不同氮肥形態(tài)對李氏禾鉻富集能力的影響

關(guān)鍵詞：氮肥形態(tài)；鉻污染；李氏禾；根系特征；修復(fù)效率

鉻作為被廣泛使用的工業(yè)原料，在工業(yè)生產(chǎn)過程中會被排放到環(huán)境中，對環(huán)境造成污染，同時其可以通過食物鏈在人體中累積，對身體健康產(chǎn)生有害影響，所以土壤鉻污染一直是人們關(guān)注的熱點(diǎn)環(huán)境問題之一。植物修復(fù)作為土壤修復(fù)的一種有效且低成本技術(shù)，植物生物量和土壤中重金屬的生物利用度是影響植物修復(fù)效率的關(guān)鍵因素。李氏禾（Leersiahexandra Swartz）是中國境內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)的鉻超富集植物，為多年生植物，能多次刈割，具有生物量大、生長迅速等特點(diǎn)，是修復(fù)土壤鉻污染的一種理想植物。

氮作為植物生長的必需營養(yǎng)元素，施加氮肥能提高植物的葉綠素含量，促進(jìn)植物生物量積累。而且植物生長發(fā)育受植物激素調(diào)控，施加氮肥可能會影響植物體內(nèi)的植物激素含量，從而對植物生長產(chǎn)生影響。在植物修復(fù)技術(shù)中，植物生物量的大小對植物重金屬累積量有直接影響。近年來，有研究表明，不同氮肥形態(tài)對超富集植物東南景天的生物量影響不同，進(jìn)而影響其對重金屬的累積量。同時，不同形態(tài)氮肥會在土壤中發(fā)生不同反應(yīng)，對土壤pH值的影響不同。土壤中重金屬遷移轉(zhuǎn)化受土壤pH值影響，而土壤重金屬遷移轉(zhuǎn)化可能改變土壤重金屬賦存形態(tài)占比，從而影響植物吸收效率。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，合理地施加氮肥能顯著提高植物根系活力，且不同氮肥形態(tài)會對植物根系形態(tài)產(chǎn)生不同影響，如銨態(tài)氮能促進(jìn)植物的根直徑增加，而硝態(tài)氮能促進(jìn)植物側(cè)根發(fā)育，從而增加植物根長。植物根系是植物吸收重金屬的重要器官，有研究發(fā)現(xiàn)植物重金屬含量與植物的總根長、根表面積、根體積呈正相關(guān)，所以根系形態(tài)的變化可能會影響植物對重金屬的吸收，從而影響重金屬在植物組織中的累積。而植物根系活性會受重金屬抑制，植物根系活性的降低會影響根系發(fā)育。所以在鉻污染土壤中研究施加不同形態(tài)氮肥對李氏禾根系形態(tài)與根系活力的影響，對李氏禾鉻吸收機(jī)理具有重要意義。

本試驗(yàn)在張學(xué)洪等的研究基礎(chǔ)上，在鉻污染土壤中，以超富集植物李氏禾作為研究對象，增加酰胺態(tài)氮及氯化銨，對施氮條件進(jìn)行優(yōu)化，施加0.02mol·kg-1的不同形態(tài)的氮肥。通過對李氏禾的生物量、根系形態(tài)特征、鉻含量和土壤鉻含量等進(jìn)行分析，探究施加不同形態(tài)氮肥對李氏禾富集能力的影響，以期闡明氮肥對強(qiáng)化李氏禾鉻修復(fù)機(jī)制，為鉻污染土壤場地應(yīng)用提供理論參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

李氏禾幼苗采自于廣西壯族自治區(qū)桂林市荔浦市某礦區(qū)，對采回來的李氏禾幼苗進(jìn)行挑選修剪后，于溫室下用20%的Hoagland營養(yǎng)液于2.5L塑料桶中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)7d，使其長出根。

供試土壤選用桂林市雁山區(qū)桂林理工大學(xué)校園土，土壤在陰涼處自然風(fēng)干后，挑去其中的雜質(zhì)、樹根和落葉等，將所取土樣研磨，充分混勻后過10目篩。土壤基本理化性質(zhì)：pH4.97，有機(jī)質(zhì)50.1g·kg-1，銨態(tài)氮16.0mg·kg-1，速效磷49.1mg·kg-1，速效鉀144mg·kg-1，總鉻含量66.4mg·kg-1。以溶液形式添加K2Cr202配制鉻污染土，平衡3周后測定土壤總鉻含量為315.1mg·kg-1。

1.2盆栽試驗(yàn)

稱取2kg供試土壤裝入規(guī)格為2.5L（高21cm，直徑19cm）的塑料桶中，選取生長一致的李氏禾移人盆內(nèi)，每盆20株。試驗(yàn)共設(shè)6個處理，每個處理3次重復(fù)。6個處理分別為：硝酸鈣（X）、尿素（UN）、氯化銨（NC）、硝酸銨（NN）、硫酸銨（NS）5種氮肥處理組和對照處理組（CK，不施加氮肥）。施加氮肥量為0.02mol·kg-1，處理60d后收獲植物，盆栽收樣時不同處理的李氏禾如圖1所示。

1.3植物及土壤樣品的采集、處理及測定方法

1.3.1李氏禾生長指標(biāo)及鉻含量的測定

李氏禾種植60d收獲，在收樣前測量株高和葉綠素含量。用直尺從盆栽李氏禾根部測量至李氏禾最高處作為株高；采用95%乙醇提取一分光光度法測定葉綠素含量。收獲后的李氏禾用自來水洗凈后，再用去離子水潤洗3次，將清洗后的李氏禾分成根部和地上部待用。將洗凈的李氏禾擦干放進(jìn)信封置于烘箱中105℃殺青30min后，75℃烘干至恒質(zhì)量。將根、莖、葉分開用電子天平測其干質(zhì)量。

稱取烘干磨碎的李氏禾樣品0.2g，用HN03-H202消解，消解后的李氏禾采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（PerkinElmer Optima 7000 DV）測定鉻含量，并采用國家一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW07603，灌木枝葉）進(jìn)行質(zhì)量控制，加標(biāo)回收率為90.0%-102.5%。

1.3.2李氏禾根系活力的測定

采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）法測定根系活力。稱取新鮮的李氏禾根系0.2g完全浸沒于1% TTC溶液和等量0.1mol·L-1磷酸緩沖液混合液中，37℃避光孵育1-3h后加入2mL硫酸（1mol·L-1）以終止反應(yīng)。將根系取出，擦干水分后與3-5mL乙酸乙酯一起放在研缽內(nèi)研碎，以提取出三苯基甲腙（TTF）。把紅色浸提液過濾到10mL容量瓶，用乙酸乙酯定容，在波長485nm下測定吸光度。通過TTF標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品的TTF含量，即為李氏禾根系活力（TTFmg·g-1·h-1）。

1.3.3李氏禾的根系形態(tài)測定

李氏禾收獲后，將洗凈的根部剪下，用直尺測量根部長度，然后將根放進(jìn)有去離子水的塑封袋中。將李氏禾根系平鋪在根系掃描系統(tǒng)（萬深LA-S植物根系分析系統(tǒng)）的樹脂平板上進(jìn)行掃描，用鑷子將重疊的部分分開。測定的根系形態(tài)包括根平均直徑、總根表面積、總根長和總根體積。

1.3.4李氏禾的植物激素測定

采用固相萃取（SPE）和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MSIMS）對6種植物激素[順式玉米素核苷-O-糖苷（cZROG）、異戊烯腺嘌呤-7-葡糖苷（iP7G）、2-甲硫基順式玉米素核苷（2MeScZR）、N6-異戊烯腺嘌呤（IP）、異戊烯腺嘌呤-9-葡糖苷（iP9G）和反式一玉米素-9-B-葡萄糖苷（tZOG）]進(jìn)行分析和測定。將稱質(zhì)量后的樣品研磨后放人10mL離心管中，加入5mL提取液（甲醇：水：甲酸=15：4：1，含0.5%二丁基羥基甲苯）漩渦混合1min、超聲振蕩30min，于-40℃下靜置60min。固相萃取：（1）活化，用3mL水和3mL甲醇洗滌萃取柱。（2）吸附，將上清液注入柱中，流速應(yīng)小于1mL·min-1。（3）淋洗，用3 mL水和10%的甲醇清洗色譜柱。（4）洗脫，1mL甲醇。洗脫液用蒸發(fā)濃縮器干燥，然后加入200uL 80%甲醇復(fù)溶，再次旋轉(zhuǎn)離心（12000r·min-1，10min）。最后用LC-MS/MS分析上清液。

標(biāo)準(zhǔn)品購自源葉生物科技有限公司。準(zhǔn)確取標(biāo)準(zhǔn)溶液（2.5ug·mL-1）0.20mL，用80%的甲醇定容至1mL配制成濃度為500ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，再用80%的甲醇稀釋成標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。根據(jù)不同濃度及相應(yīng)濃度下標(biāo)品的峰面積繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

儀器：液相色譜Waters Acquity UPLC，質(zhì)譜ABSCIEX 5500 Qtrap-MS。

色譜柱：Acquity UPLC HSS T3（1.8um，2.1mmX100mm）。

1.3.5土壤理化性質(zhì)測定

土壤pH值采用水土比2.5：1（V/m）提取，pH計測定；有機(jī)質(zhì)用重鉻酸鉀加熱法測定；銨態(tài)氮用氯化鉀浸提，流動注射分析儀（荷蘭SKALAR SAN++）測定；速效磷用碳酸氫鈉一分光光度法測定；速效鉀用乙酸銨浸提法測定。

1.3.6土壤鉻含量和鉻形態(tài)的測定

土壤總鉻含量測定采用HN03-H202消解法，土壤鉻質(zhì)量控制用國家一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（GBW07404，土壤），加標(biāo)回收率為89.8%-101.0%。施肥種植后的土壤鉻賦存形態(tài)采用BCR四步連續(xù)提取法測定。消解和提取后的鉻含量用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（PerkinElmer Optima 7000 DV）測定。

1.4數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析方法

富集系數(shù)（BCF）=李氏禾地上部鉻含量（mg·kg-1）／土壤總鉻含量（mg·kg-1）

修復(fù)效率（土壤鉻去除率）=（修復(fù)前土壤總鉻含量一修復(fù)后土壤總鉻含量）／修復(fù)前土壤總鉻含量×100%

使用Microsoft Excel 2019和SPSS 26對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計學(xué)分析。植物生長指標(biāo)及修復(fù)效率采用單因素方差分析（ANOVA），通過最小顯著差數(shù)法（LSD）進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)（Plt;0.05）。植物激素含量采用t檢驗(yàn)（Student'st-test）分析顯著差異性。使用Origin 2021繪制柱狀圖，使用R4.1.3中R包“Heatmap”進(jìn)行相關(guān)性分析并繪制熱圖。

2結(jié)果與分析

2.1施加不同形態(tài)氮肥對李氏禾生長的影響

如圖2（a）所示，施加不同形態(tài)氮肥對李氏禾各部位生物量均有顯著性提高，其中施加硫酸銨的李氏禾生物量最大，相比于對照，地上部生物量增加了1.98倍、根部干質(zhì)量增加了88.3% （Plt;0.05）。如圖2（b）所示，施加不同形態(tài)氮肥后李氏禾株高均有顯著增長。圖2（c）為施加不同形態(tài)氮肥對李氏禾葉綠素含量的影響，除了施加尿素外，施加其他形態(tài)氮肥的李氏禾的葉綠素含量比對照增加35%-50%，說明施加氮肥有利于提高葉綠素含量，促進(jìn)李氏禾生長。2.2施加不同形態(tài)氮肥對李氏禾根系特征的影響

施加不同形態(tài)氮肥對李氏禾的根系特征影響不同。由圖3（a）可以看出，施加氮肥對李氏禾根系伸長均有促進(jìn)作用，根長增長的大小順序?yàn)槟蛩豨t;硝酸銨gt;硫酸銨gt;硝酸鈣gt;氯化銨gt;對照。如圖3（b）所示，施加硝酸鈣和硝酸銨的總根長有顯著增加，分別比對照增加22.0%和59.4%，根據(jù)根系掃描圖顯示，應(yīng)該是側(cè)根發(fā)育比較多，從而使總根長有顯著增加。如圖3（c）和圖3（d）所示，施加不同形態(tài)氮肥后，硝酸銨處理的李氏禾總根表面積和總根體積增長最顯著，總根表面積為對照的2.15倍，總根體積比對照增長99.5%。如圖3（e）所示，施加不同形態(tài)氮肥有利于李氏禾根平均直徑增大，其中施加硫酸銨比對照增長50%。如圖3（f）所示，與對照相比，除了施加氯化銨外，施加其他形態(tài)氮肥的李氏禾根系活力均有提高，其中施加硫酸銨的李氏禾根系活力最高，比對照增加1.08倍。

2.3施加硫酸銨和尿素對李氏禾葉片植物激素的影響

選取施加不同形態(tài)氮肥后生物量相差最大的硫酸銨和尿素處理，來測定李氏禾葉片中的植物激素。圖4為測定的6種植物激素的結(jié)果，其中硫酸銨的cZROG和iP7G高于尿素，且cZROG存在顯著差異，硫酸銨的IP、iP9G、tZOG均顯著低于尿素，而兩種氮肥的2MeScZR無顯著差異。綜上推測，cZROG和iP7G可能是調(diào)控李氏禾生長的關(guān)鍵植物激素，導(dǎo)致施加硫酸銨與尿素之間的李氏禾生物量差異顯著。

2.4施加不同形態(tài)氮肥對土壤鉻含量和形態(tài)及土壤pH的影響

施加不同形態(tài)氮肥種植李氏禾60 d后的土壤鉻含量如圖5（a）所示，與對照相比，施加氮肥種植李氏禾后的土壤鉻含量均有所降低。圖5（b）為種植后土壤鉻賦存形態(tài)占比變化，與對照相比，土壤鉻弱酸提取態(tài)、可還原態(tài)和可氧化態(tài)占比有所下降，土壤鉻殘渣態(tài)占比較高。如圖5（c）所示，與對照相比，施加硝酸鈣、氯化銨、硝酸銨、硫酸銨的土壤pH值均有所下降，只有施加尿素的土壤pH值顯著上升，與對照相比增長10.0%，

2.5施加不同形態(tài)氮肥對李氏禾鉻修復(fù)效率的影響

李氏禾鉻含量如圖6（a）所示，與對照相比，施加硝酸鈣、尿素、硝酸銨、硫酸銨的李氏禾葉鉻含量和根鉻含量均有顯著增加，地上部鉻含量分別比對照組增加10.3%、23.4%、18.7%、36.8%，說明施加氮肥有利于提高李氏禾對鉻的吸收。圖6（b）為李氏禾鉻累積量，施加不同形態(tài)氮肥有利于提高李氏禾鉻累積量，其中，施加硫酸銨的李氏禾鉻累積量最高，地上部和根鉻累積量分別達(dá)到941.4ug·pot-1和1239.3ug·pot-1。施加不同形態(tài)氮肥對李氏禾BCF均存在顯著性影響，如圖6（c）所示，與對照相比，氯化銨的BCF降低10.2%，硝酸鈣、尿素、硝酸銨、硫酸銨分別增加了16.6%、27.2%、22.2%、46.2%。土壤中鉻的去除率如圖6（d）所示，施加氮肥的李氏禾的土壤鉻去除率均有顯著性提高，為對照組的3.23-5.56倍。

2.6李氏禾生理機(jī)制和土壤參數(shù)與李氏禾鉻修復(fù)效率的相關(guān)性

采用Pearson相關(guān)分析評估各參數(shù)對李氏禾鉻修復(fù)效率的影響，結(jié)果如圖7所示。土壤鉻弱酸提取態(tài)、可還原態(tài)、可氧化態(tài)和土壤總鉻含量均與土壤鉻去除率存在顯著負(fù)相關(guān)。李氏禾株高、葉綠素含量、地上部干質(zhì)量、根干質(zhì)量、根平均直徑、總根表面積、總根體積、根系活力均與根鉻含量、地上部鉻累積量、根鉻累積量、土壤鉻去除率存在顯著正相關(guān)，其中，地上部干質(zhì)量、根平均直徑、根系活力還與李氏禾鉻含量、鉻累積量、富集系數(shù)、土壤鉻去除率存在極顯著相關(guān)性。殘渣態(tài)鉻和李氏禾總根長與李氏禾鉻修復(fù)效率均無顯著相關(guān)性。

3討論

3.1施加不同形態(tài)氮肥對李氏禾地上部生長和根系發(fā)育的影響

植物葉片光合作用是植物體內(nèi)能量傳遞和物質(zhì)累積的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，而氮直接參與了光合色素的合成。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)施加不同形態(tài)氮肥對李氏禾葉綠素含量影響存在差異（圖2），其中，施加銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的李氏禾葉綠素含量和生物量均高于酰胺氮，這可能是硝態(tài)氮和銨態(tài)氮可以被李氏禾直接吸收利用，而酰胺氮需要轉(zhuǎn)化為無機(jī)氮才能被李氏禾利用，導(dǎo)致李氏禾對氮肥吸收效率不同，影響了李氏禾葉綠素合成，對李氏禾生物量產(chǎn)生差異影響。植物內(nèi)源激素對植物的生長發(fā)育也有調(diào)控作用，李氏禾葉片植物激素含量結(jié)果表明（圖4），施加硫酸銨的李氏禾葉片cZ-ROG和iP7G高于施加尿素，這可能是因?yàn)檎{(diào)控李氏禾生長的關(guān)鍵植物激素是cZROG和iP7G，所以施加硫酸銨的李氏禾生物量顯著高于尿素。此外，本課題組研究還發(fā)現(xiàn)合理的刈割頻率、刈割高度和刈割時間也能提高李氏禾修復(fù)效率，刈割后的李氏禾再生有較大的氮需求。合理的施用硫酸銨可能加快李氏禾再生，兩者結(jié)合會進(jìn)一步提高李氏禾對鉻污染的修復(fù)效率。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)施加不同形態(tài)氮肥對李氏禾根系形態(tài)發(fā)育和根系活力影響不同（圖3），施加硝酸銨的總根長、根表面積和根體積最大，分別為557.89cm、131.47cm2和4.01cm3；施加硫酸銨的根直徑和根系活力最大，分別為0.75mm和0.08TTFmg·g-1·h-1。這與前人研究發(fā)現(xiàn)的硝態(tài)氮有利于植物根的伸長，銨態(tài)氮有利于根的加粗，銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的聯(lián)用會促進(jìn)植物側(cè)根發(fā)育和根伸長的結(jié)果相似。

3.2施加不同形態(tài)氮肥對李氏禾鉻富集能力的影響

植物主要通過根部吸收重金屬，所以根系形態(tài)的變化會影響植物吸收重金屬的能力。本試驗(yàn)中施加不同形態(tài)氮肥下李氏禾根系形態(tài)有所改變，從而影響了李氏禾對鉻的吸收，其中，施加硫酸銨的李氏禾鉻含量最高，地上部和根部分別為205.9mg·kg-1和514.3mg·kg-1。值得注意的是，通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)（圖7）：與李氏禾總根表面積和總根體積相比，根平均直徑與李氏禾鉻含量相關(guān)性更強(qiáng)，這可能是因?yàn)橹参锔骄睆较噍^于總根表面積對土壤孔隙度的影響更大，根平均直徑越大所產(chǎn)生的孔隙越大，從而更有利于土壤鉻的遷移轉(zhuǎn)化，提高李氏禾對鉻的吸收。此外，植物對土壤中重金屬的吸收與土壤中重金屬的生物有效性有關(guān)，提高重金屬活性可以促進(jìn)超富集植物對重金屬的吸收，提高植物累積量，這是植物修復(fù)發(fā)展的一個新方向。重金屬的弱酸提取態(tài)和可還原態(tài)易被植物吸收，可氧化態(tài)和殘渣態(tài)較穩(wěn)定，但可氧化態(tài)在酸性條件下可以被還原，且還原后更有利于植物吸收。本試驗(yàn)中，與對照相比，施加不同形態(tài)氮肥種植李氏禾后的土壤鉻弱酸提取態(tài)、可還原態(tài)和可氧化態(tài)含量顯著下降（圖5），這可能是施肥后土壤中鉻活性提高，李氏禾對鉻吸收有所增加。綜上，植物重金屬含量和土壤重金屬含量會影響植物富集能力，施加不同形態(tài)氮肥提高李氏禾鉻含量和土壤鉻去除率后，有利于提高李氏禾的富集系數(shù)，其中施加硫酸銨的李氏禾富集系數(shù)最高，為對照的1.45倍。富集系數(shù)的提高意味著相同質(zhì)量的李氏禾可以富集更多土壤中的鉻，使李氏禾土壤鉻修復(fù)效率得到提高。

4結(jié)論

（1）施加不同形態(tài)氮肥有利于促進(jìn)李氏禾生長，提高葉綠素含量、生物量和根系活力，并改變其根系形態(tài)指標(biāo)。

（2）施加不同形態(tài)氮肥對土壤鉻賦存形態(tài)、李氏禾根系形態(tài)和根系活力的改變有利于提高李氏禾鉻吸收量和土壤中鉻去除率。其中，施加硫酸銨的李氏禾修復(fù)效果最顯著，其富集系數(shù)較對照組提高47.9%，土壤鉻去除率為對照的5.56倍。