高丹草在低濃度銅-鎘-菲復(fù)合脅迫下的生長及響應(yīng)特性

摘要：針對(duì)焦化廠等工礦廢棄地殘留的重金屬-多環(huán)芳烴污染風(fēng)險(xiǎn)高、低成本綠色環(huán)保技術(shù)缺乏等問題，通過田間試驗(yàn)，研究低濃度銅-鎘-菲復(fù)合脅迫下高丹草萌芽率，生物量，銅、鎘累積，菲去除及葉綠素含量的變化規(guī)律，探索其生長及污染物遷移累積等響應(yīng)特性。結(jié)果表明：10 mg·kg-1菲和100 mg·kg-1銅復(fù)合脅迫可促進(jìn)高丹草生長，莖葉和根系生物量分別增加14.7%和8.1%，5mg．kg、鎘抑制了高丹草生長。銅、鎘主要累積在高丹草根部，菲-銅復(fù)合脅迫可促進(jìn)銅的遷移，且提高菲去除率40.6%，菲-鎘復(fù)合則阻礙了鎘的遷移。低濃度銅和菲可刺激葉綠素。合成，而銅、鎘復(fù)合脅迫造成葉綠素b含量下降。相關(guān)性分析證實(shí)高丹草生長、污染物遷移及葉綠素合成之間具有較強(qiáng)的相關(guān)性。研究表明，高丹草在低濃度銅-鎘-菲復(fù)合脅迫下可以生長，并在重金屬遷移、有機(jī)物代謝及葉綠素變化等過程中呈現(xiàn)脅迫響應(yīng)。

關(guān)鍵詞：高丹草；菲；銅；鎘；葉綠素

中圖分類號(hào)：X173；X53 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1672-2043（2024）08-1753-07 doi：10.11654/jaes.2023-1020

2014年我國土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)顯示，全國土壤環(huán)境狀況不容樂觀，重金屬污染物中鎘和銅的點(diǎn)位超標(biāo)率分別達(dá)7.0%和2.1%，有機(jī)物中多環(huán)芳烴的點(diǎn)位超標(biāo)率達(dá)1.4%。同年在全國30個(gè)省市開展的礦山地質(zhì)環(huán)境監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，山西省礦山采場(chǎng)達(dá)9.5萬hm2，居全國礦山開發(fā)占地總量的20.74%。山西省多地煤焦化產(chǎn)業(yè)的發(fā)展產(chǎn)生了大量退役工業(yè)廢棄地。隨著新常態(tài)下產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)，山西省工業(yè)廢棄地的修復(fù)工作已持續(xù)多年，部分地區(qū)自然生態(tài)基底初步恢復(fù)，并取得了一定的經(jīng)濟(jì)和環(huán)境效益。盡管如此，修復(fù)后的土地仍殘留少量污染物，導(dǎo)致部分土地資源的浪費(fèi)。歐靈芝等對(duì)高砷煤礦周邊旱作土壤重金屬污染評(píng)價(jià)的研究結(jié)果表明，鎘和銅處于輕度污染水平，但作物對(duì)其吸附能力較強(qiáng)，可能引起健康風(fēng)險(xiǎn)。由于多環(huán)芳烴和重金屬排放的共同來源，兩者往往形成復(fù)合污染，加劇修復(fù)難度。焦化廢棄地中多環(huán)芳烴和重金屬復(fù)合污染問題，更是受到了廣泛關(guān)注。

植物原位修復(fù)相對(duì)于其他物理、化學(xué)修復(fù)技術(shù)綠色環(huán)保且成本較低，同時(shí)不會(huì)產(chǎn)生二次污染，有利于污染區(qū)的長期生態(tài)恢復(fù)。其中，牧草因具有生長周期短、適應(yīng)能力強(qiáng)、易栽培、可刈割等優(yōu)點(diǎn)，成為修復(fù)植物的潛在選擇。高丹草相比于其他牧草，具銅有產(chǎn)量高、適應(yīng)范圍廣、抗逆性強(qiáng)、動(dòng)物易消化等特性，已作為我國畜牧業(yè)發(fā)展飼料的首選之一。Oh等的研究表明銅對(duì)高丹草的種子萌芽率有一定的影響，且銅易累積在其根系中。先露露等的研究表明鎘可抑制高丹草的光合作用，影響其正常生長。丁俊男等對(duì)土壤菲脅迫下高丹草幼苗葉片的光合作用進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，菲濃度為50 mg·kg-1時(shí)高丹草葉片光合作用所受影響較小，而土壤菲濃度提高至200mg·kg-1會(huì)造成高丹草葉片光合電子傳遞能力受阻。趙穎等研究了污灌區(qū)多環(huán)芳烴-砷復(fù)合污染土壤的植物修復(fù)效果，結(jié)果表明高丹草對(duì)多環(huán)芳烴的降解率超過99.5%，且具有一定的砷富集特性。由于多種重金屬和多環(huán)芳烴共存土壤中的植物生長特性及修復(fù)機(jī)理與單一污染土壤存在較大差異，且針對(duì)高丹草在低濃度復(fù)合污染土壤中的研究報(bào)道較少，因此有必要對(duì)其進(jìn)行深入研究。

本試驗(yàn)以高丹草為研究對(duì)象，選擇銅、鎘作為重金屬污染源，菲作為多環(huán)芳烴污染源，通過大田試驗(yàn)，研究在不同組合的銅-鎘-菲低濃度脅迫下，高丹草的生長特性及其對(duì)重金屬累積遷移和菲去除特性，探索高丹草在低濃度復(fù)合污染土壤中的生長響應(yīng)規(guī)律，以期為礦業(yè)廢棄地資源的開發(fā)利用提供有益經(jīng)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

高丹草種子購于太原市晉農(nóng)種子有限公司，供試土壤采自某地農(nóng)田未污染土壤，基本理化性質(zhì)為：pH值7.84，堿解氮60.93 mg·kg-1，速效鉀126.57 mg·kg-1，速效磷2.05 mg·kg-1，有機(jī)質(zhì)3.73 g·kg-1，Cu25.63 mg·kg-1， Cd 0.532 mg·kg-1。

乙醇、無水硫酸鈉、甲苯、尿素、苯酚、氫氧化鈉、次氯酸鈉、氯化鎘、硫酸銅等試劑均為分析純，菲（純度大于98％）購于西亞試劑（成都）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 污染物濃度選擇及污染土樣制備

依據(jù)我國《土壤環(huán)境質(zhì)量農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險(xiǎn)管控標(biāo)準(zhǔn)》（GB 15618-2018）中農(nóng)用地土壤中銅、鎘的污染風(fēng)險(xiǎn)篩選值及管制值，并依據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研，選取菲濃度10 mg·kg-1、銅濃度100 mg·kg-1和鎘濃度5mg·kg-1作為低濃度復(fù)合污染的參考濃度。清潔土壤施入底肥后（氮肥0.30 g·kg-1、磷肥0.2 g·kg-1、鉀肥0.3 g·kg-1），邊噴灑邊攪拌加入污染物母液（2 mL 20mg·mL-1菲、5 mL 20 mg·mL-1鋼和2 mL 10 mg·mL-1鎘），制成所需濃度的污染土樣（10 mg·kg-1菲、100mg·kg-1銅、5 mg·kg-1鎘）備用。

1.2.2 復(fù)合污染條件下高丹草生長及累積遷移特性試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇飽滿的高丹草種子若干，用3%雙氧水浸泡殺菌30 min后反復(fù)沖洗，在蒸餾水中吸脹后播種于裝有80 g污染土壤的培養(yǎng)皿中，每皿放25粒種子，將培養(yǎng)皿置于25℃的光照培養(yǎng)箱培，以清潔土壤為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù)5次。種子露白視為發(fā)芽，每天觀察并統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽率。

從2022年7月26日至9月26日，為期2個(gè)月，通過大田試驗(yàn)來研究復(fù)合污染下高丹草生長及修復(fù)特性。將高丹草種子在生化培養(yǎng)箱中催芽后播種于25cm×15 cm×15 cm的塑料盆中，每盆裝入配制好的污染土壤4 kg，一周后間苗，每盆留20株。塑料盆中立一根PVC管，用于透氣和澆水，保持60％田間持水量。設(shè)置單一菲、菲-銅復(fù)合、菲-鎘復(fù)合以及菲-銅-鎘復(fù)合污染實(shí)驗(yàn)組，以未污染土壤+高丹草作為空白對(duì)照組，以單一銅、單一鎘污染組作為單一重金屬污染的對(duì)照組，分別記為PHE、PHE - Cu、PHE - Cd、PHE-Cu-Cd、CK、Cu、Cd，每個(gè)處理重復(fù)3次。植株生長2個(gè)月后，采集帶回實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行各指標(biāo)的測(cè)定。同時(shí)收集土壤樣本，測(cè)定土壤中銅、鎘及菲的殘留量，用以評(píng)估高丹草對(duì)復(fù)合污染物的累積遷移特性。

1.3 分析測(cè)試方法

（1）干質(zhì)量測(cè)定

植株收獲后，用蒸餾水洗凈、晾干，將根、莖、葉分開，105℃烘箱殺青1h后，置于70℃烘箱烘干至恒質(zhì)量，稱量記為各部分干質(zhì)量。

（2）菲和重金屬濃度測(cè)定

參考Ⅲ784-2016規(guī)定的多環(huán)芳烴提取方法對(duì)土壤樣品中的菲進(jìn)行提取，提取液經(jīng)二氯甲烷—丙酮提取以及二氯甲烷沖洗—正己烷洗脫，濃縮定容到2mL，過0.22 μm孔徑濾膜后采用LC-16型高效液相色譜檢測(cè)。檢測(cè)條件：C18反相柱，甲醇：水=90： 10（V/V），流速為1 mL·min-1，檢測(cè)波長為254 nm，注射量為10 μL，停留時(shí)間為5.6-6.2 min。

采用HNO3-HClO4將0.2 g植物干樣品250℃消解并煮至清亮，定容至50 mL后，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（Nexion 1000，美國PerkinElmer）測(cè)定植物組織中的銅、鎘含量。土壤樣品中的重金屬采用島津AA-6800型原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定。

土壤中污染物的去除率（剛采用公式（1）計(jì)算。

R=（C0-Ct/C0）×100％（1）

式中：C0為污染物初始濃度，mg·kg-1；Ct為試驗(yàn)結(jié)束后土壤中污染物濃度，mg·kg-1。

重金屬在高丹草各組織中的轉(zhuǎn)移系數(shù)（TF）用公式（2）計(jì)算。

TF=M地上部分/M根部（2）

式中：M地上部分、M根部分別表示植物地上部分和根部的重金屬含量，mg。

（3）葉綠素含量測(cè)定

采用乙醇浸提比色法測(cè)定葉綠素含量。取新鮮植物葉片0.2 g，剪成2 mm寬的碎條，加入少量石英砂及8 mL 95%的乙醇避光浸提24 h，研磨沖洗至葉片變白，提取液過濾后將濾液用乙醇定容至25 mL，以95%乙醇為空白，采用UV-26001紫外—可見光分光光度計(jì)測(cè)定波長在665 nm和649 nm處的吸光度。采用Arnon公式計(jì)算葉綠素含量（C葉綠素，mg·g-1）。

Ca=13.95×A665-6.88×A649（3）

Cb=24.96×A649-7.32×A665（4）

C葉綠素=C×VT/m鮮×1000（5）

式中：Ca為葉綠素a的濃度，mg·L-1；Cb為葉綠素b的濃度，mg·L-1;C為葉綠素濃度，mg·L-1；VT為提取液體積，mL；m鮮為樣品鮮質(zhì)量；葉綠素含量以樣品鮮質(zhì)量計(jì)，mg·g-1。

2 結(jié)果與討論

2.1 高丹草在低濃度復(fù)合污染土壤中的生長特性

圖1A為不同脅迫下高丹草的萌芽情況，分析可知，低濃度的菲和銅對(duì)高丹草的萌芽率均有一定影響。與CK組相比，PHE中高丹草的萌芽數(shù)減少2個(gè)，相應(yīng)萌芽率降低了9％，加入100 mg·L-1銅后，PHE-Cu中萌芽率降低至81%。鎘對(duì)高丹草萌芽率的抑制較為顯著，PHE-Cd中萌芽數(shù)降低至13個(gè)，萌芽率較CK組降低了35%。而PHE-Cu-Cd中高丹草萌芽率僅為71%。

圖1B為不同脅迫下高丹草的生物量變化，分析可知，在為期2個(gè)月的生長過程中，高丹草的生長未受到顯著抑制。低濃度菲對(duì)高丹草的生長有一定的促進(jìn)作用。與CK組相比，PHE組中根、莖、葉的干質(zhì)量分別提高了5.8%、6.2%和8.5%。馬麗等的研究表明，低濃度菲具有與植物生長激素（生長素和赤霉素）類似的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，從而可促進(jìn)植物莖葉生長，趙海燕等的研究結(jié)果也表明低濃度菲對(duì)丹參根的生長具有促進(jìn)作用。PHE-Cu對(duì)高丹草生長表現(xiàn)出促進(jìn)作用，尤其對(duì)根系生長作用明顯，生物量較PHE增加了8.1%，這是因?yàn)殂~是植物生長的必需微量元素之一。鎘對(duì)高丹草各部分的生長均表現(xiàn)出抑制作用，PHE-Cd中莖、葉生物量均下降了20%，這可能是因?yàn)殒k導(dǎo)致高丹草根系細(xì)胞質(zhì)膜遭到嚴(yán)重破壞，從而造成生理功能紊亂。由于鎘的抑制作用，PHE-Cu-Cd中高丹草生物量下降了5.5%- 8.2%（P＞0.05）。

2.2 高丹草對(duì)復(fù)合污染物的累積遷移特性

高丹草對(duì)銅的累積情況如圖2A所示，分析可知，銅主要累積在高丹草根部，在CK組的比例可達(dá)74%，這與王佳樂等的研究結(jié)果一致。與CK組相比，銅脅迫造成根部累積量增加了9. 1%，TF系數(shù)為0.3，較CK組降低了13.7%，這可能是因?yàn)橹参飳?duì)銅的吸收促進(jìn)了其從土壤向根部的累積和遷移。相關(guān)研究表明，銅作為植物所必需的微量營養(yǎng)元素，可參與合成植物生理代謝所需的酶和結(jié)構(gòu)蛋白。PHE-Cu中根部銅累積量較其在莖、葉中的累積量降低了19.7%，這可能是由于植物對(duì)銅的吸收促進(jìn)了高丹草根系向莖葉方向的營養(yǎng)輸配。由于鎘阻礙了植物葉綠素、糖及蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致PHE-Cu-Cd處理高丹草的各組織中銅累積量較其他組偏小。

高丹草對(duì)鎘的累積情況如圖2B所示，分析可知，鎘在高丹草中也主要累積在根部（50.0%-70.8%），且各處理對(duì)莖、葉中鎘累積的影響較小。與CK組相比，鎘脅迫造成高丹草各組織中鎘累積量提升，TF為0.64。PHE-Cd組中根部鎘累積量提高了4.2%，但TF下降至0.59。Zhan等的研究表明，菲可與土壤中的H+以共軛體的方式結(jié)合，從而提高土壤pH值，導(dǎo)致土壤鎘活性降低，進(jìn)而使植物對(duì)鎘的遷移轉(zhuǎn)運(yùn)能力降低r2u。PHE-Cu-Cd處理根部鎘累積量降低了16.7%，這與梁瑞等的研究結(jié)果相似，即銅-鎘復(fù)合可能抑制植物對(duì)鎘的遷移。

高丹草生長2個(gè)月后測(cè)定了土壤中菲的去除率，結(jié)果如圖2C所示。PHE中菲的殘留量為1.56 mg·kg-1，PHE-Cu中菲的殘留量為0.93 mg·kg-1，較前者菲的去除率提高了40.6%，這可能與前述菲-銅復(fù)合共同促進(jìn)高丹草的生長及營養(yǎng)遷移密切相關(guān)。而由于鎘抑制了高丹草的生長，削弱了其通過遷移作用去除菲的能力，造成PHE-Cd中菲殘留量較高，為1.57mg·kg-1。PHE-Cu-Cd中菲的殘留量最高，較PHE-Cd高出19.3%，這可能是因?yàn)殂~、鎘互相作用抑制了植物對(duì)菲的遷移轉(zhuǎn)化。

2.3 復(fù)合污染對(duì)高丹草葉綠素含量的影響

葉綠素是光合作用的基礎(chǔ)物質(zhì)，復(fù)合污染對(duì)植物的毒害作用可以通過對(duì)植物葉綠素含量的影響來表征。由圖3分析可知，與CK相比，菲促進(jìn)了高丹草的葉綠素合成，PHE中葉綠素。和葉綠素b的含量分別增加了6.1%和8.3%。楊丹等的研究結(jié)果也表明，低濃度菲會(huì)刺激植物應(yīng)激合成更多葉綠素。PHE-Cu中葉綠素a較CK增加了14.1%，葉綠素b降低了1.7%，這可能是因?yàn)殂~作為葉綠素合成過程中部分酶的催化劑發(fā)揮了積極作用。葉綠素合成量的增加可能是上述菲-銅促進(jìn)高丹草生長的重要原因。PHE-Cd中葉綠素a和葉綠素b較PHE分別降低了16.8%和1.5%，顯然葉綠素。的合成受到了較明顯的抑制。由于葉綠素b主要負(fù)責(zé)收集光能，葉綠素。負(fù)責(zé)將收集到的光能轉(zhuǎn)化為化學(xué)能，由此推斷，鎘可能導(dǎo)致高丹草的光能轉(zhuǎn)化系統(tǒng)受阻，這與先露露等的研究結(jié)果一致?；赑HE-Cu的促進(jìn)作用，PHE-Cu-Cd中葉綠素。受到的抑制有所緩和，較PHE-Cd提高了6.9%，但葉綠素b下降了15.6%。相關(guān)研究表明，葉綠素b是由葉綠素a在葉綠素。加氧酶的催化下合成的，由此可推斷，銅、鎘復(fù)合脅迫可能對(duì)葉綠素。加氧酶的催化過程造成了損傷。葉綠素a/葉綠素b的結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了上述分析，與CK相比，PHE-Cu中葉綠素a/葉綠素b上升與菲和銅的促進(jìn)作用相關(guān)，而PHE-Cd中葉綠素a/葉綠素b下降則與鎘對(duì)葉綠素a的合成抑制密切相關(guān)。

2.4 低濃度復(fù)合污染與高丹草的生長響應(yīng)關(guān)系分析

為判斷各污染物對(duì)高丹草生長是否存在交互影響，采用式（6）計(jì)算高丹草根、莖、葉干質(zhì)量的凈變化量（AM）。ΔM=0表示污染物間無交互作用；ΔM＞0表示各污染物間對(duì)植物毒害拮抗；ΔM＜0表示各污染物間對(duì)植物的毒性協(xié)同。

ΔM=（M1+2+3-MC）-（M1-MC）-（M2-MC）-（M3-MC）（6）

式中：Mc、M1+2+3、M1、M2、 M3分別代表CK、PHE-Cu、PHE-Cd、PHE-Cu-Cd復(fù)合污染及各PHE、Cu、Cd單一污染下植物的干質(zhì)量。

表1為高丹草根、莖、葉在各復(fù)合脅迫條件下的ΔM。由表1可知，菲-銅復(fù)合作用下，高丹草的ΔM＞O，說明菲-銅對(duì)高丹草的毒害表現(xiàn)為拮抗作用。但從2.1節(jié)該脅迫條件下的生物量變化分析可知，根、莖、葉干質(zhì)量均有不同程度的增加，說明該條件下的毒性作用不明顯。菲-鎘復(fù)合對(duì)高丹草的毒害表現(xiàn)為協(xié)同作用（∑ΔM=-8.86），而銅的加入使這種毒害作用有所緩解（∑ΔM=-4.99），尤其表現(xiàn)在對(duì)莖干質(zhì)量的影響上。

采用Spearman相關(guān)矩陣，進(jìn)一步研究了單一及復(fù)合污染情況下的高丹草生物量，菲去除，銅、鎘累積及葉綠素含量等的相關(guān)性。由圖4分析可知，高丹草的生物量與其中的銅累積呈正相關(guān)，并且與葉中的銅累積關(guān)系更為密切，這與銅促進(jìn)高丹草生物量的規(guī)律相吻合。葉中銅累積與莖中銅累積（0．90）較其與根中銅累積（0．70）的相關(guān)性更強(qiáng)，這進(jìn)一步驗(yàn)證了銅對(duì)高丹草的促進(jìn)作用可能歸因于其對(duì)光合作用的促進(jìn)，尤其是對(duì)葉綠素的促進(jìn)作用，這一點(diǎn)可從其葉中銅累積與葉綠素a（0.50）和葉綠素b（0.87）有較高的相關(guān)性得到驗(yàn)證。同樣，與本研究鎘脅迫規(guī)律一致，根中鎘累積對(duì)生物量的增長具有強(qiáng)烈抑制，表現(xiàn)為負(fù)相關(guān)（-0.50-0.30），這可能是因?yàn)殒k較強(qiáng)的抑制毒性導(dǎo)致高丹草根際生態(tài)被破壞，表現(xiàn)為根中鎘累積抑制根干質(zhì)量（-0.50）。此外，根中鎘累積對(duì)葉綠素。（-0.50）的抑制也可從中得到驗(yàn)證。

3 結(jié)論

（1）高丹草在低濃度菲-銅-鎘復(fù)合污染土壤中的生長未受到顯著抑制，且低濃度菲和銅可分別促進(jìn)葉片和根系的生物量增長，鎘對(duì)根系的抑制作用較明顯，但在可控范圍內(nèi)。

（2）銅和鎘主要累積在高丹草根部，且銅和鎘脅迫均有促進(jìn)根系銅、鎘向莖、葉遷移的現(xiàn)象，而菲脅迫導(dǎo)致銅的累積，并使銅從莖、葉向根系遷移。

（3）低濃度菲可促進(jìn)葉綠素的合成，菲-銅復(fù)合進(jìn)一步提高了葉綠素a的含量，菲-鎘復(fù)合使高丹草光能轉(zhuǎn)化系統(tǒng)受阻，抑制葉綠素的合成。

（4）交互影響分析結(jié)果表明，菲-銅對(duì)高丹草的生長表現(xiàn)為拮抗作用，而菲-鎘表現(xiàn)為協(xié)同作用。

基金項(xiàng)目：山西省基礎(chǔ)研究計(jì)劃青年項(xiàng)目（202203021222280）；山西省高?？萍紕?chuàng)新項(xiàng)目（2022L549）