發(fā)酵飼料對(duì)蛋雞糞便堆肥氨氣排放與微生物群落的影響

摘要：為探究飼喂發(fā)酵飼料對(duì)蛋雞糞便堆肥腐熟、氨氣排放及微生物群落組成的影響，以飼喂基礎(chǔ)日糧蛋雞為對(duì)照組（T1），試驗(yàn)組蛋雞分別飼喂基礎(chǔ)日糧加2.5%（T2）、5.0%（T3）和10.0%（T4）的發(fā)酵飼料，收集各組雞糞進(jìn)行好氧堆肥試驗(yàn)。結(jié)果表明：隨堆肥進(jìn)行，各組堆肥溫度均先升高再降低，pH在高溫期快速?gòu)?.0左右升至9.1。至堆肥結(jié)束，T3組和T4組的種子發(fā)芽指數(shù)分別為99.4%和87.1%，遠(yuǎn)高于T1組的57.7%，達(dá)到有機(jī)肥標(biāo)準(zhǔn)。氨氣日排放量在高溫期達(dá)到峰值，隨后逐漸降低；氨氣總排放量T3組最低，為14.43 mg·kg-1，較T1組低0.76 mg·kg-1。微生物生物信息學(xué)分析顯示，添加發(fā)酵飼料降低了蛋雞糞便中細(xì)菌的多樣性，主要的細(xì)菌門為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidota）、放線菌門（Actinobacteriota）和變形菌門（Proteobacteria），其中T2、T3和T4組的乳桿菌屬相對(duì)豐度較Tl組分別增加20.61%、6.62%和8.13%。隨堆肥進(jìn)行厚壁菌門的豐度降低，其他菌門的豐度增加。研究表明，蛋雞日糧添加5.0%的發(fā)酵飼料可提高蛋雞糞便中乳桿菌屬豐度，促進(jìn)蛋雞糞便的堆肥腐熟，并可減少堆肥過(guò)程中氨氣的總排放量。

關(guān)鍵詞：發(fā)酵飼料；蛋雞糞便；堆肥；氨氣排放；微生物

中圖分類號(hào)：S141.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1672-2043（2024） 08-1876-12 doi：10.11654/jaes.2023-0918

隨著國(guó)內(nèi)畜牧業(yè)的快速發(fā)展，畜禽養(yǎng)殖量不斷增加，產(chǎn)生的大量畜禽糞污造成了較高的環(huán)境污染風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)畜禽糞便進(jìn)行資源化利用是有效防范和降低畜禽糞便污染環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的有效途徑。從養(yǎng)殖源頭提高飼料利用率，減少未消化吸收的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如氮、磷、鉀等的排出，從養(yǎng)殖末端采用堆肥處理畜禽糞便等方式，轉(zhuǎn)化利用未消化吸收的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有助于實(shí)現(xiàn)畜禽養(yǎng)殖業(yè)綠色高效循環(huán)發(fā)展。

近年來(lái)隨著在飼料中禁用促生長(zhǎng)抗生素飼料添加劑，發(fā)酵飼料作為抗生素促生長(zhǎng)替代物已在畜禽生產(chǎn)中有較多應(yīng)用。發(fā)酵飼料是以植物性農(nóng)副產(chǎn)品（豆粕、玉米、棉籽粕、菜籽粕和中草藥等）為主要原料，采用固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵方式，通過(guò)有益微生物（乳酸菌、酵母菌、芽孢桿菌和霉菌等）的代謝作用，形成的營(yíng)養(yǎng)豐富、適口性好及活菌含量高的生物飼料，目前家禽發(fā)酵飼料多采用固體發(fā)酵方式生產(chǎn)。發(fā)酵飼料對(duì)畜禽生產(chǎn)的影響主要有3個(gè)方面：一是改善飼料品質(zhì)，降低粗纖維含量，提高粗蛋白含量，增強(qiáng)蛋白酶等酶活性，促進(jìn)腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，提高畜禽生產(chǎn)性能，如提高蛋雞產(chǎn)蛋率、改善蛋品質(zhì)等。二是調(diào)節(jié)腸道菌群，抑制有害菌群定殖和生長(zhǎng)，促進(jìn)有益菌群增殖。如Guo等發(fā)現(xiàn)發(fā)酵飼料對(duì)蛋雞盲腸微生物多樣性無(wú)顯著影響，但使厚壁菌門豐度顯著降低，乳酸菌、Megasphaera和Peptococcus的相對(duì)豐度增加。張孟陽(yáng)等指出發(fā)酵飼料可降低仔雞腸道菌群豐度和多樣性，顯著增加乳桿菌的豐度，降低脫硫弧菌屬、螺桿菌等致病菌的數(shù)量。三是改變畜禽糞便的成分含量、理化性質(zhì)和微生物群落構(gòu)成。如飼喂生物發(fā)酵飼料的牛糞全氮、全磷和有機(jī)質(zhì)含量顯著降低。飼喂發(fā)酵飼料的蛋雞糞便氮、鈣等含量降低。Winsen等指出發(fā)酵飼料使豬糞pH值顯著升高，同時(shí)減少豬糞腸桿菌科菌群。Tang等的研究表明發(fā)酵全價(jià)飼料可顯著提高仔豬糞便微生物群的OTU數(shù)量和多樣性。Zhu等發(fā)現(xiàn)飼喂發(fā)酵豆粕可顯著提高仔豬糞便放線菌、變形桿菌的水平。綜上所述，目前發(fā)酵飼料對(duì)畜禽生產(chǎn)影響的研究多集中在飼料利用方面，鮮有對(duì)后續(xù)的糞便堆肥處理的研究報(bào)道。

畜禽糞便需經(jīng)過(guò)堆肥腐熟，降解其中的植物毒性物質(zhì)等，才可還田供植物吸收利用。堆肥是利用微生物的代謝活動(dòng)，將糞便中的有機(jī)質(zhì)降解轉(zhuǎn)化為腐殖質(zhì)的過(guò)程。氮是糞肥中的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，與豬、牛等大家畜相比，家禽的消化道較短，糞便中的氮含量較高。氮在腐熟過(guò)程中易以氨氣的形式向外排放，是造成糞肥氮損失的主要因素，同時(shí)也會(huì)帶來(lái)環(huán)境污染問(wèn)題。在堆肥時(shí)可通過(guò)降低氨氣排放，減少氮損失，從而提高有機(jī)肥效力并降低環(huán)境污染。有研究指出堆肥腐熟的時(shí)長(zhǎng)與氮損失相關(guān)，如人糞便高溫堆肥的腐熟期較中溫堆肥縮短3-5 d，加快了有機(jī)物的腐熟，有效減少了氮損失。另有研究認(rèn)為糞便堆肥腐熟與日糧來(lái)源相關(guān)。徐張義等指出與高蛋白日糧相比，低蛋白日糧提高豬糞短時(shí)間內(nèi)好氧堆肥的腐熟度；盛清凱等發(fā)現(xiàn)飼喂發(fā)酵飼料的豬糞易腐熟。上述研究提示堆肥的腐熟時(shí)長(zhǎng)與日糧來(lái)源和氮損失相關(guān)，而日糧來(lái)源不同的堆肥腐熟是否與氮損失直接相關(guān)并不明確。發(fā)酵飼料中的微生物是否會(huì)對(duì)雞糞堆肥腐熟產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響氮元素的轉(zhuǎn)化和微生物群落的組成未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究主要探究不同添加水平的發(fā)酵飼料飼喂蛋雞對(duì)糞便堆肥腐熟、氨氣排放和微生物群落組成的影響，以期為發(fā)酵飼料的開(kāi)發(fā)利用和后續(xù)糞污的資源化利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取體質(zhì)量相近的36周齡的海蘭褐蛋雞240只，分為4組（T1、T2、T3、T4），每組60只，設(shè)4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15只。T1組為對(duì)照組，飼喂基礎(chǔ)日糧，T2、T3、T4組為試驗(yàn)組，分別在基礎(chǔ)日糧中添加2.5%、5.05%和10.0%的發(fā)酵飼料?；A(chǔ)日糧組成：玉米62.7%、豆粕26.4%、石粉8.6%、預(yù)混料2.3%；營(yíng)養(yǎng)成分：代謝能11.09 MJ·kg-1、粗蛋白16.5%、鈣3.5%、總磷1.0%、蛋氨酸0.35%、賴氨酸0.85%。發(fā)酵飼料的主要原料：玉米、玉米副產(chǎn)品、小麥麩、豆粕；營(yíng)養(yǎng)成分：總酸（有機(jī)酸總量）≥6%、粗蛋白≥18%、粗灰分≤12%、粗纖維≤8%、水分≤40%；糞腸球菌（Enterococcusfaecalis）≥8x108 CFU．g-1、丁酸梭菌（Clostridiumbutyricum）≥8x 108 CFU·g-1、釀酒酵母菌（Saccharomycescerevisiae）≥2X 108 CFU·g-1、凝結(jié)芽孢桿菌（Bacilluscoagulans）≥2x108 CFU·g-1。蛋雞飼喂8周后，在第9周連續(xù)3d收集各組雞糞進(jìn)行堆肥試驗(yàn)。

1.2 堆肥試驗(yàn)

稱取各組雞糞8 kg與稻殼按5：1比例混合均勻，碳氮比為24，置于通氣發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐通氣量為0.4 L·min-1·kg-1，每日上午10時(shí)記錄堆肥溫度，并用2%硼酸溶液20 mL采集氨氣（NH3）1 h。在堆肥第0、1、3、5、10、14、21、28天進(jìn)行翻堆后采集堆肥樣品，樣品一部分保存于-20℃?zhèn)錅y(cè)pH、電導(dǎo)率（EC）、總氮（TN）、硝態(tài)氮（NO-3-N）、銨態(tài)氮（NH+4-N）、種子發(fā)芽指數(shù)（GI），一部分保存于-80℃待提取微生物總DNA。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

理化指標(biāo)的測(cè)定。氨氣：鹽酸滴定法；pH、EC：將樣品與超純水按1：10的質(zhì)量體積比混合均勻，中速振蕩2h，取上清液，分別用pH計(jì)（PHS-3C，上海雷磁）和電導(dǎo)率測(cè)定儀（DDS-307A，上海雷磁）測(cè)定pH值和EC值；總氮、硝態(tài)氮、銨態(tài)氮：參考《有機(jī)肥料》（NYIT 525-2021）和《肥料硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、酰胺態(tài)氮含量的測(cè)定》（NY/T 1116-2014）。

GI的測(cè)定。采用蘿卜種子，參考NY/T 525-2021標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定，具體操作：取4.5 g樣品，加入45 mL超純水混合均勻，中速振蕩th，靜置30 min，移取上清液10 mL于培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿內(nèi)放1張定性濾紙，在濾紙上均勻放置10顆蘿卜種子，蓋上培養(yǎng)皿蓋，25℃避光培養(yǎng)48h，統(tǒng)計(jì)發(fā)芽的種子數(shù)，并測(cè)量主根長(zhǎng)，同時(shí)用超純水做空白對(duì)照。GI=樣品發(fā)芽率X樣品平均根長(zhǎng)／（空白發(fā)芽率X空白平均根長(zhǎng)）％100%。

微生物群落組成的測(cè)定。采用16S rRNA基因測(cè)序分析，具體操作：提取樣品微生物的總DNA（試劑盒QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit），對(duì)16S rRNA基因的V3-V4區(qū)用引物338F 5’-ACTCCTACGGGAG-CCAGCAG -3＇和806R 5＇- GGACTACHVGCGWTC-TAAT-3＇進(jìn)行擴(kuò)增，采用Illumina MiSeq平臺(tái)對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序，利用美吉生物信息分析云平臺(tái)進(jìn)行微生物生物學(xué)信息分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用GraphPadPrism 9.0軟件分析繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 堆肥溫度、pH值和EC值的變化

溫度是堆肥的一個(gè)重要參數(shù)，溫度的變化顯示著堆肥的進(jìn)程。由圖1A可見(jiàn)，對(duì)照組和試驗(yàn)組在堆肥過(guò)程中的發(fā)酵溫度先升高后降低，依據(jù)堆肥溫度的變化可將堆肥過(guò)程分為升溫期（0-2 d）、高溫期（3-5d）、降溫腐熟期（6-28 d）。其中T1和T3組升溫較快，經(jīng)過(guò)24 h堆肥，溫度即上升至62.9℃和53.4℃，而T2和T4組經(jīng)過(guò)48 h堆肥溫度上升至55.4℃和43.2℃。在腐熟期T1、T2和T3組溫度降至40℃以下，T4組溫度在40℃左右。

由圖IB可見(jiàn)，堆肥初始期，各組的pH值范圍為6.3-7.3，在升溫期，T1和T3組的pH值迅速升高，T2組的pH值先緩慢升高而后再迅速升高，T4組的pH值先降低而后再迅速升高，至第3天各組pH值接近9.1，隨后變化趨勢(shì)相似，末期在小范圍波動(dòng)。整個(gè)堆肥過(guò)程中pH值的變化符合堆肥發(fā)酵的一般規(guī)律，腐熟的有機(jī)肥一般呈堿性。

EC反映堆肥有機(jī)離子和無(wú)機(jī)離子濃度的大小。圖1C顯示，堆肥初始期T1組的EC值為4.8 mS·cm-1，高于試驗(yàn)組的EC值，試驗(yàn)組EC值高低依次為T4＞T3＞T2組。堆肥期間T1與T3組的EC值先升高后逐漸降低，T2與T4組的EC值先降低后增加再逐漸下降。至堆肥期結(jié)束，各組的EC值均降至約2.0 mS·cm-1。

2.2 氨氣排放量的變化

隨著堆肥的進(jìn)行，對(duì)照組和試驗(yàn)組氨氣日排放量均表現(xiàn)為先升高再降低的變化過(guò)程（圖2A）。在堆肥升溫期，T2、T3和T4組氨氣日排放量均低于T1組，在堆肥第4-5天各組氨氣日排放量達(dá)到高峰，其中T3組最高，為1.81 mg·kg-1，其余T2、T4和T1組氨氣日排放量均高于1.48 mg·kg-1。從降溫期第6天開(kāi)始各組氨氣日排放量均呈下降趨勢(shì)，至堆肥期結(jié)束（第28天）已低于0.13 mg·kg-1。圖2B顯示，各組氨氣的周排放量呈依次降低趨勢(shì)，氨氣排放主要集中在第1周和第2周，第1周氨氣排放量T2、T3和T4組均低于T1組，各組兩周累計(jì)的排放量均超過(guò)總排放量的75%。由圖2C可見(jiàn)，在整個(gè)堆肥期內(nèi)，各組氨氣總排放量呈上升趨勢(shì)。在堆肥初期至堆肥第14天，氨氣總排放量快速增加，而在堆肥后半段（14-28 d），氨氣總排放量增加緩慢，至堆肥期結(jié)束各組氨氣總排放量由高到低的順序依次為T2組（15.29 mg·kg-1）＞T1組（15.19 mg·kg-1）＞T4組（15.05mg·kg-1）＞T3組（14.43 mg·kg-1）。

2.3 總氮、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮的含量變化

各組的總氮、銨態(tài)氮和硝態(tài)氮變化趨勢(shì)見(jiàn)圖3。在堆肥初始期，總氮含量為T2組＞TI組＞T3組＞T4組，而后T4組總氮含量先升高（1 d）再降低，T1和T2組先快速降低（3 d）而后再緩慢降低，T3組一直呈緩慢降低趨勢(shì)（圖3A）。初始期銨態(tài)氮含量以T1組（1.40%）最高，遠(yuǎn)高于T2、T3和T4組。T1組第1天銨態(tài)氮含量快速降低，試驗(yàn)組銨態(tài)氮含量均先增加再降低（圖3B）。綜合圖3A、圖3B可見(jiàn)，高溫期后各組總氮和銨態(tài)氮含量趨于一致，并保持至堆肥結(jié)束。硝態(tài)氮含量在堆肥初始期表現(xiàn)為T2組＞T1組＞T4組＞T3組，在堆肥升溫期T2、T3和T4組硝態(tài)氮含量上升，而T1組硝態(tài)氮含量急劇下降，在高溫期，T3和T4組硝態(tài)氮含量高于T2和T1組，在降溫期各組硝態(tài)氮含量呈波動(dòng)性降低趨勢(shì)（圖3C）。

2.4 GI的變化

GI常用來(lái)反映有機(jī)肥的腐熟度，只有達(dá)到腐熟標(biāo)準(zhǔn)的有機(jī)肥才能施用于田間，供植物利用。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)CI＜50%時(shí)認(rèn)為堆肥未腐熟；農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《有機(jī)肥料》（NY/T 525-2021）中要求GI≥70%。由圖4可見(jiàn)在堆肥初始升溫期，各組的GI接近0，隨堆肥的進(jìn)行，各組的GI呈增高趨勢(shì)，在堆肥的第21天，各組CI出現(xiàn)較大差異，其中T4組GI接近70≥，高于其余3組。至堆肥期結(jié)束，T3和T4組GI分別為99.4%和87.1%，高于T1（57.7%）和T2（50.6%）組，已達(dá)到有機(jī)肥標(biāo)準(zhǔn)。

2.5 微生物生物信息分析

2.5.1 微生物細(xì)菌分類統(tǒng)計(jì)及α多樣性分析

所有樣品經(jīng)測(cè)序獲得的數(shù)據(jù)在各分類水平上的結(jié)果為22個(gè)門、41個(gè)綱、113個(gè)目、213個(gè)科、402個(gè)屬、604個(gè)種、1 004個(gè)操作分類單元（OTU）。圖5顯示在OTU水平上4個(gè)組共有631個(gè)共同OTU，各組特有的OTU數(shù)量分別是T1組24個(gè)、T2組8個(gè)、T3組17個(gè)、T4組7個(gè)。

Chao指數(shù)常用來(lái)估計(jì)物種的總數(shù)，其數(shù)值越大，物種的數(shù)量越多。由OTU水平上Chao指數(shù)圖（圖6）可見(jiàn)，在堆肥初始期，T1組的Chao指數(shù)高于T2、T3和T4組，在堆肥過(guò)程中各組的Chao指數(shù)均先下降再逐漸升高，表明菌群的物種數(shù)量與堆肥進(jìn)程相關(guān)。到堆肥結(jié)束，各組的Chao指數(shù)大小依次為T1組＞T2組＞T3組＞T4組。

2.5.2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

如圖7所示，經(jīng)過(guò)28 d的堆肥發(fā)酵，對(duì)照組和試驗(yàn)組的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在門和屬水平的組成均發(fā)生了改變。圖7A顯示，門水平上厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidota）、放線菌門（Actinobacteriota）和變形菌門（Proteobacteria）為堆肥初始期的主要菌門，其中厚壁菌門占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。隨堆肥的進(jìn)行，厚壁菌門豐度降低，至堆肥結(jié)束其在T1、T2、T3、T4組的豐度分別為44.12%、55.07%、61.01%、48.03%，而擬桿菌門、放線菌門和變形菌門的豐度升高。此外，芽單胞菌門（Gemmatimonadota）和黏球菌門（Myxococcota）的豐度也增加，上述6種菌門在T1、T2、T3、T4組的總豐度分別達(dá)到94.84%、96.59%、92.89%、97.47%。

圖7B顯示，屬水平上乳桿菌屬（LactobaciZlus）、羅姆布茨菌屬（Romboutsia）和魏斯氏菌屬（Weissella）是試驗(yàn)組堆肥初始期的優(yōu)勢(shì)菌，如乳桿菌屬在T2、T3和T4組的豐度分別為30.79%、16.80%和18.31%，高于T1組（10.18%）。氣球菌屬（Aerococcus）是T1組的優(yōu)勢(shì)菌屬，其豐度為40.30%，高于T2組（7.10%）、T3組（9.07%）和T4組（22.61%）。隨堆肥進(jìn)行，各組的優(yōu)勢(shì)菌屬出現(xiàn)變化，如乳桿菌屬和氣球菌屬在升溫期至高溫期的豐度均快速降低。尿素芽孢桿菌屬（Ureibacil-lus）的豐度在T1和T3組第1天急劇上升為35.16%和37.21%，遠(yuǎn)高于T2和T4組。一些菌屬在堆肥高溫期后出現(xiàn)，如norank_f_Bacillaceae、芽孢桿菌屬（Bacil-lus）、八疊球菌屬（Tepidimicrobium）、假纖細(xì)芽孢桿菌屬（Pseudogracilibacillus）、unclassified_f_Bacillaceae、大洋芽孢桿菌屬（Oceanobacillus）、雙芽孢桿菌屬（Am-phibacillus）等，均呈現(xiàn)先增加后降低規(guī)律。還有一些菌如漠河桿菌屬（Moheibacter）、嗜熱桿菌屬（Caldi-coprobacter）、norank-f-Longimicrobiaceae菌屬等在堆肥中后期出現(xiàn)。腸球菌屬（Enterococcus）豐度相對(duì)較低，隨堆肥進(jìn)行豐度下降。堆肥結(jié)束各組低比例菌群合并后的占比上升，T1、T2、T3、T4組分別達(dá)到5 2.65%、41.23%、56.33%、47.31%。

圖7C為發(fā)酵飼料中的糞腸球菌（E.faecalis）在堆肥中的變化情況。在堆肥初始期，各組糞腸球菌相對(duì)豐度高低依次為T4組＞T1組＞T2組＞T3組。在升溫期T1組豐度急劇降低，T2和T3組豐度增加，T4組豐度略降，在高溫期除T3組豐度降低外，其余組豐度增加，而在降溫期各組豐度均降低，在堆肥末期未檢測(cè)到糞腸球菌。除糞腸球菌外，其余兩種細(xì)菌丁酸梭菌（Clostridium butyricum）和凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus co-agulans）在堆肥初始期未檢測(cè)到，說(shuō)明其在蛋雞腸道內(nèi)與其他微生物產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，未成為雞糞中的優(yōu)勢(shì)菌。

2.5.3 環(huán)境因子與微生物群落的關(guān)系分析

從圖8環(huán)境因子與微生物群落（門水平）的相關(guān)性關(guān)系可見(jiàn)，GI、總氮、硝態(tài)氮、EC、氨氣與多種微生物的關(guān)系較密切，而pH和銨態(tài)氮與單一的微生物的關(guān)系較密切。厚壁菌門和互養(yǎng)菌門（Synergistota）與GI呈顯著負(fù)相關(guān)（P≤0．05），而厚壁菌門與硝態(tài)氮（0.01＜P≤0.05）、EC（0.001＜P≤0.01）和氨氣（P≤0.001）呈顯著正相關(guān)，互養(yǎng)菌門與總氮和EC呈顯著正相關(guān)（0.01＜P≤0.05）。Patescibacteria是唯一與pH呈顯著負(fù)相關(guān)的菌門。奇球菌門（Deinococcota）、變形菌門、芽單胞菌門、黏球菌門與總氮、硝態(tài)氮、氨氣和EC呈顯著負(fù)相關(guān)（P≤0.001），而與GI呈正相關(guān)（0．01＜P≤0.05或0.001＜P≤0.01）。脫硫桿菌門（Desulfobacte-rota）是唯一與銨態(tài)氮呈顯著負(fù)相關(guān)的菌門（0.001＜P≤0.01）。擬桿菌門、Sumerlaeota、綠彎菌門（Chloroflexi）與總氮、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮和EC呈顯著負(fù)相關(guān)（0．01＜P≤0.05或0.001＜P≤0.01或P≤0.001），放線菌門、unclassi-fied-k-norank-d-Bacteria與EC和氨氣呈顯著負(fù)相關(guān)（0.001＜P≤0.01或P≤0.001）。隱桿菌門（Abditibacteri-ota）、浮霉菌門（Planctomycetota）、蛭弧菌門（Bdellovi-brionota）與硝態(tài)氮呈顯著負(fù)相關(guān)（0.01＜P≤0.05），與EC和氨氣呈極顯著負(fù)相關(guān)（0.001＜P≤0.01或P≤0.001）。鹽厭氧菌門（Halanaerobiaeota）、纖維桿菌門（Fibrobac-terota）與EC呈顯著負(fù)相關(guān)（0.01＜P≤0.05），藍(lán)藻門（Cyanobacteria）與硝態(tài)氮呈顯著負(fù)相關(guān)（0.01＜P≤0.05）。

2.5.4 微生物細(xì)菌群落功能預(yù)測(cè)分析

利用PICRUSt軟件對(duì)堆肥過(guò)程中微生物群落進(jìn)行COG功能分類預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖9所示。微生物群落COG功能主要集中在能量生產(chǎn)和轉(zhuǎn)化、物質(zhì)（氨基酸、碳水化合物、核苷酸、輔酶、脂質(zhì)、無(wú)機(jī)離子等）的運(yùn)輸和代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制、遺傳物質(zhì)的翻譯修飾等方面。其中氨基酸和碳水化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝是微生物功能集中度高的代謝途徑。氨基酸的代謝途徑在堆肥高溫期第3天達(dá)到峰值，T1、T2、T3、T4組的豐度分別為9.22%、9.41%、9.22%和9.45%，隨后在堆肥降溫期略有降低。碳水化合物代謝途徑在T1-T4組的初始豐度分別為8.94%、8.75%、7.94%和8.83%，且隨堆肥進(jìn)行逐漸降低，至堆肥末期各組分別減少了3 .07%、2.27%、0.82%、2.72%，T3組減少的比例最低。堆肥發(fā)酵的實(shí)質(zhì)是圍繞氮、碳元素的轉(zhuǎn)化進(jìn)行，隨堆肥發(fā)酵期的變化，相應(yīng)的微生物功能集中的豐度也發(fā)生變化。堆肥初始期信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制在對(duì)照組的豐度為4.07%，在試驗(yàn)組（T2、T3、T4組）的豐度分別為4.54%、4.83%、4.69%，均高于對(duì)照組，隨堆肥的進(jìn)行，各組的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制進(jìn)一步富集，試驗(yàn)組隨發(fā)酵飼料添加量的增加，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制豐度增加，至堆肥末期T4組豐度達(dá)6.74%。此外，能量的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化途徑在堆肥第1天下降，而從第3天起至堆肥結(jié)束呈持續(xù)增加狀態(tài)，表明能量的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化伴隨堆肥的整個(gè)過(guò)程。

3 討論

3.1 發(fā)酵飼料對(duì)雞糞堆肥腐熟度的影響

發(fā)酵飼料是一類含有活菌的生物飼料，在畜禽生產(chǎn)上已有較多應(yīng)用。家禽糞便中含有較多的氮、鉀等物質(zhì)，將其進(jìn)行堆肥腐熟轉(zhuǎn)化為有機(jī)肥后可供植物吸收利用。未腐熟的堆肥具有植物危害性和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)性，與堆肥腐熟度相關(guān)的指標(biāo)包括pH、EC和GI等。本試驗(yàn)中各組的雞糞初始pH值在7.0左右，經(jīng)過(guò)堆肥升溫期，pH快速升高至9.1，呈堿性，表明雞糞堆體中的有機(jī)氮轉(zhuǎn)為了銨態(tài)氮。此外，本試驗(yàn)中pH值的快速提高與堆肥升溫速率同步，這與姜新有等的研究得到的pH值的變化與堆肥溫度有關(guān)的結(jié)論相似。EC值反映腐熟糞肥對(duì)植物生長(zhǎng)抑制或生物毒性作用的程度，有研究表明糞肥EC高于4mS·cm-1不利于植物生長(zhǎng)，而本研究中各組EC值均低于2.1 mS·cm-1，表明其對(duì)植物生長(zhǎng)無(wú)抑制作用。GI直接反映堆肥腐熟度，本試驗(yàn)中各組CI均高于50%，且5.0%和10.0%發(fā)酵飼料組的雞糞經(jīng)過(guò)28 d堆肥腐熟，GI均遠(yuǎn)高于70%，達(dá)到有機(jī)肥標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明添加5.0%或10.0%的發(fā)酵飼料飼喂蛋雞可以促進(jìn)雞糞堆肥腐熟。盛凱清等報(bào)道飼喂發(fā)酵飼料的豬糞易腐熟，其堆肥過(guò)程中纖維素酶、中性蛋白酶、脲酶等活性變化與豬糞添加外源菌劑堆肥發(fā)酵的酶活性變化類似，說(shuō)明發(fā)酵飼料影響豬糞有機(jī)肥的生產(chǎn)。本試驗(yàn)中飼喂發(fā)酵飼料促進(jìn)雞糞堆肥GI升高的機(jī)制是否與堆肥時(shí)添加外源菌劑促進(jìn)GI升高的機(jī)制相似還有待于進(jìn)一步研究，如陳倩倩等報(bào)道在羊糞與雞糞混合堆肥中，添加嗜熱復(fù)合菌使堆肥的GI升高，促進(jìn)堆肥腐熟。

3.2 發(fā)酵飼料對(duì)雞糞堆肥過(guò)程中氨氣排放的影響

氮元素是有機(jī)肥的主要營(yíng)養(yǎng)元素之一，畜禽糞便中氮元素主要以有機(jī)氮的形式存在。在堆肥過(guò)程中氮的轉(zhuǎn)化較為復(fù)雜，主要通過(guò)礦化、揮發(fā)、硝化、固定化和反硝化作用進(jìn)行轉(zhuǎn)化。與家畜糞便相比，雞糞中的氮含量較高，在堆肥過(guò)程中總氮的損失高達(dá)31.8%，牛羊糞總氮損失約為22.5%，豬糞便總氮損失為28.6%。堆肥氮損失主要來(lái)自氨氣、一氧化二氮、氮?dú)夂蚇Ox化合物的氣體排放，其中氨氣排放占主導(dǎo)地位，可占到總氮損失的68.2%。氮損失不僅帶來(lái)肥料價(jià)值的損失，同時(shí)其難聞的氣味還帶來(lái)環(huán)境和健康問(wèn)題。影響氨氣產(chǎn)生的因素包括初始銨態(tài)氮濃度、溫度等。堆肥初始期的低銨態(tài)氮濃度使初始投入的銨態(tài)氮減少，限制氨氣的產(chǎn)生，而在堆肥過(guò)程中，氨氣的排放集中在堆肥高溫期，降低高溫期氨氣的揮發(fā)是提高糞肥中氮含量的關(guān)鍵因素。本試驗(yàn)中氨氣主要在堆肥升溫期和高溫期產(chǎn)生，試驗(yàn)組在此階段的氨氣總排放量低于對(duì)照組，這可能與堆肥初始期試驗(yàn)組的銨態(tài)氮含量均低于對(duì)照組有關(guān)。本試驗(yàn)的結(jié)果表明蛋雞飼喂含發(fā)酵飼料的日糧，可抑制雞糞在堆肥前期和中期氨氣的揮發(fā)，降低氮損失，有助于堆肥氮元素的保留，這與劉閏等報(bào)道的蛋雞飼喂菌酶協(xié)同發(fā)酵飼料可顯著降低蛋雞糞便氨氣產(chǎn)生的結(jié)果有相似之處。

3.3 發(fā)酵飼料對(duì)雞糞堆肥微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

發(fā)酵飼料作為含有活菌的生物飼料，不僅改善動(dòng)物腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，同時(shí)也影響動(dòng)物腸道微生物群落構(gòu)成。畜禽糞便中的微生物主要源自腸道微生物，隨堆肥進(jìn)行，微生物群落組成也發(fā)生相應(yīng)的變化。本試驗(yàn)中飼喂發(fā)酵飼料的蛋雞糞便在堆肥過(guò)程中，其細(xì)菌群落多樣性均低于對(duì)照組，表明發(fā)酵飼料改變蛋雞糞便的微生物群落構(gòu)成，且對(duì)微生物群落多樣性的影響貫穿堆肥過(guò)程。畜禽糞便堆肥腐熟的實(shí)質(zhì)是糞便中微生物分解利用有機(jī)質(zhì)的結(jié)果，糞便中微生物群落的變化對(duì)糞肥的堆肥轉(zhuǎn)化有直接的影響作用。本試驗(yàn)中厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和變形菌門是蛋雞糞便的主要菌門，且隨堆肥進(jìn)行厚壁菌門的豐度下降，而其余3種菌門的豐度則增加，這與前人的一些研究結(jié)果相似，如于靜等岡、王秀紅等報(bào)道指出雞糞好氧堆肥中厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、變形菌門是主要的菌門。堆肥過(guò)程中細(xì)菌的豐度變化與其結(jié)構(gòu)特征相關(guān)，厚壁菌門的細(xì)菌能夠產(chǎn)生耐熱芽孢，因而在堆肥升溫期和高溫期的豐度高，且厚壁菌門的細(xì)菌對(duì)纖維素、多糖等有機(jī)物的降解有促進(jìn)作用，與氮的轉(zhuǎn)化和氨氣的揮發(fā)關(guān)系密切。陶興玲等研究發(fā)現(xiàn)厚壁菌門對(duì)有機(jī)質(zhì)降解的影響最強(qiáng)。Wang等在蛋雞糞好氧堆肥中添加嗜熱芽孢桿菌改變了堆肥升溫和高溫期的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，增加了乳酸菌和硝化菌的相對(duì)豐度，縮短高溫期，降低pH值，促進(jìn)了硝化作用，降低了氨氣的揮發(fā)。本試驗(yàn)中飼喂發(fā)酵飼料的蛋雞糞便中厚壁菌門的乳桿菌屬和魏斯氏菌屬的豐度在堆肥初始期均高于對(duì)照組，這可能與發(fā)酵飼料中添加的丁酸梭菌和凝結(jié)芽孢桿菌有關(guān)。凝結(jié)芽孢桿菌屬兼性厭氧菌，在蛋雞腸道中消耗游離氧，利于厭氧微生物乳酸菌的生長(zhǎng)，而丁酸梭菌為厭氧菌，在腸道內(nèi)可抑制有害菌如大腸桿菌的生長(zhǎng)等，促進(jìn)有益菌如乳酸菌、雙歧桿菌等的增殖，促進(jìn)纖維素等有機(jī)物降解和堆肥腐熟。本試驗(yàn)飼喂的發(fā)酵飼料中的糞腸球菌在蛋雞腸道內(nèi)體現(xiàn)出量的優(yōu)勢(shì)，且在蛋雞糞便中以10.0%添加量的相對(duì)豐度最高，在堆肥過(guò)程中保持優(yōu)勢(shì)至堆肥后期。堆肥過(guò)程中主要菌群的豐度變化也反映了堆肥反應(yīng)的連續(xù)性和持續(xù)性。

參與堆肥的微生物除細(xì)菌外，還包括真菌和放線菌，其中雞糞堆肥以細(xì)菌占主導(dǎo)地位，基于本試驗(yàn)主要研究細(xì)菌的組成變化情況，未探究真菌和放線菌的組成變化，故未對(duì)發(fā)酵飼料中包含的釀酒酵母真菌的變化情況做分析。

3.4 發(fā)酵飼料對(duì)環(huán)境因子與微生物群落的關(guān)系影響

堆肥是通過(guò)微生物的代謝作用轉(zhuǎn)化糞肥中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其活動(dòng)受到堆肥環(huán)境因子（溫度、pH、氨氣濃度等）的影響，微生物的優(yōu)勢(shì)菌群發(fā)生相應(yīng)改變，而優(yōu)勢(shì)菌群的代謝活動(dòng)同時(shí)也對(duì)環(huán)境因子產(chǎn)生影響。本試驗(yàn)中厚壁菌門在堆肥升溫期和高溫期均占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，代謝活躍，分解有機(jī)物，產(chǎn)生大量的氨氣，因而與氨氣的產(chǎn)量呈極顯著正相關(guān)，而隨著降溫期的延長(zhǎng)厚壁菌門豐度下降，氨氣的產(chǎn)量降低，大部分的有機(jī)質(zhì)已降解，對(duì)植物的毒性也降低，因而厚壁菌門與GI值呈顯著負(fù)相關(guān)。于靜等研究認(rèn)為溫度和pH是堆肥過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)改變的主要驅(qū)動(dòng)因子。本試驗(yàn)中pH僅與Patescibacteria菌門呈顯著負(fù)相關(guān)，而硝態(tài)氮、氨氣產(chǎn)量、EC與多數(shù)菌門呈顯著負(fù)相關(guān)，GI則與多數(shù)菌門呈顯著正相關(guān)，表明這些環(huán)境因子與堆肥中細(xì)菌菌門的關(guān)系更密切。

3.5 發(fā)酵飼料對(duì)微生物細(xì)菌功能預(yù)測(cè)的影響

16S rRNA基因序列測(cè)序分析得到微生物細(xì)菌物種組成，通過(guò)PICRUSt軟件結(jié)合已知微生物基因組信息，預(yù)測(cè)微生物的功能，與宏基因組測(cè)序結(jié)果相比，其細(xì)菌功能預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性較高，目前PICRUSt較多應(yīng)用于微生物細(xì)菌和古菌的功能預(yù)測(cè)研究。本研究中PICRUSt軟件預(yù)測(cè)的細(xì)菌功能主要集中在物質(zhì)的代謝轉(zhuǎn)化上，其中氨基酸和碳水化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝豐度相對(duì)較高，在高溫期氨基酸的代謝豐度達(dá)到頂點(diǎn)，這與堆肥的進(jìn)程相吻合，高溫期氮代謝活躍，有機(jī)氮在微生物的氨化作用下轉(zhuǎn)化為無(wú)機(jī)態(tài)的銨態(tài)氮。崔鵬等利用PICRUSt2軟件預(yù)測(cè)超高溫和常溫堆肥微生物群落的功能，發(fā)現(xiàn)兩種堆肥方式的微生物功能代謝通路都包括氨基酸類物質(zhì)代謝、碳水化合物代謝、能量代謝和遺傳信息復(fù)制、翻譯等。本試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)發(fā)酵飼料促進(jìn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的富集。

4 結(jié)論

（1）綜合本試驗(yàn)結(jié)果，在蛋雞日糧中添加5.0%和10.0%的發(fā)酵飼料，有利于蛋雞糞便的堆肥腐熟，經(jīng)過(guò)28 d堆肥，種子發(fā)芽指數(shù)分別為99.4%和87.1%，達(dá)到有機(jī)肥堆肥標(biāo)準(zhǔn)。添加5.0%發(fā)酵飼料時(shí)蛋雞糞便堆肥的氨氣總排放量最低，為14.43 mg·kg-1。

（2）添加發(fā)酵飼料降低蛋雞糞便的細(xì)菌多樣性，厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門和變形菌門是蛋雞糞便的主要菌門，隨堆肥進(jìn)行，厚壁菌門的豐度降低，其余菌門的豐度升高。添加發(fā)酵飼料提高蛋雞糞便中乳桿菌屬的相對(duì)豐度。堆肥環(huán)境因子硝態(tài)氮、氨氣、電導(dǎo)率與厚壁菌門呈顯著負(fù)相關(guān)，而與擬桿菌門、變微生物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的富集。

（責(zé)任編輯：李丹）

基金項(xiàng)目：江蘇省重點(diǎn)研發(fā)（現(xiàn)代農(nóng)業(yè)）計(jì)劃項(xiàng)目（BE2022379）；江蘇現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（JATS[2023]069）；常州市科技項(xiàng)目（CE20222025）；山東省科技型中小企業(yè)創(chuàng)新能力提升工程項(xiàng)目（2022TSGC1224）；濰坊市科技型中小企業(yè)創(chuàng)新能力提升工程計(jì)劃項(xiàng)目（2022TS1122）