核桃青皮提取物對蘋果斑點落葉病菌抑菌活性研究

摘" 要：【目的】采用不同提取劑提取核桃果實青皮，研究核桃青皮提取物對蘋果斑點落葉病菌的抑菌活性，為核桃青皮資源的再利用提供理論支持?！痉椒ā恳蕴O果為試驗材料，選用不同濃度梯度（25%、50%、75%、100%）的不同溶劑（乙醇、乙酸乙酯、石油醚、甲醇）對果實成熟期的核桃青皮進行浸提，測定核桃青皮提取物對蘋果斑點落葉病菌生長的影響。【結(jié)果】結(jié)果表明，在離體抑菌試驗中，使用濃度為0.625、1.25、2.5、5、10 mL/L的核桃青皮提取物均對蘋果斑點落葉病菌表現(xiàn)出抑菌效果，以50%甲醇提取物在濃度為5 mL/L時的抑制效果最顯著，抑制率高達80.71%，EC50值為0.001 643 6?！窘Y(jié)論】試驗可為核桃青皮提取物防治蘋果斑點落葉病菌研究提供依據(jù)，為核桃青皮資源的再利用提供理論支持。

關(guān)鍵詞：蘋果斑點落葉病菌；核桃青皮提取物；抑菌

文章編號：2096-8108（2024）06-0034-05" 中圖分類號：S661.1中圖分類號" 文獻標識碼：A文獻標志碼

收稿日期：2024-05-07

基金項目：2024年度河北省濕地保護與綠色發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心專項課題（2024XTCX001）

第一作者簡介：高小寬（1981-），女，講師，主要從事植物病理學研究。

Study on The Antibacterial Activity of The Extracts from Walnut Green Husk Against Apple Alternaria Blotch

GAO" Xiaokuan，ZHAO" Dan，MA" Guang，LI" Miao

（College of Life Sciences， Hengshui University， Hengshui Hebei 053000，China）

Abstract：【Objective】The green husk of walnut fruit was extracted with different extractants. The antibacterial activity of the extract of the walnut green husk against apple Alternaria Blotch was studied. It provides theoretical support for the reuse of walnut husk resources.【Methods】Four different concentration gradients of ethanol， ethyl acetate， petroleum ether and methanol （25%， 50%， 75%， 100%） were used to extract the green husk of Walnut in fructescence. The effect of walnut green husk extract on the growth of alternaria Mali were studied. 【Results】The results showed that the extracts of walnut green husk （0.062 5 mL/100 mL， 0.125 mL/100 mL， 0.25 mL/100 mL， 0.5 mL/100 mL， 1 mL/100 mL） were effective against alternaria Mali in vitro， in particular， 50% methanol extract of walnut green husk， the most significant inhibition of hypha growth， inhibition rate of 80.71%， EC50 value of 0.001 643 6.【Conclusion】The experiment can provide a basis for the research on the prevention and control of apple spotted defoliation by walnut green husk extract， and provide theoretical support for the reuse of walnut green husk resources.

Keywords：apple alternaria blotch; walnut green husk extract; antibacterial effect

蘋果斑點落葉?。ˋlternaria alternata f.sp.mali）由蘋果鏈格孢的強毒株系感染所引起，病原性很強，是影響產(chǎn)量和質(zhì)量的常見蘋果病害［1］。防治方法目前有栽培管理法和藥物防治法，但藥物防治法需注意病菌的抗藥性。故研究人員開始進行生物防治法研究，如利用各種不同植物的提取物對病菌進行處理，比較其抑制率。核桃（Juglans regia L.），別稱胡桃、羌桃等，為胡桃科核桃屬多年生落葉喬木［2］ 。中國核桃產(chǎn)量近年來穩(wěn)中有升，核桃青皮是核桃收獲中產(chǎn)生的農(nóng)林廢料，存量巨大。核桃果實采收后，其作為廢料堆放在田間地頭，不斷污染環(huán)境，危害動植物生存，對生態(tài)環(huán)境造成破壞［3-4］。本試驗分別用石油醚、乙酸乙酯、甲醇、乙醇為提取液提取果實成熟期的核桃青皮，獲取不同濃度的核桃青皮提取物，通過抑菌活性測定，找到本試驗中抑菌活性最佳的提取試劑及其濃度，為核桃青皮提取物防治蘋果斑點落葉病菌研究提供依據(jù)，為核桃青皮資源的再利用提供理論支持。

1" 材料和方法

1.1" 試驗材料

供試核桃：從河北昌黎選取10～20株健壯無病害的野生核桃樹，8月底從每株樹上選取10個健康無病害的核桃備用。然后用青皮提取物對梨黑斑病原菌進行抑菌試驗。

供試病菌：在衡水舊城村蘋果園中采集患蘋果貯藏期斑點落葉病果實，貯藏15d后分離患病組織中的病原菌并進行純化，獲得蘋果斑點落葉病菌，在4℃下保存。

1.2" 試驗方法

1.2.1" 核桃青皮提取物的制備

將果實成熟期的核桃青皮烘干、粉粹、過100目篩，制成核桃青皮粉末。

設(shè)置25%、50%、75%、100% 4個提取劑濃度梯度。乙醇、甲醇和乙酸乙酯提取物料液比為1∶10，稱取核桃青皮粉末10g加入定容好的有機溶劑中，25℃搖床8h，4層紗布濾去殘差得到核桃青皮提取液并濃縮至10mL，4℃存放備用；石油醚提取物制備：采用索氏提取法提取，所用儀器為索氏提取器，料液比為1∶10，在索氏提取器中浸提8h，獲得提取物，加入石油醚，定容至100mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2" 病原菌的分離、純化和鑒定

參照方中達［5］方法。用70%酒精擦拭病果表面，無菌水沖洗干凈后，切取一小塊染病組織，在超凈工作臺中移到PDA培養(yǎng)基上，于25℃保溫培養(yǎng)，待長出分生孢子后進行單孢分離，純化后在PDA培養(yǎng)基上保存待用。各菌株在PDA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)至菌落直徑接近2/3培養(yǎng)皿直徑時，用打孔器在菌落邊緣打取直徑 5 mm的菌餅。

1.2.3" PDA培養(yǎng)基制備

參照方中達［5］方法進行。首先用天平稱量去皮的馬鈴薯200g，將其切成小方形塊，放入鍋中，加無菌水1000 mL，煮沸30min。用紗布濾去馬鈴薯殘渣，將馬鈴薯濾液放回鍋中，加入瓊脂15～20g，加熱熔化加入葡萄糖20g。待葡萄糖溶解后，加入適量的水以補充加熱過程中損失的水分，定容至1 000mL。分裝后，在0.103MPa、121℃下，高壓蒸氣滅菌20min。

1.3" 對菌絲生長的抑制活性測定

在無菌條件下，從母液分別量取0.0625、0.125、0.25、0.5、1mL核桃青皮提取物加入100 mL的PDA培養(yǎng)基中，搖勻后趁熱倒入直徑90mm的培養(yǎng)皿內(nèi)。滅菌后用直徑為6mm打孔器在菌落邊沿處鉆取適量菌齡相同的菌餅，接種于含有殺菌劑的PDA培養(yǎng)基的中央，菌絲面向下，每皿接種1個菌餅，同等濃度做3次重復(fù)試驗。25℃光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)6d，用十字交叉法測量供試真菌菌落生長直徑。以不加核桃青皮提取物作為對照（CK），計算菌絲生長的抑制率。

菌絲生長抑制率（%）=［（對照菌落直徑-處理菌落直徑）］/對照菌落直徑×100%

1.4" 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010軟件處理，以藥劑質(zhì)量濃度的對數(shù)為橫坐標、抑制率幾率值為縱坐標作圖，得到毒力回歸方程和有效抑制中濃度（EC50）值。

2" 結(jié)果分析

2.1" 果實成熟期核桃青皮乙醇提取物抑菌效果

由表1可知，25%乙醇提取物對蘋果斑點落葉病菌的抑制率隨著提取物濃度的增加呈現(xiàn)升高—降低—升高的趨勢。其中，提取物濃度在10mL/L時抑制率最高，為54.61%。

50%乙醇提取物對蘋果斑點落葉病菌的抑制率隨著提取物濃度的增加呈現(xiàn)降低-升高—降低—升高的趨勢。其中，提取物濃度在10 mL/L時抑制率最高，為62.70%。

75%乙醇提取物對蘋果斑點落葉病菌的抑制率隨著提取物濃度的增加呈現(xiàn)逐漸升高的現(xiàn)象。其中提取物濃度為10 mL/L時抑制率最高，為75.18%。

100%乙醇提取物對蘋果斑點落葉病菌的抑制率隨著提取物濃度的增加呈現(xiàn)逐漸降低后升高的現(xiàn)象。其中，提取物濃度為10mL/L時抑制率最高，為80.14%。

由上述可得，100%核桃青皮乙醇提取物在濃度為10mL/L時抑制率最高，為80.14%。

由表2可知，4種不同濃度的核桃青皮乙醇提取物對蘋果斑點落葉病菌的毒力回歸方程的相關(guān)系數(shù)均超過0.9000，說明試驗具備較高的精密度。由各濃度的EC50值可知，100%濃度的核桃青皮乙醇提取物抑菌效果最好，毒力最強，值為1 076.918，相關(guān)系數(shù)為0.9996762。

綜上所述，在S4期核桃青皮乙醇提取物中，100%濃度的核桃青皮乙醇提取物抗菌效果最佳，毒力最強，最高抑制率為80.14%，EC50值為1 076.918。

2.2" 果實成熟期核桃青皮乙酸乙酯提取物抑菌效果

表3中，25%乙酸乙酯提取物對蘋果斑點落葉病菌的抑制率隨著提取物濃度的增加呈現(xiàn)先升高后降低又升高的現(xiàn)象。其中，濃度為0.625mL/L時抑制率最高。

50%乙酸乙酯提取物對蘋果斑點落葉病菌的抑制率隨著提取物濃度的增加呈現(xiàn)先升高后降低的現(xiàn)象，其中濃度為1.25mL/L時抑制率最高。

75%乙酸乙酯提取物對蘋果斑點落葉病菌的抑制率隨著提取物濃度的增加呈現(xiàn)逐漸降低的現(xiàn)象，其中濃度為10mL/L時抑制率最高。

100%乙酸乙酯提取物對蘋果斑點落葉病菌的抑制率隨著提取物濃度的增加呈現(xiàn)先降低后升高又降低的現(xiàn)象。其中，濃度為2.5mL/L時抑制率最高。

由上述可得，50%核桃青皮乙酸乙酯提取物在1.25mL/L濃度時表現(xiàn)為抗菌效果最佳，值為62.41%。

表4顯示，50%、75%、100% 3個濃度乙酸乙酯提取物對蘋果斑點落葉病菌的毒力回歸方程的相關(guān)系數(shù)高于0.9000，說明該試驗具有較高的精密度。因25%濃度乙酸乙酯提取物相關(guān)系數(shù)低于0.9000，所以該數(shù)據(jù)不符合實際。由除25%濃度以外各濃度的EC50值可知，50%濃度的核桃青皮乙酸乙酯提取物抑菌效果最好，毒力最強，值為2 047.5，相關(guān)系數(shù)為0.9998083。

綜上所述，在果實成熟期核桃青皮乙酸乙酯提取物中，50%濃度核桃青皮乙酸乙酯提取物抑菌效果最好，毒力最強，最高抑制率為62.41%，EC50值為2 047.5。

2.3" 果實成熟期核桃青皮石油醚提取物抑菌效果

表5中，25%石油醚提取物對蘋果斑點落葉病菌的抑制率隨著提取物濃度的增加呈現(xiàn)降低的趨勢。其中，濃度為0.625mL/L時抑制率最高。

50%石油醚提取物對蘋果斑點落葉病菌的抑制率隨著提取物濃度增加呈現(xiàn)降低升高的趨勢，其中，濃度為0.625mL/L時抑制率最高。

75%、100%石油醚提取物對蘋果斑點落葉病菌的抑制率均隨著提取物濃度的增加呈現(xiàn)降低現(xiàn)象，其中濃度為0.625mL/L時抑制率最高。

100%石油醚提取物在0.625mL/L濃度時表現(xiàn)為抗菌作用最佳，值為16.74%。

表6顯示，25%、50%、75%、100% 4個濃度石油醚提取物對蘋果斑點落葉病菌的毒力回歸方程的相關(guān)系數(shù)高于0.9000，說明該試驗具有較高的精密度。100%濃度的核桃青皮石油醚提取物抑菌效果最好，毒力最強，EC50值為211095.75，相關(guān)系數(shù)為0.9823391。

綜上所述，在果實成熟期核桃青皮石油醚提取物中，100%濃度的核桃青皮石油醚提取物抑菌效果最好，毒力最強，最高抑制率為16.74%，EC50值為211 095.75。

2.4" 果實成熟期核桃青皮甲醇提取物抑菌效果

由表7可得，25%核桃青皮甲醇提取物對蘋果斑點落葉病菌的抑制率隨著提取物濃度的增加呈現(xiàn)先降低后升高又降低的現(xiàn)象。其中，濃度為1.25mL/L時抑制率最高。

50%核桃青皮甲醇提取物對蘋果斑點落葉病菌的抑制率隨著提取物濃度的增加呈現(xiàn)先升高后降低的現(xiàn)象，其中濃度為5mL/L時抑制率最。

75%、100%核桃青皮甲醇提取物對蘋果斑點落葉病菌的抑制率隨著提取物濃度的增加呈現(xiàn)升高又降低再升高的現(xiàn)象。其中濃度為10、1.25 mL/L時抑制率最高。

50%甲醇提取物在濃度為5 mL/L時抑制率最高，為80.71%。

表8顯示，4種不同濃度核桃青皮甲醇提取物對蘋果斑點落葉病菌的毒力回歸方程的相關(guān)系數(shù)高于0.9000，說明該試驗具有較高的精密度。50%濃度的核桃青皮甲醇提取物具有最佳的抑菌效果，毒力最強，值為0.016 436，相關(guān)系數(shù)為0.9994490。

表8" 核桃青皮甲醇提取物對蘋果斑點落葉病菌的室內(nèi)毒力測定

甲醇濃度/%毒力回歸方程EC50/（mL·L-1）相關(guān)系數(shù)r

25y=-0.195 4x+5.678 729 756.700.999 942 8

50y=0.118 4x+5.329 60.016 4360.999 449 0

75y=0.378 6x+4.150 31 755.960.999 967 5

100y=-0.081 3x+4.858 30.180 630.999 656 4

綜上所述，在果實成熟期核桃青皮甲醇提取物中，50%濃度的核桃青皮甲醇提取物具有最佳的抑菌效果，毒力最強，最高抑制率為80.71%，EC50值為0.016 436。

3" 討論與結(jié)論

根據(jù)試驗數(shù)據(jù)的整理與分析可得，乙醇、乙酸乙酯、石油醚、甲醇4種溶劑的核桃青皮提取物對蘋果斑點落葉病菌菌絲生長均具有不同程度的抑制作用，其中以50%甲醇提取的核桃青皮提取物抑制作用最強。不同生長階段用50%甲醇提取的核桃青皮也有不同程度的抗菌作用。

經(jīng)查閱文獻發(fā)現(xiàn)，喬永剛等［6］在核桃青皮提取物對4種植物枯萎病菌的抑菌作用中，比較得出甲醇對于核桃青皮活性物質(zhì)提取率最高，且甲醇提取物的抑制率高于石油醚提取物的與本試驗中結(jié)論符合。本研究發(fā)現(xiàn)，核桃青皮提取物在抑制真菌活性方面，甲醇提取液效果最顯著。與蘇學友等［7］的研究結(jié)果相符，甲醇提取液對6種植物病原真菌的抑制效果明顯優(yōu)于乙酸乙酯和石油醚提取液。具體而言，甲醇提取液＞乙酸乙酯提取液＞石油醚提取液。

以上試驗進一步研究甲醇提取物的不同有機溶劑萃取相分離純化比較其抑制效果，是本試驗需要繼續(xù)改進研究的方向。

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參考文獻

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