基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探究《楊氏家藏方》趁痛散治療強(qiáng)直性脊柱炎的機(jī)制

【摘 要】目的：運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探究趁痛散治療強(qiáng)直性脊柱炎的作用機(jī)制。方法：通過TCMSP等4個(gè)數(shù)據(jù)庫獲取趁痛散藥物信息，通過GeneCards等5個(gè)數(shù)據(jù)庫篩選已知的強(qiáng)直性脊柱炎靶點(diǎn)；利用Cytoscape等工具構(gòu)建Venny圖、相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖；利用DAVID對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析和KEGG富集分析，并借助微生信對(duì)結(jié)果可視化；從PDB中獲得靶蛋白導(dǎo)入Autodock，進(jìn)行虛擬分子對(duì)接分析。結(jié)果：經(jīng)過篩選趁痛散共有103個(gè)中藥成分作用于99個(gè)交集靶點(diǎn)；構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖篩選3個(gè)核心靶點(diǎn)；構(gòu)建中藥-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖篩選3個(gè)中藥成分；GO功能分析主要涉及對(duì)外反應(yīng)等；KEGG富集分析得到IL-17信號(hào)通路等關(guān)鍵通路；分子對(duì)接結(jié)果表明，趁痛散中的槲皮素等與血清白蛋白等有較好的結(jié)合能力。結(jié)論：研究預(yù)測了趁痛散對(duì)強(qiáng)直性脊柱炎的可能作用機(jī)制，但還須后續(xù)研究驗(yàn)證。

【關(guān)鍵詞】 強(qiáng)直性脊柱炎；楊氏家藏方；趁痛散；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子對(duì)接

Exploring the Mechanism of Chentong San（趁痛散）from Yang's Familial Formula in Treating Ankylosing

Spondylitis Based on Network Pharmacology and Molecular Docking

QIU Zhi-hao，XIA Rui-bo，CHEN Jia-qian，ZENG Ming-mei，CHEN Yu-ying，YANG Ke-peng

【ABSTRACT】Objective：To explore the mechanism of action of Chentong San（趁痛散）in the

treatment of ankylosing spondylitis using network pharmacology and molecular docking.Methods：Information on the use of Chentong San was obtained from four databases including TCMSP，and targets of ankylosing spondylitis were screened from five databases including GeneCards.Tools such as Cytoscape was used to construct Venny diagrams and related network diagrams.DAVID was used to perfoIuOgUkYa9tyYY2dV/mYPr9P8kgJvbahizS9e2vmJZN8=rm GO enrichment analysis and KEGG enrichment analysis on intersecting targets，and bioinformatics was used to visualize the results.Target proteins from PDB were obtained and imported into Autodock for virtual molecular docking analysis.Results：After screening，a total of 103 Chinese medicine components were found to act on 99 intersecting targets in Chentong San;three core targets were screened by constructing a PPI network diagram;three Chinese medicine components were screened by constructing a Chinese medicine-target network diagram;GO functional analysis mainly involved external reactions，etc;KEGG enrichment analysis revealed key pathways such as IL-17 signaling pathway;molecular docking results indicated that components such as quercetin in Chentong San had good binding ability with ALB.Conclusion：The study has predicted the possible mechanism of action of Chentong San on ankylosing spondylitis，which needs verifying by further researches.

【Keywords】 ankylosing spondylitis;Yang's Familial Formula;Chentong San（趁痛散）;network pharmacology;molecular docking

強(qiáng)直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一種以中軸關(guān)節(jié)受累為主，可伴發(fā)關(guān)節(jié)外表現(xiàn)的自身免疫性疾病。主要臨床特征為炎性下腰痛、骶髂關(guān)節(jié)疼痛［1］。其病理特征為早期附著點(diǎn)炎，中期新骨形成、關(guān)節(jié)間隙消失，晚期脊柱“竹節(jié)樣變”［2］。目前AS尚無逆轉(zhuǎn)病理過程的手段，以降低疾病活動(dòng)度為主要臨床治療目標(biāo)，一線藥物為非甾體抗炎藥，二線藥物為生物制劑、糖皮質(zhì)激素等，其中非甾體抗炎藥以對(duì)癥治療為主，且因藥物不良反應(yīng)不推薦長期使用。二線藥物以抑制免疫系統(tǒng)為主要藥理作用，會(huì)增加感染等風(fēng)險(xiǎn)［3］。目前中藥成方治療AS以現(xiàn)代中醫(yī)大家總結(jié)的經(jīng)驗(yàn)方為主，如補(bǔ)腎強(qiáng)督方、益腎蠲痹丸、強(qiáng)脊寧、痹祺膠囊等［4］，中醫(yī)古方治療AS仍有較大挖掘空間。

趁痛散出自《楊氏家藏方》，治寒濕相搏，攻注腰腳疼痛，行步少力，筋脈拘急［4-5］。主治由寒邪、濕邪引起的疼痛，這與AS疼痛中醫(yī)辨證相符。因此，本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探究趁痛散是否具有治療AS的作用，既是對(duì)AS中醫(yī)藥治療的拓展，也為中醫(yī)古方現(xiàn)代化做出貢獻(xiàn)。

1 資料與方法

1.1 藥物主要活性成分的收集 趁痛散包括沒藥、杜仲、延胡索、當(dāng)歸、肉桂、萆薢6味中藥，其中萆薢分為綿萆薢和粉萆薢，綿萆薢水提取物具有抗骨質(zhì)疏松、抗心肌缺血、抗腫瘤作用［6］，在臨床上治療AS多用綿萆薢，故本研究選取綿萆薢并篩選其主要活性成分。通過在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)在線平臺(tái)（TCMSP），以口服生物利用度（OB）≥30，類藥性指數(shù)（DL）≥0.18為臨界值，篩選出各味中藥主要活性成分。

1.2 中藥活性成分靶點(diǎn)預(yù)測及標(biāo)準(zhǔn)化 根據(jù)從TCMSP中篩選的主要活性成分篩選其靶基因，并通過Swiss Target Prediction、TargetNet、SymMap 3個(gè)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行補(bǔ)充。將上述4個(gè)數(shù)據(jù)庫收集到的中藥主要活性成分作用靶點(diǎn)進(jìn)行匯總?cè)ブ亍?/p>

1.3 AS相關(guān)靶基因的篩選 通過對(duì)GeneCards、OMIM、Disgenet、TTD、Drug Bank 5個(gè)數(shù)據(jù)庫以“ankylosing spondylitis”為關(guān)鍵詞進(jìn)行篩選并匯總?cè)ブ?，得到目前已知的AS疾病靶點(diǎn)。

1.4 中藥核心活性成分與核心靶基因的篩選 將經(jīng)過匯總?cè)ブ睾蟮某猛瓷⒆饔冒悬c(diǎn)和AS靶點(diǎn)上傳到在線網(wǎng)站Venny 2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）中，獲取趁痛散與AS的交集靶點(diǎn)。將獲得的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入到STRING 11.0數(shù)據(jù)庫獲取靶標(biāo)蛋白的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（PPI）。借助 Cytoscape 3.10.0軟件，對(duì)獲得的PPI網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行修飾和可視化，提取核心靶點(diǎn)；同時(shí)根據(jù)獲得的中藥主要活性成分、交集靶點(diǎn)構(gòu)建中藥關(guān)鍵成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖并可視化，提取核心中藥活性成分。

1.5 GO富集分析與KEGG通路富集分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫［7］對(duì)交集的藥效靶點(diǎn)進(jìn)行GO 分子功能分析和KEGG信號(hào)通路富集分析，根據(jù)P值進(jìn)行排序，分別篩選出排序前10位生物過程（BP）、細(xì)胞組分（CC）、分子功能（MF）的GO terms以及排序前10位的KEGG通路。利用微生信平臺(tái)（https：//www.bio-informat-ics.com.cn/login/），基于篩選出來的GO富集分析和KEGG富集分析數(shù)據(jù)繪制GO BP、CC、MF三合一柱狀圖和KEGG富集氣泡圖進(jìn)行結(jié)果展示。

1.6 中藥核心成分-核心靶點(diǎn)分子對(duì)接驗(yàn)證 利用AutoDock Vina（v1.1.2）對(duì)趁痛散中藥核心成分和AS相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證其相互作用活性。

2 結(jié) 果

2.1 趁痛散的主要活性成分篩選 以O(shè)B值≥

30，DL值≥0.18為條件，在TCMSP數(shù)據(jù)庫中篩選趁痛散各味中藥活性成分，得到120個(gè)中藥成分，其中當(dāng)歸2個(gè)，杜仲27個(gè)，綿萆薢2個(gè)，沒藥42個(gè)，延胡索47個(gè)。

2.2 趁痛散與AS的交集靶點(diǎn)篩選 趁痛散主要活性成分靶點(diǎn)篩選通過TCMSP、Swiss Target Prediction、TargetNet、SymMap共4個(gè)數(shù)據(jù)庫中

查詢到的靶點(diǎn)經(jīng)Uniprot數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)化注釋后進(jìn)行匯總?cè)ブ?，共得?78個(gè)靶點(diǎn)。通過篩選GeneCards、OMIM、Disgenet、TTD、Drug Bank共5個(gè)數(shù)據(jù)庫關(guān)于AS的靶點(diǎn)并進(jìn)行匯總?cè)ブ?，共得?76個(gè)AS靶點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上制作Venny圖，共得到99個(gè)交集靶點(diǎn)，見圖1。

2.3 交集靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化 將得到的99個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入到STRING 11.0數(shù)據(jù)庫，得到原始PPI網(wǎng)絡(luò)圖，經(jīng)過Cytoscape 3.10.0軟件可視化發(fā)現(xiàn)，共有1298對(duì)蛋白相互作用關(guān)系，涉及97個(gè)蛋白靶點(diǎn)，以度值（degree）為篩選標(biāo)準(zhǔn)，選取前3位蛋白靶點(diǎn)，血清白蛋白（ALB，degree =

72）、腫瘤壞死因子（TNF，degree = 70）、白細(xì)胞介素-6（IL-6，degree = 70）為核心靶點(diǎn)，見圖2。

2.4 中藥-關(guān)鍵成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建及可視化 通過Cytoscape 3.10.0軟件，在99個(gè)交集靶點(diǎn)的基礎(chǔ)上，對(duì)趁痛散中藥有效成分進(jìn)行篩選并構(gòu)建中藥-關(guān)鍵成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3，共有103個(gè)中藥成分作用于交集靶點(diǎn)，其中當(dāng)歸2個(gè)，杜仲26個(gè)，綿萆薢2個(gè)，沒藥26個(gè)，延胡索47個(gè)，共有1214對(duì)中藥成分與交集靶點(diǎn)相互作用關(guān)系，以degree為篩選標(biāo)準(zhǔn)選取前3位作為核心中藥作用成分，分別為槲皮素（degree = 87）、山柰酚（degree = 58）、丁香黃素（degree = 39）。

2.5 趁痛散與AS交集靶點(diǎn)GO富集分析與KEGG富集分析結(jié)果 將交集靶點(diǎn)蛋白輸入DAVID數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行GO富集分析，共得到642條富集結(jié)果。其中BP 480個(gè)，主要涉及對(duì)外源刺激的反應(yīng)、基因表達(dá)的正向調(diào)控、凋亡過程的負(fù)調(diào)控等；CC

40個(gè)，主要涉及細(xì)胞外間隙、胞外區(qū)、細(xì)胞表面等；MF 122個(gè)，主要涉及酶結(jié)合、類固醇結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性，配體激活的序列特異性DNA結(jié)合等。分別選取前10個(gè)GO term展示，見圖4。

同時(shí)對(duì)交集靶點(diǎn)蛋白作KEGG通路富集分析，共得到155條富集結(jié)果。KEGG富集分析關(guān)鍵蛋白模塊的相關(guān)通路排名前10位的通路繪制氣泡圖，見圖5。結(jié)果顯示，參與AS的信號(hào)通路包括糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、癌癥通路、TNF信號(hào)通路等。

2.6 核心中藥作用成分-核心靶點(diǎn)分子對(duì)接驗(yàn)證 根據(jù)先前得到的趁痛散3個(gè)核心中藥成分槲皮素、山柰酚、丁香黃素與PPI網(wǎng)絡(luò)圖可視化得到的3個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)ALB、TNF、IL-6進(jìn)行分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)，見表1，結(jié)果表明，槲皮素、山柰酚、丁香黃素與ALB、TNF、IL-6的結(jié)合能均< -5 kcal·mol-1，具有較好的結(jié)合能力，選取部分分子對(duì)接實(shí)驗(yàn)結(jié)果作展示，見圖6、圖7。

3 討 論

疼痛是導(dǎo)致AS患者生活質(zhì)量下降的影響因素之一［8］，通過抗炎降低疾病活動(dòng)度是臨床上治療AS的常用思路。然而考慮到非甾體抗炎藥對(duì)心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等不良反應(yīng)，臨床上一直建議按需服用。趁痛散在《楊氏家藏方》中記載用于寒邪、濕邪引起的風(fēng)濕相關(guān)疼痛，用于痹證時(shí)也有較好的療效［9］。其核心中藥成分槲皮素在關(guān)節(jié)炎領(lǐng)域尤其是AS有較多的研究［6，8］，研究證實(shí)，槲皮素能夠抑制諸如TNF-α、IL-1β、IL-6等經(jīng)典促炎因子的釋放［10］，從而減輕炎癥；山柰酚可以通過降低軟骨Bax、CASP3和增加Bcl-2蛋白水平，從而抑制軟骨凋亡，對(duì)軟骨形成保護(hù)作用［11］。

本研究表明，趁痛散和AS的交集靶基因共

99個(gè)，進(jìn)一步提煉出趁痛散治療AS的細(xì)胞功能、分子功能和生物學(xué)功能。其中GO分析揭示了阿霉素代謝過程，前列腺素代謝過程，柔紅霉素代謝過程，細(xì)胞對(duì)脂多糖的反應(yīng)，類固醇代謝過程，炎癥反應(yīng)，對(duì)外來化合物刺激的反應(yīng)等生物學(xué)作用的顯著富集，這與AS炎性反應(yīng)有正相關(guān)的生物學(xué)作用。另外，KEGG通路富集分析結(jié)果涉及AGE-RAGE信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、癌癥通路、TNF信號(hào)通路等，說明趁痛散可能通過這些通路作用于AS，這符合目前研究所證實(shí)上述信號(hào)通路與強(qiáng)相關(guān)AS的報(bào)道結(jié)果［12］。根據(jù)生物信息學(xué)研究，AGE-RAGE信號(hào)通路是AS進(jìn)展相關(guān)的通路之一［13］；有研究表明，阻斷IL-23/IL-17通路可顯著改善AS，說明IL-17在AS的發(fā)展中起著重要作用［14］；近期發(fā)現(xiàn)TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）與AS有強(qiáng)相關(guān)，而TRAIL是TNF家族的成員，在自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用［15］。隨后篩選3個(gè)關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白ALB、TNF、IL-6，其中IL-6、TNF同為IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路的組成部分，針對(duì)這兩種信號(hào)通路開發(fā)的IL-17A抑制劑［16］、TNF-α抑制劑［17］治療AS均取得了顯著的臨床療效。本研究表明，趁痛散可通過干預(yù)IL-17信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路起到類似生物抑制劑的作用，未來在臨床應(yīng)用中可以配合非甾體抗炎藥的使用。值得注意的是，本研究所選趁痛散為散劑，主要通過中藥水煎液探究；其次本研究缺乏動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究的證據(jù)支持。

綜上所述，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接，預(yù)測趁痛散治療AS的主要作用靶點(diǎn)及多成分、多靶點(diǎn)、多通路作用機(jī)制，為進(jìn)一步理解藥物-靶點(diǎn)相互作用機(jī)制提供信息，也為中藥治療AS提供新思路，期望后續(xù)有更多的中醫(yī)藥學(xué)者對(duì)趁痛散進(jìn)行深入研究。

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收稿日期：2024-04-02；修回日期：2024-05-27