DHA對(duì)ATC細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響 5、10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細(xì)胞的遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)均少于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見(jiàn)表2。

    2.4 DHA對(duì)ATC細(xì)胞凋亡的影響 5、10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細(xì)胞晚期凋亡率均高于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05);5、10和20 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細(xì)胞早期凋亡率與對(duì)照組比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05),40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細(xì)胞早期凋亡率均高于對(duì)照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見(jiàn)表3。

    3 討論

    ATC的兩大標(biāo)志性惡性生物學(xué)行為包括血管生成和組織侵襲,是造成ATC預(yù)后極差的原因之一,主要表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞迅速生長(zhǎng)、較早發(fā)生致命性的局部侵襲和轉(zhuǎn)移[6]。DHA是倍半萜內(nèi)酯類化合物,具有強(qiáng)大的抗瘧作用,還可抑制腫瘤相關(guān)蛋白表達(dá),下調(diào)絲裂素活化蛋白激酶、胞外信號(hào)調(diào)控激酶等信號(hào)通路,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡,既往已有多項(xiàng)報(bào)道證實(shí)DHA對(duì)肺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤具有抑制作用[7-8],這為臨床抗癌新藥的研發(fā)提供方向。但有關(guān)DHA在ATC中的應(yīng)用還較為少見(jiàn)。因此,本研究觀察DHA對(duì)人ATC細(xì)胞的作用效果,分析DHA對(duì)ATC的治療作用。

    本研究結(jié)果顯示,10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用24、48、72及96 h后,對(duì)照組ATC細(xì)胞正常生長(zhǎng),5、10和20 μmol/L DHA組細(xì)胞形態(tài)變化不明顯,40、80和160 μmol/L DHA組細(xì)胞密度變得明顯稀疏,出現(xiàn)細(xì)胞離壁,腫脹,胞膜和胞體破裂分解,細(xì)胞死亡等情況。這提示DHA對(duì)ATC細(xì)胞具有毒性作用,隨著DHA濃度的增加,ATC細(xì)胞的形態(tài)變化越明顯,細(xì)胞死亡率也越高。分析原因?yàn)?,DHA可能通過(guò)干擾鐵代謝、促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化、調(diào)控信號(hào)通路和改變基因表達(dá)等機(jī)制,誘導(dǎo)ATC細(xì)胞發(fā)生鐵死亡,從而改變其形態(tài)[9]。本研究結(jié)果顯示,10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用24、48 及72 h后,ATC細(xì)胞的OD值均低于對(duì)照組,5 μmol/L DHA組藥液作用48、72 h后,ATC細(xì)胞的OD值均低于對(duì)照組;5、10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細(xì)胞的遷移、侵襲細(xì)胞數(shù)均少于對(duì)照組,這提示DHA可顯著抑制ATC細(xì)胞增殖、侵襲、遷移。分析原因?yàn)?,凋亡和壞死是?xì)胞死亡的方式,細(xì)胞凋亡是機(jī)體發(fā)育過(guò)程中基因調(diào)控下的細(xì)胞程序性死亡,惡性腫瘤的重要生物學(xué)特征為細(xì)胞的凋亡受阻和過(guò)度細(xì)胞增殖[10]。DHA能阻斷Wnt/β-catenin蛋白信號(hào)通路,并增強(qiáng)糖原合酶激酶的催化活性,抑制甲狀腺腫瘤細(xì)胞分化、增殖。此外,DHA可與ATC細(xì)胞內(nèi)亞鐵離子結(jié)合,直接破壞ATC細(xì)胞,抑制ATC細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力[11]。本研究結(jié)果顯示,5、10、20、40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細(xì)胞晚期凋亡率均高于對(duì)照組;5、10和20 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細(xì)胞早期凋亡率與對(duì)照組比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,40、80和160 μmol/L DHA組藥液作用后ATC細(xì)胞早期凋亡率均高于對(duì)照組,這提示DHA可誘導(dǎo)ATC細(xì)胞凋亡。分析原因?yàn)?,DHA能抑制核因子κB(NF-κB)蛋白表達(dá),破壞腫瘤細(xì)胞膜與蛋白質(zhì),誘導(dǎo)DNA損傷,進(jìn)而抑制腫瘤血管生長(zhǎng),達(dá)到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡目的,且DHA抗腫瘤作用可能具有劑量依賴性[12]。這也證實(shí)DHA有望成為甲狀腺未分化癌治療藥物,但其具體機(jī)制和臨床應(yīng)用還有待今后深入探討。

    綜上所述,DHA可明顯抑制ATC細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力并誘導(dǎo)其發(fā)生細(xì)胞凋亡,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)抑制甲狀腺腫瘤的作用。

    參考文獻(xiàn)

    李斐,李舍予.全球甲狀腺癌疾病負(fù)擔(dān)[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué), 2018, 21(26): 3155-3159.

    周一坤,施秉銀.對(duì)甲狀腺未分化癌生物學(xué)行為的再認(rèn)識(shí)[J].中華醫(yī)學(xué)雜志, 2023, 103(5): 375-377.

    YANG S, ZHANG D, SHEN N, et al. Dihydroartemisinin increases gemcitabine therapeutic efficacy in ovarian cancer by inducing reactive oxygen species[J]. J Cell Biochem, 2019, 120(1): 634-644.

    周許薇,譚蔚鋒,解方園,等.雙氫青蒿素抗癌藥理作用機(jī)制的研究進(jìn)展[J].藥學(xué)實(shí)踐雜志, 2019, 37(3): 206-211, 278.

    孫卉,陳曉靜,劉麗,等.雙氫青蒿素通過(guò)PI3K/Akt通路逆轉(zhuǎn)肺癌順鉑耐藥A549/DDP細(xì)胞的分子機(jī)制[J].中國(guó)藥師, 2021, 24(6): 1013-1017.

    RAMMAL R, WASSERMAN J K, SINGHI A D, et al. Glomangiosarcoma-like anaplastic transformation in papillary thyroid carcinoma: A novel form of heterologous differentiation and a systematic review of heterologous element prevalence[J]. Endocr Pathol, 2023, 34(4): 471-483.

    胡冰琪,周靜,黃俊峰,等.雙氫青蒿素抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞遷移侵襲和血管生成擬態(tài)的初步研究[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2023, 58(5): 766-771.

    周駟杰,劉思豪,楊嘉昕,等.雙氫青蒿素誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞焦亡及調(diào)控凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白甲基化[J].陸軍軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2022, 44(14): 1421-1430.

    董佳悅,李樹(shù)杰,王艷,等.雙氫青蒿素和索拉非尼誘導(dǎo)未分化甲狀腺癌鐵死亡的協(xié)同機(jī)制[J]. 中華內(nèi)分泌代謝雜志, 2023, 39(7): 596-604.

    潘宗富,方琦璐,張軼雯,等.基于生物信息學(xué)的未分化甲狀腺癌惡性機(jī)制研究[J].中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué), 2018, 35(11): 1606-1612

    PACCEZ J D, DUNCAN K, SEKAR D, et al. Correction: Dihydroartemisinin inhibits prostate cancer via JARID2/miR-7/miR-34a-dependent downregulation of Axl[J]. Oncogenesis, 2024, 13(1): 32.

    費(fèi)偉東,葉軼青,陳玥,等.雙氫青蒿素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞鐵死亡及其機(jī)制研究[J].中草藥, 2020, 51(13): 3473-3481.

    成人特级黄色片久久久久久久| 欧美又色又爽又黄视频| 午夜日韩欧美国产| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 免费高清视频大片| 亚洲男人天堂网一区| 老汉色av国产亚洲站长工具| 90打野战视频偷拍视频| a级毛片在线看网站| 热99re8久久精品国产| 日本三级黄在线观看| 天堂影院成人在线观看| cao死你这个sao货| tocl精华| 欧美日韩乱码在线| 男人的好看免费观看在线视频 | 窝窝影院91人妻| 亚洲专区字幕在线| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 日韩欧美国产在线观看| 嫩草影院精品99| 一a级毛片在线观看| 在线视频色国产色| 男女下面进入的视频免费午夜| 村上凉子中文字幕在线| 日韩精品青青久久久久久| 99国产极品粉嫩在线观看| 欧美又色又爽又黄视频| 99国产极品粉嫩在线观看| av国产免费在线观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 香蕉av资源在线| 国产私拍福利视频在线观看| 久久精品国产清高在天天线| 亚洲18禁久久av| 久久久久久国产a免费观看| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲九九香蕉| 亚洲九九香蕉| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 国产亚洲精品久久久久5区| 成人午夜高清在线视频| 国模一区二区三区四区视频 | 成人手机av| 一本一本综合久久| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 桃色一区二区三区在线观看| 欧美另类亚洲清纯唯美| 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 免费一级毛片在线播放高清视频| 午夜日韩欧美国产| 成人国产综合亚洲| 欧美成人午夜精品| 午夜视频精品福利| 欧美又色又爽又黄视频| av国产免费在线观看| 国产精品免费一区二区三区在线| 久久99热这里只有精品18| 日本精品一区二区三区蜜桃| 久久久久久大精品| 免费看美女性在线毛片视频| 亚洲av熟女| 啪啪无遮挡十八禁网站| 91国产中文字幕| 久久久久性生活片| 午夜精品在线福利| 免费在线观看黄色视频的| 欧美色欧美亚洲另类二区| 美女扒开内裤让男人捅视频| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 久久久国产成人免费| 18禁美女被吸乳视频| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 欧美成人性av电影在线观看| 欧美日韩乱码在线| 国产熟女午夜一区二区三区| 欧美乱妇无乱码| 日本五十路高清| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产精品一及| 老汉色av国产亚洲站长工具| 免费电影在线观看免费观看| 丰满的人妻完整版| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产av又大| 精品无人区乱码1区二区| 成人国语在线视频| 日本三级黄在线观看| 日日爽夜夜爽网站| 中文字幕高清在线视频| 少妇熟女aⅴ在线视频| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 999久久久精品免费观看国产| 脱女人内裤的视频| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 成人一区二区视频在线观看| 在线观看舔阴道视频| 动漫黄色视频在线观看| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | 男人舔奶头视频| 国产又色又爽无遮挡免费看| 久久亚洲精品不卡| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 国产又色又爽无遮挡免费看| 免费在线观看完整版高清| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 最近视频中文字幕2019在线8| 视频区欧美日本亚洲| 99久久无色码亚洲精品果冻| 十八禁人妻一区二区| 午夜福利视频1000在线观看| a级毛片在线看网站| 免费看十八禁软件| 欧美成狂野欧美在线观看| 国产亚洲欧美98| 国产av一区在线观看免费| 国产激情欧美一区二区| 欧美乱码精品一区二区三区| 成年版毛片免费区| 18美女黄网站色大片免费观看| 窝窝影院91人妻| 国产伦在线观看视频一区| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 一区二区三区高清视频在线| 午夜激情av网站| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 亚洲成人中文字幕在线播放| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 免费看美女性在线毛片视频| a在线观看视频网站| x7x7x7水蜜桃| 正在播放国产对白刺激| 午夜日韩欧美国产| 午夜两性在线视频| 国产男靠女视频免费网站| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 99国产综合亚洲精品| 久久性视频一级片| 久久久国产成人精品二区| 久久久久精品国产欧美久久久| 亚洲专区字幕在线| 在线观看www视频免费| 99国产极品粉嫩在线观看| 88av欧美| 夜夜爽天天搞| 日本一区二区免费在线视频| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 成人一区二区视频在线观看| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 欧美三级亚洲精品| 成人三级黄色视频| 国产精品一区二区三区四区久久| 黄色视频,在线免费观看| 日本a在线网址| 久久午夜亚洲精品久久| 欧美丝袜亚洲另类 | 极品教师在线免费播放| 亚洲精品久久国产高清桃花| 欧美丝袜亚洲另类 | 亚洲精华国产精华精| xxxwww97欧美| xxx96com| 色老头精品视频在线观看| 免费一级毛片在线播放高清视频| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 亚洲专区中文字幕在线| 99热只有精品国产| 日日干狠狠操夜夜爽| 99久久国产精品久久久| 国产激情久久老熟女| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲中文字幕日韩| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 一个人免费在线观看的高清视频| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产97色在线日韩免费| 久久久久久久久免费视频了| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 久久精品人妻少妇| 欧美黑人精品巨大| 午夜亚洲福利在线播放| 1024手机看黄色片| www.熟女人妻精品国产| 日韩国内少妇激情av| 999久久久精品免费观看国产| 国产精品久久久久久精品电影| a级毛片a级免费在线| 十八禁人妻一区二区| 精品午夜福利视频在线观看一区| 欧美高清成人免费视频www| 女同久久另类99精品国产91| 午夜a级毛片| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 无人区码免费观看不卡| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 亚洲国产中文字幕在线视频| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲中文字幕一区二区三区有码在线看 | 老司机午夜福利在线观看视频| 一级毛片高清免费大全| 亚洲专区中文字幕在线| 岛国视频午夜一区免费看| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 老鸭窝网址在线观看| 久久草成人影院| 亚洲中文日韩欧美视频| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲男人天堂网一区| 亚洲国产欧美一区二区综合| 欧美成人免费av一区二区三区| 黑人操中国人逼视频| 午夜日韩欧美国产| 中文字幕最新亚洲高清| 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲色图av天堂| 欧美一级毛片孕妇| 搡老岳熟女国产| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 特级一级黄色大片| 成人国产一区最新在线观看| 午夜精品在线福利| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 一级毛片精品| 亚洲专区中文字幕在线| 亚洲,欧美精品.| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 狂野欧美激情性xxxx| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 大型黄色视频在线免费观看| 国产午夜精品久久久久久| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 色精品久久人妻99蜜桃| 老司机午夜福利在线观看视频| 欧美乱码精品一区二区三区| 日韩精品青青久久久久久| 九色成人免费人妻av| 最近在线观看免费完整版| 高潮久久久久久久久久久不卡| 成人国产综合亚洲| 一级a爱片免费观看的视频| 叶爱在线成人免费视频播放| 很黄的视频免费| 一本大道久久a久久精品| 亚洲美女黄片视频| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 免费在线观看亚洲国产| 一级毛片精品| 成人国产一区最新在线观看| 欧美一区二区国产精品久久精品 | 国产又黄又爽又无遮挡在线| 欧美不卡视频在线免费观看 | 国产单亲对白刺激| 日本熟妇午夜| 国产三级在线视频| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 无人区码免费观看不卡| 丁香六月欧美| 男人舔奶头视频| av有码第一页| 久久久国产成人免费| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 久久这里只有精品中国| 99久久无色码亚洲精品果冻| 欧美乱妇无乱码| 精品久久久久久久久久久久久| 国产黄片美女视频| xxx96com| 搡老熟女国产l中国老女人| 欧美又色又爽又黄视频| 嫩草影院精品99| 国产69精品久久久久777片 | 韩国av一区二区三区四区| 少妇粗大呻吟视频| 亚洲国产欧美人成| 免费在线观看亚洲国产| 亚洲成av人片在线播放无| 2021天堂中文幕一二区在线观| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 桃色一区二区三区在线观看| 国产成+人综合+亚洲专区| 午夜福利在线在线| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 成年免费大片在线观看| 又黄又粗又硬又大视频| 欧美在线黄色| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 看片在线看免费视频| 身体一侧抽搐| АⅤ资源中文在线天堂| 麻豆成人午夜福利视频| 国产激情欧美一区二区| 男人舔奶头视频| 黄频高清免费视频| 国产成人啪精品午夜网站| 日本成人三级电影网站| 亚洲激情在线av| 成年人黄色毛片网站| 亚洲中文日韩欧美视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 天堂√8在线中文| 无人区码免费观看不卡| 91九色精品人成在线观看| 国产真人三级小视频在线观看| 欧美zozozo另类| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 欧美三级亚洲精品| 五月玫瑰六月丁香| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 欧美精品啪啪一区二区三区| 久久亚洲精品不卡| 国产亚洲av嫩草精品影院| 看免费av毛片| 最好的美女福利视频网| 国产成人精品无人区| 正在播放国产对白刺激| 国产精品综合久久久久久久免费| 国产精品精品国产色婷婷| 黄色片一级片一级黄色片| netflix在线观看网站| 美女午夜性视频免费| 国产精品久久视频播放| 久久国产精品人妻蜜桃| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 免费在线观看成人毛片| 国产成+人综合+亚洲专区| www日本黄色视频网| 在线观看免费日韩欧美大片| 国产精品野战在线观看| 国产av在哪里看| 日韩av在线大香蕉| 91大片在线观看| ponron亚洲| 国产亚洲精品久久久久5区| 高清在线国产一区| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 国产精品av久久久久免费| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 欧美性猛交黑人性爽| 精品午夜福利视频在线观看一区| 亚洲熟女毛片儿| 亚洲精品粉嫩美女一区| 99热6这里只有精品| 亚洲av片天天在线观看| 此物有八面人人有两片| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 精品欧美国产一区二区三| 麻豆一二三区av精品| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲一码二码三码区别大吗| 久久午夜综合久久蜜桃| 亚洲全国av大片| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 亚洲男人的天堂狠狠| 成人av一区二区三区在线看| 久久中文字幕一级| 黄色丝袜av网址大全| 国产三级中文精品| 国产精品免费一区二区三区在线| 日韩有码中文字幕| 超碰成人久久| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 欧美色视频一区免费| 一本综合久久免费| 久久久久久久久久黄片| 亚洲免费av在线视频| 亚洲精品中文字幕在线视频| 制服丝袜大香蕉在线| 制服人妻中文乱码| 亚洲 国产 在线| 日本 欧美在线| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 美女免费视频网站| 毛片女人毛片| 中文字幕av在线有码专区| 黄色女人牲交| 亚洲人成电影免费在线| 国产熟女xx| 欧美黑人精品巨大| 亚洲人与动物交配视频| www日本在线高清视频| 变态另类丝袜制服| 欧美一级毛片孕妇| 午夜福利高清视频| 狠狠狠狠99中文字幕| 国产99久久九九免费精品| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 国产av麻豆久久久久久久| 男人舔女人下体高潮全视频| 99在线视频只有这里精品首页| 757午夜福利合集在线观看| 麻豆国产97在线/欧美 | 国产精品乱码一区二三区的特点| 国产免费av片在线观看野外av| 亚洲人与动物交配视频| 国语自产精品视频在线第100页| 亚洲无线在线观看| 成人亚洲精品av一区二区| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 一边摸一边抽搐一进一小说| 国产成人精品久久二区二区免费| 99久久精品热视频| 桃色一区二区三区在线观看| 亚洲熟妇熟女久久| 老司机午夜福利在线观看视频| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 久久久久久久精品吃奶| 亚洲av成人一区二区三| 亚洲在线自拍视频| 日韩精品青青久久久久久| 天天添夜夜摸| 日日爽夜夜爽网站| 国产私拍福利视频在线观看| 国产亚洲欧美98| 老熟妇仑乱视频hdxx| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 亚洲精品av麻豆狂野| 男女床上黄色一级片免费看| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产在线观看jvid| 亚洲成av人片免费观看| 在线观看舔阴道视频| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 亚洲欧美激情综合另类| 999久久久精品免费观看国产| 狠狠狠狠99中文字幕| 一区二区三区国产精品乱码| 亚洲激情在线av| 91麻豆av在线| 日本黄大片高清| av视频在线观看入口| 正在播放国产对白刺激| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲精品在线美女| 国产成人精品无人区| 在线国产一区二区在线| 88av欧美| 国产精品久久电影中文字幕| 人人妻人人澡欧美一区二区| 久久午夜亚洲精品久久| 欧美精品啪啪一区二区三区| 麻豆国产97在线/欧美 | 国产激情久久老熟女| 男女午夜视频在线观看| 麻豆国产av国片精品| 国产黄片美女视频| 叶爱在线成人免费视频播放| 91老司机精品| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 老司机午夜十八禁免费视频| 亚洲中文字幕日韩| 男女视频在线观看网站免费 | 淫秽高清视频在线观看| 91老司机精品| 亚洲美女视频黄频| 精品欧美一区二区三区在线| 99国产极品粉嫩在线观看| 后天国语完整版免费观看| av免费在线观看网站| av在线天堂中文字幕| 日日夜夜操网爽| 亚洲国产欧洲综合997久久,| www.精华液| 成人三级黄色视频| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 两个人的视频大全免费| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 老熟妇乱子伦视频在线观看| 精品国产乱码久久久久久男人| 亚洲中文日韩欧美视频| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| www.熟女人妻精品国产| 亚洲美女黄片视频| 美女 人体艺术 gogo| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产精品久久视频播放| 757午夜福利合集在线观看| 亚洲av电影在线进入| 欧美久久黑人一区二区| 免费av毛片视频| 成熟少妇高潮喷水视频| 亚洲国产精品999在线| 亚洲免费av在线视频| 日韩精品青青久久久久久| 1024手机看黄色片| 动漫黄色视频在线观看| 18美女黄网站色大片免费观看| 老司机在亚洲福利影院| 精品免费久久久久久久清纯| 中文字幕av在线有码专区| 变态另类丝袜制服| 男女那种视频在线观看| 国产欧美日韩一区二区三| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 欧美丝袜亚洲另类 | 亚洲在线自拍视频| 99久久精品热视频| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 亚洲专区中文字幕在线| 好男人在线观看高清免费视频| 一级黄色大片毛片| 啪啪无遮挡十八禁网站| 757午夜福利合集在线观看| 国产黄色小视频在线观看| 午夜日韩欧美国产| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 亚洲,欧美精品.| 最近最新中文字幕大全电影3| av在线播放免费不卡| 欧美中文日本在线观看视频| 亚洲全国av大片| 在线观看免费午夜福利视频| 亚洲国产高清在线一区二区三| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 亚洲国产精品合色在线| 18禁美女被吸乳视频| 国产熟女xx| 黄色视频,在线免费观看| 在线观看舔阴道视频| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 在线国产一区二区在线| 欧美一区二区国产精品久久精品 | 欧美日韩黄片免| 亚洲五月婷婷丁香| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 亚洲精品久久国产高清桃花| av福利片在线观看| 亚洲国产欧美一区二区综合| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 亚洲人成77777在线视频| 日韩大尺度精品在线看网址| 十八禁网站免费在线| 成人欧美大片| 亚洲精品粉嫩美女一区| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 99热这里只有精品一区 | 亚洲人成77777在线视频| 成熟少妇高潮喷水视频| 妹子高潮喷水视频| 舔av片在线| 一本精品99久久精品77| 国产亚洲精品第一综合不卡| 久久精品成人免费网站| 麻豆一二三区av精品| 国产高清激情床上av| 国产成人aa在线观看| 精品福利观看| 91成年电影在线观看| 午夜久久久久精精品| 欧美日本亚洲视频在线播放| 国产亚洲av嫩草精品影院| 无限看片的www在线观看| 免费电影在线观看免费观看| x7x7x7水蜜桃| 国产精品亚洲一级av第二区| 精品久久久久久久毛片微露脸| 日本三级黄在线观看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 色精品久久人妻99蜜桃| 日韩欧美在线乱码| 日韩欧美三级三区| 国产单亲对白刺激| 亚洲专区中文字幕在线| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 男人舔女人的私密视频| 免费在线观看成人毛片| 午夜影院日韩av| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲国产精品sss在线观看| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 美女免费视频网站| 欧美另类亚洲清纯唯美| 老熟妇仑乱视频hdxx| 久久精品成人免费网站| 一区二区三区激情视频| 给我免费播放毛片高清在线观看| 老汉色∧v一级毛片| 可以在线观看的亚洲视频| 亚洲国产欧美人成| 亚洲成人久久爱视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 首页视频小说图片口味搜索| xxxwww97欧美| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 色尼玛亚洲综合影院| 久久久久久久久久黄片| 亚洲 欧美一区二区三区| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲精品久久国产高清桃花| 老汉色∧v一级毛片| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 国产av在哪里看| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 一进一出好大好爽视频| 99热这里只有是精品50| 亚洲无线在线观看|